熱休克蛋白70在家族性腺瘤性息肉病中的表達(dá)及意義

沈曉東 張 天 宋 文

FAP是一種常染色體顯性遺傳病，中國(guó)人發(fā)生率約是1/10000，受累個(gè)體在青春期長(zhǎng)出成千上萬(wàn)的大腸息肉，未經(jīng)治療則100%癌變,患者將無(wú)一例外死于大腸癌[1]。FAP的治療主要是全結(jié)腸切除或全結(jié)腸及直腸切除，但手術(shù)后并發(fā)癥較多，患者生活質(zhì)量差，并且術(shù)后仍可能復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或其他部位形成惡性腫瘤等風(fēng)險(xiǎn)，需要接受非手術(shù)治療，故FAP免疫治療等非手術(shù)治療方面的研究非常必要[2]。目前研究表明，F(xiàn)AP發(fā)病與抑癌基因APC突變有關(guān)[3]，大多數(shù)APC基因突變使APC蛋白呈“截短”改變，導(dǎo)致其結(jié)合β-catenin 的區(qū)域異常，引起β-catenin降解障礙，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin大量集聚，進(jìn)入細(xì)胞核后與TCF因子結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)腸道息肉形成及癌變。Apc基因敲除小鼠ApcΔ716/+是國(guó)際公認(rèn)的研究人FAP的小鼠模型，具有高度遺傳穩(wěn)定性，廣泛應(yīng)用于人FAP方面的的研究[4～6]。

熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)是細(xì)胞受到高熱等有害因素刺激時(shí)大量表達(dá)的一類特殊應(yīng)激蛋白，其主要作用是通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)變性蛋白質(zhì)結(jié)合而維持其正常的構(gòu)象及功能[7]。根據(jù)同源程度及分子量大小將HSP家族成員分為HSP90、HSP70、HSP60及小分子HSP等10余種，其中HSP70最受研究者們關(guān)注，它在正常細(xì)胞中表達(dá)水平較低，但細(xì)胞受到應(yīng)激時(shí)合成量最多、表達(dá)水平最高，特別是惡性腫瘤的缺氧、酸中毒和營(yíng)養(yǎng)缺乏等不良環(huán)境，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞大量表達(dá)HSP70[8]；HSP70作為“分子伴侶”c-Myc等基因突變后的產(chǎn)物相互作用，穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞異常增殖[9]；腫瘤來(lái)源的HSP70 具有強(qiáng)大的免疫原性和腫瘤特異性, 因而HSP70可能在FAP息肉發(fā)生、惡變及免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[10]。

近年來(lái)研究表明HSP70在許多腫瘤中大量表達(dá)，并且在腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要作用，但在FAP腸道息肉發(fā)生、發(fā)展中的表達(dá)情況及作用目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道[11]。本研究采用ApcΔ716/+小鼠作為FAP模型鼠，研究不同周齡的小鼠腸道息肉HSP70表達(dá)的變化，從而明確HSP70在FAP發(fā)生、發(fā)展中的作用，為HSP70應(yīng)用于FAP的抑制息肉癌變、延緩病情發(fā)展及免疫治療提供依據(jù)。

材料與方法

1.材料:鼠抗人HSP70單克隆抗體(ab2787)及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠多克隆抗體 (ab6728)由英國(guó)艾博抗公司提供，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒由英國(guó)阿默舍姆制藥生物技術(shù)公司提供，Trizol試劑盒由美國(guó)英杰生命技術(shù)公司提供，標(biāo)第1鏈合成系統(tǒng)Ⅱ由美國(guó)賽默飛生命科學(xué)公司提供。SYBR Green PCR 預(yù)混液及ABI PRISM?7000 序列檢測(cè)系統(tǒng)由美國(guó)PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司提供。其他試劑及儀器均為實(shí)驗(yàn)研究使用。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：ApcΔ716/+(C57BL/6)小鼠由Oshima教授提供，SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，ApcΔ716/+雄性小鼠與野生型雌性小鼠進(jìn)行交配，通過(guò)基因鑒定選出ApcΔ716/+小鼠作為本研究使用[5，6]。

