乳康飲含藥血清對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的作用

李湘奇 魏昌然 張 萌 王 瑩 郭桂麗

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)嚴(yán)重威脅女性身心健康，目前每年全球約有170萬(wàn)女性被診斷為乳腺癌，發(fā)生率呈直線上升趨勢(shì)，發(fā)病的年齡亦漸趨年輕化[1]。腫瘤臨床及基礎(chǔ)研究認(rèn)為，乳腺癌作為全身性疾病已被業(yè)內(nèi)醫(yī)學(xué)研究者共識(shí)，以手術(shù)為主的綜合性治療原則，可最大限度改善部分患者的預(yù)后，使無(wú)病生存期延長(zhǎng)，這是不爭(zhēng)的事實(shí)，但任何治療均不能完全阻止乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致乳腺癌患者的死亡。有研究資料顯示，每年約有高達(dá)40%的乳腺癌患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，意味著在我國(guó)每年近10萬(wàn)乳腺癌病例出現(xiàn)新的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移性乳腺癌預(yù)后很差，治療棘手，平均存活時(shí)間只有2年，因此控制乳腺癌的復(fù)方轉(zhuǎn)移是臨床研究亟待解決的問(wèn)題[2]。

中醫(yī)藥治療乳腺癌已經(jīng)有了比較系統(tǒng)的理念，研究表明中醫(yī)藥可以對(duì)機(jī)體整體進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)促進(jìn)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的優(yōu)化和改善，降低乳腺癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移率，從而進(jìn)一步使病死率降低，提高患者的整體生存質(zhì)量[3]。中藥治療乳腺癌的優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)為改變癌毒特性，最大限度的殺滅癌毒，并整體調(diào)控內(nèi)環(huán)境，提高機(jī)體的抗癌能力，從病理上改善瘀滯狀態(tài)，阻斷轉(zhuǎn)移途徑。基本治療理念是以辨證論治為基礎(chǔ)，扶正培本為主，祛邪抗癌為輔，結(jié)合患者的疾病特征綜合治療，扶正培本的理念貫穿于乳腺癌治療的全程。作為乳腺癌綜合治療的重要組成部分，中醫(yī)藥研究已經(jīng)取得了令人矚目的成績(jī)。事實(shí)上乳腺癌轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的生物過(guò)程，由多個(gè)基因參與和調(diào)控，涉及到癌細(xì)胞的脫落、遷移與轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)，其轉(zhuǎn)移的潛能與基因在不同患病個(gè)體腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)程度密切相關(guān)[4]。

已有研究證實(shí)，腫瘤的轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，遷移和侵襲能力增強(qiáng)有密切的關(guān)聯(lián)，中藥及其有效成分抑制腫瘤細(xì)胞遷移侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制主要包括調(diào)節(jié)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，抑制腫瘤遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，抑制腫瘤血管生成，影響腫瘤細(xì)胞的黏附運(yùn)動(dòng)，調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫微環(huán)境[5]。乳腺癌(腫瘤)本身并不致死，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并引起其他器官的病變才是致命性的[6]。因此以各種手段控制乳腺癌細(xì)胞的遷移，降低其惡性侵襲能力，將是阻斷或逆轉(zhuǎn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵之一。筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)，乳康飲以疏肝健脾為基本治法組方，對(duì)乳腺癌及其淋巴轉(zhuǎn)移有顯著的治療作用，乳康飲由黃芪、茯苓、青皮、柴胡、莪術(shù)、薏苡仁組成，基礎(chǔ)研究按照功效拆方后，對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用，各組方部分均能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡[7]。在此研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)探討乳康飲及拆方動(dòng)物含藥血清對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用，能夠進(jìn)一步闡明乳康飲阻斷乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，為復(fù)方中藥治療乳腺癌抑制淋巴轉(zhuǎn)移提供支持依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠，雌性，3月齡，體質(zhì)量250～300g，SPF級(jí)，購(gòu)于山東濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(魯) 20140007。人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2.藥物及試劑:乳康飲由黃芪、茯苓、薏苡仁、柴胡、青皮、莪術(shù)組成，乳康飲按照功效拆方為疏肝理氣組(柴胡、青皮、莪術(shù))，益氣健脾組(黃芪、茯苓、薏苡仁)，將乳康飲及拆方組采用水提醇沉法制劑方法制成口服液劑型，各組藥物終濃度分別為1.08g/ml、0.75g/ml、0.33g/ml。DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)HyClone公司)，胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，Transwell小室(美國(guó)BD公司FALCON REF353097)，DAPI(北京索萊寶科技有限公司C0065)。

