基于PI3K/Akt/mTOR通路探討白藜蘆醇改善大鼠化療性卵巢損傷的機制

朱小丹 董若曦 陳 燕 姚馨怡 許文娟 樊伯珍 夏 紅

卵巢儲備減退(diminished ovarian reserve, DOR)指女性卵母細胞的數(shù)量減少和(或)質(zhì)量下降，伴抗苗勒管激素水平降低，竇卵泡數(shù)減少，F(xiàn)SH升高，表現(xiàn)為生育能力下降[1]。近年來，隨著腫瘤癌癥發(fā)病年輕化，化療藥物使用所導致的卵巢儲備低下引起了臨床的關注。對于化療性卵巢損傷的保護，目前臨床使用的各種方法和藥物均存在一定的局限性。白藜蘆醇(resveratrol，RVT)是一種存在于葡萄、花生根莖和多種藥用植物中的1,2-二苯乙烯化合物多酚，有較強大的抗氧化功能，能阻止血小板凝聚，防止人體低密度脂蛋白氧化，清除自由基，并能改善修復卵母細胞損傷，改善卵母細胞質(zhì)量，減輕氧化損傷所致老化和與年齡相關的疾病[2]。筆者所在課題組在前期的實驗中研究證實白藜蘆醇預防性應用對順鉑化療后大鼠卵巢功能有一定的保護作用[3]。本研究擬在前期實驗結果的基礎上，基于PI3K/Akt/mTOR信號通路，探討白藜蘆醇改善大鼠的化療性卵巢損傷的分子機制，以期為臨床應用大劑量的化療藥物后所導致的卵巢儲備減退，提供有效的保護方法和科學依據(jù)。

材料與方法

1.材料來源:實驗動物：清潔級8周齡雌性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～200g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院實驗室動物中心。實驗室清潔級，室溫20～25℃，相對濕度45%～55%。喂食無特殊病原體(SPF)級鼠飼料及凈化水，每天光照12h，入籠1周后，每天按時行陰道涂片，顯微鏡下觀察動情周期，選擇有正常動情周期的30只大鼠入組實驗。

2．實驗試劑：順鉑凍干粉購自山東齊魯制藥有限公司；白藜蘆醇購自上海祥弘生物科技有限公司；TUNEL細胞凋亡試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR抗體均購自美國 Cell Signaling Technology(CST)公司。BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術研究所；PVDF 膜購自美國 Bio-Rad公司。

3．實驗分組及處理：30只雌性Wistar大鼠采用數(shù)字表法隨機分為3組，即對照組、化療組(順鉑組)、化療給藥組(白藜蘆醇+順鉑組)，每組10只大鼠。在21天的實驗期間，對照組不給于任何藥物處理，化療組給予0.9%NaCl溶液1ml/d灌胃，按照前期實驗已經(jīng)篩選出藥物的有效劑量，化療給藥組給予白藜蘆醇25mg/(kg·d)溶于0.9%NaCl溶液1ml中灌胃。在實驗第15天，除對照組外，其余兩組大鼠均稱重后，單次給予順鉑(5mg/kg)，用0.9%NaCl溶液稀釋至2ml，注射入腹腔內(nèi)[3]。

4.標本提取及檢測：實驗第21天，各組大鼠完成全部給藥后24h，對所有大鼠進行麻醉，處死各組大鼠，取出雙側卵巢。(1)HE染色：4%甲醛固定，石蠟包埋后連續(xù)切片，HE染色，在光鏡下觀察卵巢形態(tài)及卵泡發(fā)育情況。(2)TUNEL凋亡檢測：切片常規(guī)脫蠟入水，加入Labeling Buffer混勻后將切片置于濕盒中，37℃溫箱溫育2h?？贵w稀釋液 1∶100 稀釋生物素化地高辛抗體，TBS洗滌，DAPI染色液輕度復染，ddH2O水洗?？篃晒馑p封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。每張片子隨機選擇5個視野進行計數(shù)陽性細胞和區(qū)域內(nèi)的總細胞數(shù)量，計算陽性細胞所占百分比(%)，即調(diào)亡指數(shù)(apoptotic index, AI)。(3)Western blot法檢測：卵巢組織蛋白提取，進行BCA蛋白定量，再行蛋白變性，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，封閉后分別行一抗孵育，二抗孵育后，將顯影液按照比例配置，避光保存。于暗室中，將條帶取出在吸水紙表面印干，將配置好的顯影液按照一個條帶200μl的量，均勻涂于膜上。根據(jù)說明書設置好曝光條件，曝光拍照。

