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    紫草素抗雌激素對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)的影響

    2020-04-01 02:00:46高文雅陶仕英牛建昭趙丕文王燕霞饒晨晨
    醫(yī)學(xué)研究雜志 2020年2期
    關(guān)鍵詞:紫草雌二醇細(xì)胞周期

    楊 陽 高文雅 陶仕英 牛建昭 趙丕文 王燕霞 饒晨晨 楊 蕾

    乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤之一,近年來其發(fā)生率和病死率呈不斷上升的趨勢,嚴(yán)重影響女性的身心健康[1]。研究表明,乳腺癌的發(fā)生與雌激素的刺激密切相關(guān),降低患者體內(nèi)雌激素水平可以抑制腫瘤生長[2]。臨床多采用手術(shù)切除、放療、化療等治療方法,但這些治療方法對患者的身體均存在不同程度的損害,因此,尋找有效治療腫瘤且不良反應(yīng)小的抗腫瘤藥物成為近年來研究的一個(gè)重要方向。紫草素(shikonin,SK)是一種萘醌類化合物,從中藥紫草的根中提取,是紫草主要的有效成分。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)紫草素還具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[3]。

    雌激素信號通路在調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮著重要作用,ERα是雌激素信號通路中的關(guān)鍵因子[4,5]。多項(xiàng)研究表明,cyclin D1是可能受雌激素影響的重要細(xì)胞周期調(diào)控蛋白之一, ERα的促有絲分裂作用能夠促進(jìn)細(xì)胞和動物組織中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1的表達(dá)[6,7]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)SK干預(yù)后通過調(diào)節(jié)cyclin D1周期蛋白可影響人宮頸癌SiHa細(xì)胞的周期,誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯,MCF-7是ER陽性乳腺癌細(xì)胞,雌激素具有促進(jìn)ER 陽性腫瘤增殖的作用[8,9]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M雌激素存在的體內(nèi)環(huán)境,研究SK對MCF-7細(xì)胞周期蛋白D1的影響。

    材料與方法

    1.藥物:左旋紫草素購自中國食品藥品檢定研究所。原藥品用無水乙醇作為溶劑配制,最終稀釋濃度至(1×10-8)~(1×10-6)mol/L。陽性對照組雌二醇(estrodiol,E2)購自美國Sigma公司,用無水乙醇配制,最終稀釋濃度為1×10-8mol/L[10]。

    2.材料:高糖DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司);RPMI 1640 Medium(ATCC Modification,美國Gibco公司);胎牛血清(美國Gibco公司);活性炭-葡聚糖苷處理的胎牛血清(CDT-FBS,美國Hyclone公司);0.05%胰蛋白酶(美國Invitrogen公司);MTT(美國Sigma 公司);DMSO(美國Sigma 公司);Cyclin D1抗體(美國Proteintech公司)。

    3.細(xì)胞培養(yǎng):人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基溶液中常規(guī)培養(yǎng),培養(yǎng)條件為5% CO2的培養(yǎng)箱,保持37℃恒溫及相對飽和濕度。每隔3~4天進(jìn)行傳代,實(shí)驗(yàn)開始前4天用PBS洗滌,洗滌后改用無酚紅DMEM(含5% CDT-FBS)培養(yǎng)液培養(yǎng),使細(xì)胞對雌激素樣物質(zhì)的敏感度增加,同時(shí)可以減少來自細(xì)胞自身的雌激素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。細(xì)胞生長達(dá)到80%融合時(shí),進(jìn)行消化傳代,選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、紫草素處理組(SK組,1×10-6mol/L、1×10-7mol/L和1×10-8mol/L)、雌二醇處理組(E2組,1×10-8mol/L)。