3.儀器:超凈工作臺(tái)(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司SW-CJ-1D 型)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo 371型)，熒光倒置顯微鏡(Ti-s Nikon儀器有限公司)，臺(tái)式高速離心機(jī)(鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司TG16G)，-80℃超低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司705型)。

4.含藥血清的制備及鑒定:SPF級(jí)SD大鼠20只，隨機(jī)分為4組，每組5只，分別為空白對(duì)照組、乳康飲組、益氣健脾組、疏肝理氣組，每組動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境后，參照《抗癌藥物研究與實(shí)驗(yàn)技術(shù)》附表“人和動(dòng)物間按體表面積折算表”進(jìn)行換算，計(jì)算出人鼠的等效灌胃劑量，分別予以0.9%NaCl溶液、乳康飲、益氣健脾組、疏肝理氣組藥液，按人鼠的等效劑量灌胃，灌胃液體量均為0.4毫升/(天·只)，連續(xù)給藥15天，末次給藥2h后處死取血，靜置后高速離心，以0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，留取各組含藥血清，置于-80℃分裝凍存?zhèn)溆谩２捎酶咝б合喾ㄨb定乳康飲制劑及拆方組含藥血清中各藥物入血成分：選取青皮的主要成分橙皮苷為代表藥品，吸取乳康飲制劑供試品溶液、橙皮苷對(duì)照品溶液10μl及含藥血清、空白血清供試品溶液20μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。經(jīng)3次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)后，讀取結(jié)果顯示，乳康飲含藥血清中出現(xiàn)了與橙皮苷對(duì)照品、乳康飲制劑原液藥物相同位置的波峰(A)，通過(guò)對(duì)照品譜圖比對(duì)，鑒定為橙皮苷，結(jié)果見(jiàn)圖1。組方中其他藥物鑒定同上。

圖1 空白血清、含藥血清、對(duì)照品及乳康飲制劑高效液相圖譜比較

5.細(xì)胞培養(yǎng):人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株，置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，以37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，長(zhǎng)滿細(xì)胞單層后，用胰酶(1∶1) 進(jìn)行消化傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞供試驗(yàn)用。按照不同分組分別用20%中藥含藥血清和空白大鼠血清(空白對(duì)照組)繼續(xù)培養(yǎng)。

6.劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn):(1)劃痕實(shí)驗(yàn)：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/毫升，接種于24孔板，每孔500μl細(xì)胞懸液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，細(xì)胞的密度達(dá)90%以上時(shí)，用10μl槍頭垂直于細(xì)胞劃痕，PBS沖洗3次，分別加入含20%乳康飲組、益氣健脾組、疏肝理氣組含藥血清的培養(yǎng)基500μl后，在5% CO2培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)48h，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞遷移及劃痕寬度的變化，分別于劃痕后0h和48h兩個(gè)時(shí)點(diǎn)，倒置顯微鏡下拍照，觀察劃痕的愈合狀態(tài)。由于20%乳康飲組、益氣健脾組、疏肝理氣組含藥血清能夠抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，但在干預(yù)24h內(nèi)不明顯，所以觀察時(shí)點(diǎn)選擇0h和48h[7]。(2)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/毫升，上室加入不含血清的細(xì)胞懸液200μl，下室加入20%各組含藥血清的完全培養(yǎng)基500μl，在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，以適量PBS將Transwell小室清洗潔凈，去除上室的細(xì)胞和基質(zhì)膠，4%多聚甲醛固定25min，DAPI染色20min，熒光顯微鏡下拍照，倒置顯微鏡觀察5個(gè)視野，記數(shù)細(xì)胞后取平均值。

結(jié) 果

1.乳康飲及拆方含藥血清對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響:檢測(cè)乳康飲及各拆方組含藥血清對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移的作用，進(jìn)行了劃痕實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳康飲及拆方組含藥血清對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移均有不同程度的影響，在乳康飲及拆方含藥血清作用48h后，各種細(xì)胞劃痕均有不同程度的愈合，空白血清對(duì)照組愈合最佳，乳康飲組及兩組拆方血清均能抑制細(xì)胞的劃痕愈合，細(xì)胞遷移抑制率與空白血清對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，乳康飲全方組抑制細(xì)胞劃痕愈合效果明顯優(yōu)于疏肝理氣、益氣健脾拆方組 (P均<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3、表1。

圖2 乳康飲及拆方含藥血清對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的作用(×40)