3.ApcΔ716/+小鼠腸道息肉數(shù)目、大小及良惡性判定:分別于1～16周選取各周齡ApcΔ716/+小鼠，每周6只共96只，不分性別，頸椎脫臼法處死小鼠，分離出腸道，剪開(kāi)腸道，甲醛溶液固定。體視顯微鏡×20視野，觀測(cè)并記錄每個(gè)息肉；觀測(cè)完成后將腸組織卷起，常規(guī)石蠟包埋及切片；通過(guò)HE染色判斷息肉良惡性，并與小鼠周齡及息肉的大小對(duì)照。通過(guò)體視顯微鏡觀察及HE染色等方法確定息肉開(kāi)始出現(xiàn)的周齡為4周,絕大部分直徑為0.5～1.0mm，全部為良性腺瘤性息肉；息肉開(kāi)始癌變的周齡為8周，癌變的息肉直徑多>3.0mm,尤其是≥4.0mm者均發(fā)生癌變。

4.ApcΔ716/+小鼠腸息肉HSP70免疫組織化學(xué)染色:選取4周、8周、12周ApcΔ716/+小鼠,每組6只,分離整個(gè)腸道并依次固定及石蠟包埋；5μm切片，水化，通過(guò)HE染色選取癌變的息肉；3%雙氧水過(guò)氧化物酶阻斷，微波抗原修復(fù)，山羊血清封閉，滴加HSP70一抗， 4℃密封過(guò)夜，滴加相應(yīng)二抗， 37℃溫育30min，各步驟間PBS振洗， DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明及封片。免疫組化染色陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：棕黃色顆粒沉積的部位為染色陽(yáng)性，腫瘤細(xì)胞主要是細(xì)胞核著色，部分腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)輕微著色，少部分正常上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜輕微著色。HSP70的相對(duì)表達(dá)量由染色細(xì)胞比率及著色強(qiáng)度的乘積來(lái)判定，每個(gè)切片在×400視野下在典型部位隨機(jī)選取10個(gè)視野，各視野共檢測(cè)100個(gè)細(xì)胞[12]。染色細(xì)胞陽(yáng)性比例判斷標(biāo)準(zhǔn)：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；染色強(qiáng)度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞內(nèi)無(wú)染色為0分，淡黃色為1分，棕色為2分，棕褐色為3分。由兩名病理科醫(yī)生雙盲下獨(dú)立評(píng)分。

5.Western blot法檢測(cè)ApcΔ716/+小鼠腸道息肉中HSP70的表達(dá):采取4周正常腸黏膜、0.5mm剛形成的腸道良性息肉及8周小鼠腸道4.0mm以上最大的息肉、12周小鼠5.0mm癌變息肉(8周及12周標(biāo)本留取小部分組織通過(guò)HE染色證實(shí)已經(jīng)癌變)的細(xì)胞提取液進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳及半干式轉(zhuǎn)膜，一抗選用鼠抗人HSP70單克隆抗體，二抗選用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠多克隆抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒顯像。