    4.免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測cyclin D1蛋白表達(dá):MCF-7細(xì)胞消化后計(jì)數(shù),以5×104個(gè)/毫升的細(xì)胞密度接種至24孔板。待細(xì)胞貼壁后,換含有1×10-8mol/L雌二醇和1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L SK的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后終止。吸去各孔培養(yǎng)基,每孔加入1ml PBS清洗3min×2次后,加入100μl的4%多聚甲醛固定20min,PBS清洗3min×3次;加入0.01%的Triton 于37℃恒溫箱搖勻,孵育20min,PBS清洗3min×3次;加入0.3%的過氧化氫甲醇溶液,孵育10min,PBS清洗3min×3次;使用免疫組化試劑盒血清工作液進(jìn)行封閉,20min后甩去;滴加一抗,冰箱4℃孵育,過夜后取出,用PBS沖洗5min;滴加二抗,37℃恒溫箱孵育15min,PBS沖洗5min×3次;滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液,室溫孵育15min,PBS沖洗5min×3次;DAB染色,避光放置10min,鏡下觀察,自來水沖洗后用蘇木素復(fù)染10s,迅速沖洗。置于倒置顯微鏡下拍片,拍照前每孔加入1ml的PBS避免細(xì)胞干燥, 400倍放大倍數(shù)每孔隨機(jī)選擇6個(gè)視野,使用免疫組化軟件Image pro plus進(jìn)行灰度測量分析。

    5.Western blot法檢測cyclin D1蛋白的表達(dá):MCF-7細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后,以5×104個(gè)/毫升的細(xì)胞密度接種至24孔板。細(xì)胞貼壁后,換含有1×10-8mol/L雌二醇和1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L SK的DMEM培養(yǎng)液。藥物作用48h后,在收集的細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液,12000×g離心5min,對上清液蛋白含量進(jìn)行測定、分析。蛋白變性之后開始上樣,SDS-PAGE 電泳(濃縮膠80V,分離膠120V),80V電壓轉(zhuǎn)膜75min。將PVDF膜置于5%的脫脂奶粉溶液中在37℃恒溫箱振搖1h封閉,分別加cyclin D1、GAPDH一抗,4℃冰箱孵育過夜。加二抗(HRP 標(biāo)記)在37℃恒溫箱振搖1h后,將PVDF膜放入ECL混合液,在室溫條件下水平搖床孵育5min,最后進(jìn)行X線片曝光,顯影、定影、掃描后,以GAPDH表達(dá)量為對照,Image pro plus軟件觀察分析結(jié)果,計(jì)算并統(tǒng)計(jì)各組灰度值。

    結(jié) 果

    1.免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測cyclin D1蛋白表達(dá):紫草素作用MCF-7細(xì)胞48h后, cyclin D1蛋白棕黃色顆粒在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中有陽性表達(dá)。其中雌二醇組表達(dá)量與空白對照組比較顯著增多;與空白對照組比較,SK各組表達(dá)較少,呈淡棕色,且cyclin D1蛋白表達(dá)量隨著SK濃度的升高逐漸被抑制(P<0.05),詳見圖1。

    2.Western blot法檢測紫草素1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L不同濃度組對cyclin D1蛋白表達(dá)的作用:與空白對照組比較,紫草素作用MCF-7細(xì)胞48h后,3個(gè)藥物濃度組1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L顯著降低了cyclin D1的表達(dá),并且隨著濃度的升高表達(dá)量逐漸降低,其中1×10-6mol/L紫草素對cyclin D1表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)(P<0.01),詳見圖2。

    圖2 紫草素作用后MCF-7細(xì)胞中cyclin D1蛋白的表達(dá)水平與空白對照組比較, *P<0.05, **P<0.01

    3.Western blot法檢測紫草素在雌二醇環(huán)境下對cyclin D1蛋白表達(dá)的影響:與空白對照組比較,雌二醇干預(yù)后,cyclin D1的蛋白表達(dá)量有所提高;經(jīng)紫草素1×10-6mol/L單獨(dú)作用后,cyclin D1的蛋白表達(dá)含量有顯著降低(P<0.01);雌二醇干預(yù)后,SK對cyclin D1蛋白量的表達(dá)同樣具有抑制作用(P<0.05),詳見圖3。

    圖3 紫草素對雌激素處理的MCF-7 cyclinD1蛋白表達(dá)的影響與空白對照組比較,*P<0.05, **P<0.01; E2+紫草素組;用1×10-8mol/L雌二醇處理后的SK組(1×10-6mol/L)組