圖3 乳康飲及拆方含藥血清對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲及遷移抑制率

2.乳康飲及拆方含藥血清對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲的影響：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳康飲及各拆方組含藥血清均能夠明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲，經(jīng)過(guò)乳康飲及其拆方含藥血清處理MDA-MB-231細(xì)胞后， 細(xì)胞體外侵襲能力明顯降低，侵襲穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞每個(gè)視野平均數(shù)與空白對(duì)照組比較，顯著降低(P<0.01)，乳康飲組效果最為明顯，優(yōu)于益氣健脾拆方組 (P<0.05)，但與疏肝理氣組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表1、圖3、圖4。

表1 乳康飲及拆方含藥血清對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移侵襲能力的影響

與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01;與乳康飲組比較，#P<0.05

圖4 乳康飲及拆方含藥血清對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響(×100)A.空白對(duì)照組；B.乳康飲組；C.疏肝理氣組；D.益氣健脾組

討 論

乳腺癌的早期診斷、早期治療及適時(shí)的預(yù)后判斷是臨床關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一，隨著分子生物學(xué)及免疫治療學(xué)研究的發(fā)展，已認(rèn)識(shí)到乳腺癌發(fā)生、發(fā)展本質(zhì)上是由多種基因變化引起的，細(xì)胞內(nèi)原癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活是誘發(fā)乳腺癌的主要原因。由于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了乳腺癌治療的失敗和患者死亡，乳腺癌轉(zhuǎn)移是由多種基因參與和調(diào)控的復(fù)雜的生物學(xué)行為，各種基因在不同患病個(gè)體腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)差異，決定了不同患者或不同亞型腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能，這種差異嚴(yán)重影響了乳腺癌的治療效果和預(yù)后。

乳腺癌的治療除根治性手術(shù)外，化療、放療、內(nèi)分泌治療及生物靶向治療等方法密切配合，能夠顯著延長(zhǎng)患者的生存期，但藥物治療中的毒性不良反應(yīng)及相關(guān)并發(fā)癥，會(huì)嚴(yán)重地影響到患者的生存質(zhì)量。研究證實(shí)，中醫(yī)藥在緩解乳腺癌手術(shù)的并發(fā)癥及減輕放、化療及內(nèi)分泌治療、生物靶向藥物的毒性不良反應(yīng)，降低復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，提高患者的綜合治療效果及生活質(zhì)量方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[8]。

中醫(yī)藥的文獻(xiàn)雖無(wú)“乳腺癌”的病名，但可見(jiàn) “乳巖”、“乳疳”等類似記載，對(duì)乳腺癌病因病機(jī)認(rèn)識(shí)多責(zé)之于肝脾二經(jīng)，如《格致余論》指出：“憂怒抑郁，脾氣消阻，肝氣橫逆，遂成隱核”?！夺t(yī)宗金鑒》論乳巖：“……皆緣抑郁不舒，或性急多怒，傷損肝脾所致”。認(rèn)為乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與肝脾二傷、邪毒留滯有關(guān)。有研究者綜合整理分析了中醫(yī)藥抗乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移方面的臨床研究成果，系統(tǒng)歸納總結(jié)了諸多醫(yī)家有關(guān)乳腺癌治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的病因病機(jī)，認(rèn)為導(dǎo)致患者乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的決定因素是機(jī)體正氣虛損，歸結(jié)為脾腎虧虛、沖任失調(diào)為乳腺癌發(fā)病之本，氣機(jī)不暢、瘀血痰濁、熱毒內(nèi)蘊(yùn)等為發(fā)病之標(biāo)[9]。皆因正氣虛弱，外邪乘虛內(nèi)侵，內(nèi)外之邪阻塞乳絡(luò)，而致氣血失和，運(yùn)行不暢；或情志不遂，內(nèi)傷臟腑，肝氣郁結(jié)；或飲食不節(jié)，脾胃受損，痰濕內(nèi)傷；臟腑功能失調(diào)，導(dǎo)致氣機(jī)郁結(jié)、瘀血停留、痰濁內(nèi)生，又進(jìn)一步損傷正氣。至于乳腺癌轉(zhuǎn)移的病機(jī)還沒(méi)有形成理論體系，現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)研究也不充分，有研究者通過(guò)總結(jié)臨床經(jīng)驗(yàn)，闡述了“正氣虧虛，余毒未盡”的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，認(rèn)為乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移由“伏邪”、“余毒”而引發(fā)，提出了“余毒旁竄”核心病機(jī)理論[10]。