6.RT-PCR法檢測(cè)ApcΔ716/+小鼠息肉HSP70的 mRNA的表達(dá):選取4周、8周、12周ApcΔ716/+小鼠各6只，處死小鼠，無(wú)RNA酶狀態(tài)下分離腸道，切取4周0.5mm左右息肉、8周4.0mm以上最大的息肉、12周5.0mm息肉(8周及12周標(biāo)本留取小部分組織通過(guò)HE染色證實(shí)已經(jīng)癌變)及4周正常腸黏膜，Trizol 試劑盒提取息肉及腸黏膜的總RNA，操作方法依照Trizol 試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)；應(yīng)用標(biāo)第1鏈合成系統(tǒng)Ⅱ試劑盒合成相應(yīng)cDNA, HSP70引物序列：上游引物：5′-GAAGGTGCTGGACAAGTGC-3′，下游引物：5′-GCCAGCAGAGGCCTCTAATC-3′[13]。PCR擴(kuò)增應(yīng)用SYBR Green PCR預(yù)混液，ABI PRISM?7000 序列檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果，內(nèi)參選用β-actin。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用方差分析檢驗(yàn)，組間比較采用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.ApcΔ716/+小鼠腸道息肉發(fā)生及發(fā)展情況:通過(guò)對(duì)1～16周齡共96只小鼠腸道息肉的體視顯微鏡觀察及HE染色發(fā)現(xiàn)，小鼠腸道1～3周基本無(wú)腸道息肉，于4周左右腸道開(kāi)始出現(xiàn)息肉，詳見(jiàn)表1，息肉均為剛形成的良性腺瘤性息肉，體積較小約0.5～1.0mm，詳見(jiàn)圖1；5～7周小鼠腸道息肉大量形成、快速增大，但均為良性腺瘤性息肉；8周齡小鼠腸道息肉大量形成,部分較大(>3.0mm)的息肉開(kāi)始出現(xiàn)癌變，發(fā)展成腸腺癌，直徑>4.0mm的息肉絕大部分癌變； 9～11周小鼠腸道息肉形成速度明顯減慢，但息肉體積進(jìn)行性增大，呈現(xiàn)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)；12周齡腸道息肉數(shù)目進(jìn)一步增加，體積也進(jìn)一步增大，癌變的息肉也大幅度增加，部分小鼠出現(xiàn)腸梗阻、腹腔積液、惡病質(zhì)等并發(fā)癥，小鼠開(kāi)始出現(xiàn)死亡；13～15周小鼠腸道仍有少許新發(fā)腸道息肉，體積進(jìn)行性增大,最大者超過(guò)10mm，小鼠大量死亡；16周內(nèi)絕大部分小鼠死亡，平均生存期限14.12±6.70周，死亡時(shí)小鼠腸道息肉總數(shù)為90.6±13.8。因ApcΔ716/+小鼠4周左右開(kāi)始出現(xiàn)息肉，8周左右較大的息肉開(kāi)始出現(xiàn)癌變，12周左右小鼠開(kāi)始出現(xiàn)死亡，故選取4、8和12周小鼠檢測(cè)HSP70的表達(dá)情況。正常小鼠腸道作為對(duì)照，在正常小鼠腸道內(nèi)未見(jiàn)息肉。

表1 ApcΔ716/+小鼠腸道息肉總數(shù)惡變息肉數(shù)及HSP70相對(duì)表達(dá)量

與4周比較,*P=0.000；與8周比較,#P>0.05，ΔP=0.000

圖1 4周、8周及12周ApcΔ716/+小鼠腸息肉及正常小鼠腸道的體視顯微鏡觀察A.正常；B.4周；C.8周；D.12周；標(biāo)尺:2mm

2.ApcΔ716/+小鼠腸道息肉的HSP70免疫組織化學(xué)染色：不同周齡ApcΔ716/+小鼠腸道息肉HSP70的相對(duì)表達(dá)量明顯不同(F=167.423,P=0.000)，詳見(jiàn)圖2。HSP70在4周時(shí)腸息肉內(nèi)相對(duì)表達(dá)量很低(1.60±0.37)，僅見(jiàn)少數(shù)HSP70陽(yáng)性細(xì)胞，著色強(qiáng)度也很弱；8周時(shí)部分息肉開(kāi)始出現(xiàn)癌變，HSP70相對(duì)表達(dá)量明顯升高(6.37±0.56)，與4周時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；12周時(shí)癌變的息肉快速增多，并呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，HSP70相對(duì)表達(dá)量升高(7.02±0.70)，與4周時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，但與8周時(shí)比較略有升高。正常小鼠腸道HSP70免疫組織化學(xué)染色作為對(duì)照，在正常小鼠腸道中未見(jiàn)明顯HSP70染色陽(yáng)性細(xì)胞。

圖2 ApcΔ716/+小鼠腸道腺瘤性息肉及正常小鼠腸道的HSP70免疫組織化學(xué)染色A.正常；B.4周；C.8周；D.12周；標(biāo)尺為50μm

3.ApcΔ716/+小鼠腸道息肉的HSP70蛋白表達(dá)：正常腸黏膜HSP70表達(dá)量極低，條帶僅隱約可見(jiàn)；4周時(shí)息肉開(kāi)始出現(xiàn)，HSP70表達(dá)量略升高，但蛋白條帶仍然較弱；而8周及12周腸道息肉的HSP70蛋白條帶明顯增強(qiáng)，與正常腸黏膜及4周時(shí)腸息肉比較明顯不同，詳見(jiàn)圖3。