    討 論

    乳腺癌是一種雌激素依賴性的惡性腫瘤,雌激素效應(yīng)主要受ERα介導(dǎo)基因組途徑和非基因自途徑的調(diào)節(jié),ERα在乳腺癌增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用,是一種經(jīng)典的核受體途徑[2]。研究發(fā)現(xiàn),紫草素這種天然萘醌類化合物對ERα陽性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞具有抑制作用,但具體如何通過ERα信號通路發(fā)揮作用,還需要進(jìn)一步研究和探討[11,12]。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,作用MCF-7細(xì)胞48h后, SK各濃度組與空白對照組比較,顯著抑制了cyclin D1的表達(dá),并且體現(xiàn)出濃度依賴性,即cyclin D1的表達(dá)量隨著SK濃度的升高逐漸降低,其中1×10-6mol/L紫草素對cyclin D1表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)(P<0.01)。同時(shí),為了進(jìn)一步完善此實(shí)驗(yàn),探究在人體內(nèi)雌激素作用條件下SK是否對乳腺癌還具有相同的抑制作用,本實(shí)驗(yàn)利用雌二醇模擬體內(nèi)雌激素環(huán)境,探究雌二醇干預(yù)后,SK是否仍對MCF-7細(xì)胞中的cyclin D1蛋白具有抑制作用。該部分結(jié)果顯示,與空白對照組比較,雌二醇單獨(dú)作用條件下cyclin D1蛋白表達(dá)量有所提高; 1×10-6mol/L SK單獨(dú)作用后,cyclin D1蛋白的表達(dá)量顯著降低(P<0.01);雌二醇干預(yù)下,SK作用48h后,cyclin D1蛋白的表達(dá)量也有顯著降低(P<0.05),這說明SK對MCF-7細(xì)胞中cyclin D1蛋白表達(dá)量的作用可能不受雌激素的影響,即在人體中SK可能會對乳腺癌具有非雌激素依賴性的抑制作用。

    cyclin D1能夠精確調(diào)控細(xì)胞周期,從而維持細(xì)胞正常生長發(fā)育平衡,與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[13]。研究發(fā)現(xiàn),cyclin D1異常表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控失衡,細(xì)胞增殖失調(diào),從而促進(jìn)腫瘤形成[14]。cyclin D1是重要的正性調(diào)節(jié)因子,作用于G1期,參與細(xì)胞周期G1/S期調(diào)控,具體機(jī)制為cyclin D1在G1期與CDK4/CDK6結(jié)合,并使其活化,活化的CDK4/CDK6能使Rb磷酸化,磷酸化的pRb活化雌二醇F促進(jìn)了DNA的合成,促使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期,最終cyclin D1的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞的分裂與增殖,當(dāng)與其他基因或基因產(chǎn)物異常配合時(shí),共同參與癌變的發(fā)生[15~17]。cyclin D1蛋白和乳腺的關(guān)系比較密切,研究顯示將小鼠的胚胎干細(xì)胞CCND1基因敲除后發(fā)現(xiàn)雖然缺乏cyclin D1蛋白表達(dá)的小鼠仍具有生存和生育能力,但是存在妊娠期乳腺腺泡發(fā)育障礙和泌乳功能的缺失。周春等[18]采用免疫組織化學(xué)方法檢測發(fā)現(xiàn)乳腺癌中cyclin D1蛋白陽性表達(dá)率明顯高于良性乳腺組織。筆者前期的研究發(fā)現(xiàn),紫草素對人宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖具有抑制作用, 其誘導(dǎo)G0/G1期阻滯的機(jī)制可能和cyclin D1蛋白有關(guān)[8]。黃彩梅等[19]研究發(fā)現(xiàn),人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的增殖隨著紫草素濃度的增加及作用時(shí)間的延長逐漸被抑制,紫草素可能是通過對雌激素信號通路中ERα、cyclin D1、c-myc蛋白表達(dá)的抑制,起到抑制Ishikawa細(xì)胞增殖的作用。這些結(jié)果都提示cyclin D1對乳腺癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展存在關(guān)鍵的調(diào)控作用,而紫草素有可能對cyclin D1蛋白具有抑制作用。

    本研究從ERα信號通路角度出發(fā),在前期發(fā)現(xiàn)的SK可影響ERα陽性乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期,將細(xì)胞阻滯于G0/G1期的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討調(diào)控周期的作用機(jī)制,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SK對cyclin D1的表達(dá)有抑制作用,并且這種抑制作用不受雌激素的影響,這為天然化合物從細(xì)胞周期角度調(diào)控ERα通路,進(jìn)而調(diào)節(jié)cyclin D1的表達(dá),最終破壞ERα陽性乳腺癌細(xì)胞的周期調(diào)控機(jī)制提供了一個(gè)可能性,但具體機(jī)制需要深入研究和探討。

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