有研究認(rèn)為“痰毒瘀結(jié)、癌毒內(nèi)生”是乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的核心病機(jī)，而“從化”現(xiàn)象的存在，是導(dǎo)致乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要原因[11]。由此可見(jiàn)，乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是因虛致實(shí) (癌)、因?qū)?(癌)更虛、虛實(shí)夾雜的過(guò)程；正虛邪盛，邪毒走竄旁流，則導(dǎo)致乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。根據(jù)其病機(jī)變化，臨床治療常選用疏肝理氣、化痰散結(jié)、活血祛瘀、清熱解毒諸治法，祛除邪毒以抗癌；以健脾補(bǔ)腎、益氣養(yǎng)血、調(diào)補(bǔ)沖任而扶正固本，扶正治法貫穿整個(gè)治療過(guò)程。扶正藥既增強(qiáng)機(jī)體的抗癌能力，又為袪邪抗癌創(chuàng)造必要條件。因此，扶正固本法對(duì)于協(xié)助乳腺癌手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療以及生物靶向治療等尤其重要，能起到增效減毒，改善患者的自覺(jué)癥狀，緩解穩(wěn)定病情，延長(zhǎng)生存期，提高生存質(zhì)量等作用。臨床采用辨病辨證互參，扶正與祛邪結(jié)合，虛實(shí)主次分清，邪正盛衰慎重權(quán)衡，做到“扶正以祛邪”，“祛邪以扶正”，扶正祛邪并施。所以中醫(yī)藥治療乳腺癌從整體觀念出發(fā)，調(diào)整平衡機(jī)體陰陽(yáng)、氣血、臟腑功能，在乳腺癌的臨床治療具體應(yīng)用中進(jìn)一步系統(tǒng)地觀察，并客觀評(píng)價(jià)，奠定中醫(yī)藥治療乳腺癌的地位。

筆者從乳腺癌的病因病機(jī)入手，采用疏肝健脾為主的治則治法，結(jié)合中藥藥理組方乳康飲，全方以黃芪、茯苓益氣健脾，扶正固本，柴胡、青皮疏肝解郁，調(diào)達(dá)肝氣，莪術(shù)、薏苡仁化痰軟堅(jiān)、活血化瘀，以祛邪治標(biāo)。前期乳康飲及其拆方的研究結(jié)果，全方及各拆方組的含藥血清均能夠顯著抑制三陰性乳腺M(fèi)DA-MB-231細(xì)胞和MDA-MB-435S細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[7,12]。動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，乳康飲能夠能下調(diào)乳腺癌組織淋巴管生成相關(guān)因子VEGF-C、VEGFR-3、Ang-2蛋白水平的表達(dá)，干擾乳腺癌組織的淋巴管生成，降低微淋巴管密度，抑制乳腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移[13,14]。文獻(xiàn)報(bào)道乳康飲組成中的單藥，大多數(shù)對(duì)乳腺癌的治療有肯定的作用，如黃芪注射液在體外對(duì)乳腺癌MCF-7可起到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的作用[15]。莪術(shù)的主要活性成分莪術(shù)醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力亦有較強(qiáng)影響，且具有一定的濃度依賴性，莪術(shù)提取物莪術(shù)石油醚也能抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力，作用機(jī)制可能與上調(diào)細(xì)胞黏附因子E-cadherin有關(guān)[16]。

莪術(shù)二酮能明顯抑制人乳腺癌HCC1937細(xì)胞的遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與通過(guò)下調(diào)MAPK和Akt信號(hào)通路上關(guān)鍵蛋白ERK、JNK、Akt的磷酸化水平，進(jìn)而使MMP-2、MMP-9表達(dá)量下降有關(guān)[17]。柴胡皂苷D也能呈時(shí)間及濃度依賴性地抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，下調(diào)與細(xì)胞黏附、遷移、侵襲相關(guān)基因vimentin和N-cadherin蛋白和mRNA的表達(dá)水平。茯苓的有效成分茯苓三萜可通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路的激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的EMT，進(jìn)一步抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，發(fā)揮抑制乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，乳康飲和拆方為疏肝理氣組和益氣健脾組的含藥血清，均能夠?qū)θ橄侔㎝DA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲發(fā)揮明顯抑制作用，益氣健脾組的抑制作用相對(duì)較弱，乳康飲全方組優(yōu)于疏肝理氣組和益氣健脾組，提示全方配伍后，能夠增強(qiáng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。由于中醫(yī)藥防治乳腺癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是多靶點(diǎn)與多途徑的整合，具有整體觀念的優(yōu)勢(shì)，又有辨證論治的靈活性，所以在以扶正培本為主、祛邪抗癌為輔的綜合治療基本治療理念上，發(fā)揮了中醫(yī)藥辨證論治的優(yōu)勢(shì)，體現(xiàn)了乳腺癌的個(gè)體化治療理念。