結 果

1.各組大鼠卵巢組織病理學變化:對照組大鼠卵巢切片可見各級生長卵泡，黃體數(shù)目較多，血管豐富，間質(zhì)腺少見?；熃M卵巢切片可見卵巢萎縮，各級卵泡數(shù)明顯減少，黃體退化，間質(zhì)區(qū)有不同程度的炎細胞浸潤和纖維化?；熃o藥組卵巢切片可見卵巢結構較化療組有明顯改善，可見卵泡總數(shù)增多，間質(zhì)纖維化程度有所減輕，且可見一定數(shù)量的黃體,詳見圖1。

2.各組大鼠卵巢細胞凋亡比較：TUNEL凋亡試劑盒檢查，綠色熒光點代表凋亡細胞，與對照組比較，化療組熒光明顯增強，熒光區(qū)域明顯增大，且呈點線狀分布，凋亡指數(shù)明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(F=4211.70，P=0.000)，表明造模成功。與化療組比較，化療給藥組綠色熒光顯著減弱，熒光區(qū)域減小，呈星點狀分布，凋亡指數(shù)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義 (F=2180.32,P=0.000)。，詳見表1、圖2。

圖1 各組大鼠卵巢組織結構(HE,×40)A.對照組；B.化療組；C.化療給藥組

表1 各組大鼠卵巢細胞凋亡指數(shù)

與對照組比較，*P=0.000；與化療組比較，#P=0.000

3.各組的大鼠卵巢組織中PI3K/Ak/mTOR的相關蛋白表達：與對照組比較，化療組的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的蛋白表達則可見明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(p-PI3K/PI3K:F=328.44,P=0.000; p-Akt/Akt:F=471.04,P=0.000; p-mTOR/mTOR:F=398.72,P=0.000)；而與化療組比較，化療給藥組的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的蛋白表達均可見明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義 (p-PI3K/PI3K:F=161.52,P=0.000; p-Akt/Akt:F=391.08,P=0.000; p-mTOR/mTOR:F=185.00,P=0.000)，詳見圖3、表2。

圖2 各組大鼠卵巢細胞的凋亡情況(TUNEL，×400)A.對照組；B.化療組；C.化療給藥組

圖3 各組大鼠卵巢組織中PI3K/Akt/mTOR通路相關蛋白表達情況

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，組織形態(tài)學和生物化學方法能證明卵巢損傷，例如竇卵泡、閉鎖卵泡計數(shù)和血清激素濃度測定[4]。筆者研究組在前期的研究中，通過檢測各級卵泡數(shù)及血清抗苗勒管激素(AMH)成功造模DOR大鼠。在本研究中，筆者采用組織病理學、TUNEL凋亡和Western blot法檢測白藜蘆醇對大鼠化療后卵巢損傷的保護及作用機制。研究結果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以減少化療導致的卵巢細胞的凋亡，增加各級生長卵泡，并能增加化療損傷大鼠卵巢組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表達，提示白藜蘆醇能改善順鉑化療導致的大鼠卵巢損傷，其機制可能與激活PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。

表2 各組大鼠卵巢組織中相關蛋白表達水平的比較

與對照組比較，*P=0.000；與化療組比較，#P=0.000

近年來，隨著化療藥物進一步研究開發(fā)，腫瘤和免疫性疾病的緩解和治愈率正在穩(wěn)步提高。但化療可能導致DOR，生育能力下降，甚至發(fā)生早發(fā)性卵巢衰竭 (premature ovarian failure，POF)。順鉑是目前臨床中一種廣泛應用的化療藥物，用于治療大多數(shù)類型的癌癥。研究發(fā)現(xiàn)，順鉑可促使人原始卵泡的破壞和卵巢顆粒細胞的凋亡，導致以AMH分泌減少、卵泡細胞凋亡增加以及動情周期紊亂等為特征的卵巢衰竭[5,6]。筆者經(jīng)過前期造模實驗的結果可得出，順鉑5mg/kg腹腔單次注射可造成Wistar大鼠卵巢受損，AMH血清水平降低，成功制備出卵巢儲備低下的動物模型[3]。

近年來，在早發(fā)性卵巢功能不全的研究中，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mTOR信號通路不僅參與了卵母細胞生長的調(diào)控及發(fā)育卵泡的增殖和分化，還能調(diào)控顆粒細胞的增殖和凋亡[7]。PI3K是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導分子，分別由催化亞基p110和調(diào)節(jié)亞基p85組成。p110亞基具有Ser/Thr激酶和磷脂酰肌醇激酶活性[8]。Akt也被稱為蛋白激酶B，當細胞受到細胞外信號刺激時，細胞外刺激信號依賴于肌醇脂質(zhì)信號分子，經(jīng)過細胞膜轉(zhuǎn)換并轉(zhuǎn)導到細胞核，PI3K活化產(chǎn)生PIP3，導致Akt轉(zhuǎn)錄，Akt一旦在細胞膜上被完全激活，就會引起信號轉(zhuǎn)導通路的級聯(lián)反應[9]。Pdk1是PI3K的主要調(diào)控信號，在小鼠卵母細胞中選擇性敲除Pdk1可導致小鼠卵巢損傷，而mTOR通路通過直接或間接調(diào)控上游的Akt，參與細胞生長分化，促進卵泡發(fā)育增殖[10]。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)順鉑腹腔注射后，大鼠卵巢組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表達減少。提示順鉑可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的活性，進而導致卵巢細胞凋亡，卵泡生長閉鎖。

白藜蘆醇是一種多酚類，非類黃酮類抗氧化劑。它是在葡萄皮和高劑量紅葡萄酒中發(fā)現(xiàn)的植物抗毒素[11]。它具有抗炎，抗氧化和抗衰老的作用，通過上調(diào)細胞中的抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化功能，也對自由基具有直接的破壞作用[12]。Banu等[13]研究了白藜蘆醇對暴露于6價鉻大鼠卵巢發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇處理顯著增加卵母細胞總數(shù)，閉鎖卵泡數(shù)目減少，并抑制了細胞凋亡以及卵泡從原始階段向其他階段的轉(zhuǎn)變階段，保護卵巢儲備能力。Liu等[14]在一項白藜蘆醇對大鼠年齡相關不孕癥的影響的研究中，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能保護免受年齡相關的生育力變化，促進卵母細胞數(shù)量和質(zhì)量的恢復，并保持了健康的卵泡數(shù)量。Chen等[15]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對衰老大鼠的卵巢儲備有保護作用，使用白藜蘆醇治療的衰老大鼠有更健康的生長卵泡和更少的閉鎖卵泡。Atli等[16]也研究證實了白藜蘆醇能增加了發(fā)育卵泡，減少閉鎖卵泡的數(shù)量，并能保護卵巢功能抵抗氧化損傷。這些研究發(fā)現(xiàn)支持白藜蘆醇延緩卵巢衰老的假說。白藜蘆醇的這些作用可能與端粒長度和端粒酶活性增加、生殖細胞功能障礙減少和SIRT1激活有關，白藜蘆醇可活化SIRT1，同時可以通過激活AMPK和LKB1來調(diào)控mTOR的活性。

本研究中，筆者按照前期實驗的基礎，建立化療性卵巢損傷模型，給予預防性使用白藜蘆醇每日灌胃25mg/(kg·d)，連續(xù)給藥21天，組織學病理證實了化療給藥組的卵巢結構較化療組有明顯改善，可見卵泡總數(shù)增多，間質(zhì)纖維化程度有所減輕，且可見一定數(shù)量的黃體。TUNEL凋亡實驗發(fā)現(xiàn)，與化療組比較，化療給藥組中綠色熒光顯著減弱，熒光區(qū)域減小，呈星點狀分布，表明白藜蘆醇有明顯抑制化療損傷性DOR大鼠卵巢細胞凋亡的作用。而Western blot法分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過白藜蘆醇預處理，化療后的卵巢組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表達均明顯增多，提示白藜蘆醇可解除順鉑的抑制作用，使PI3K/Akt/mTOR信號通路活性增強，發(fā)揮其抑制凋亡的生物學功能，阻止卵巢細胞過度的凋亡。

綜上所述，本實驗證實了順鉑腹腔化療會破壞大鼠卵巢結構，增加卵巢細胞凋亡，顯著降低各級生長卵泡的數(shù)目。而白藜蘆醇的預防性使用，能夠減輕順鉑對大鼠卵巢組織結構的破壞及其對卵泡生長過程的抑制作用，促進卵泡生長，增加各級生長卵泡數(shù)，其保護機制可能與激活PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。