圖3 HSP70在不同周齡ApcΔ716/+小鼠腸道息肉及正常腸黏膜(M)中的表達(dá)

4.ApcΔ716/+小鼠腸道息肉的HSP70 RT-PCR結(jié)果：不同周齡小鼠腸道息肉HSP70的mRNA相對(duì)值也明顯不同(F=62.661,P=0.000),詳見(jiàn)圖4。正常腸黏膜HSP70的mRNA表達(dá)量極低,為0.06±0.03,4周腸息肉開(kāi)始出現(xiàn)時(shí)HSP70的mRNA表達(dá)量略有升高,為0.17±0.09,與正常黏膜比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；8周腸道癌變息肉HSP70的mRNA表達(dá)量明顯升高(0.69±0.14)，與4周時(shí)腸息肉比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；12周時(shí)腸息肉內(nèi)HSP70的mRNA表達(dá)量為0.82±0.16,較4周息肉明顯升高,但較8周息肉僅略有升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 ApcΔ716/+小鼠腸道息肉HSP70的mRNA相對(duì)值

討 論

FAP患者息肉終生癌變率幾乎是100%，但如果及時(shí)發(fā)現(xiàn)、及時(shí)治療可以預(yù)防息肉癌變，故預(yù)防FAP患者息肉癌變非常重要[14]。目前研究表明HSP70在許多惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及治療中發(fā)揮重要的作用，而且HSP70對(duì)惡性腫瘤的免疫治療已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[6～9,15]； HSP70與惡性腫瘤放、化療敏感度低下有關(guān)[16]。上述一系列研究說(shuō)明，HSP70參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療、耐藥及預(yù)后等一系列臨床過(guò)程，適合作為FAP息肉癌變、發(fā)展惡化及免疫治療等方面的靶點(diǎn)而深入研究。

本研究顯示，在4周左右ApcΔ716/+小鼠開(kāi)始出現(xiàn)腸道息肉，息肉開(kāi)始形成時(shí)均為良性腺瘤性息肉，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色、蛋白質(zhì)免疫印跡分析及RT-PCR等實(shí)驗(yàn)方法證明，4周時(shí)0.5mm左右剛形成的息肉HSP70表達(dá)較正常腸黏膜略有升高，但表達(dá)仍較低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明HSP70在FAP息肉形成過(guò)程中作用不明顯。8周時(shí)小鼠腸道息肉開(kāi)始出現(xiàn)癌變，息肉癌變組織中HSP70表達(dá)顯著升高，說(shuō)明HSP70在息肉癌變中發(fā)揮重要的作用。12周時(shí)ApcΔ716/+小鼠很多息肉已經(jīng)癌變，發(fā)展成腸腺癌，并呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，其HSP70表達(dá)較4周息肉顯著升高，較8周息肉開(kāi)始癌變時(shí)略有升高，提示HSP70在結(jié)直腸癌發(fā)展中也發(fā)揮重要作用。以上結(jié)果表明，HSP70在息肉開(kāi)始癌變時(shí)及癌變后持續(xù)升高，直至小鼠死亡，說(shuō)明HSP70在息肉癌變及腸癌形成后的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等發(fā)展過(guò)程中有重要作用。由于FAP具備典型的息肉-腺瘤-癌變過(guò)程，是大腸癌發(fā)病機(jī)制研究的最佳樣本，所以通過(guò)上述結(jié)果，可推測(cè)HSP70在結(jié)直腸癌形成及發(fā)展過(guò)程中也具有重要作用。

HSP70參與FAP息肉癌變及腸癌發(fā)展的機(jī)制尚不清楚，目前研究表明，WNT信號(hào)通路中β-catenin 等活性升高是FAP息肉癌變的重要特征，HSP70通過(guò)活化WNT信號(hào)通路，提高β-catenin等蛋白數(shù)量及穩(wěn)定性，引起β-catenin轉(zhuǎn)錄活性增高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖[17，18]；HSP70在腫瘤細(xì)胞中能通過(guò)分子伴侶作用減輕蛋白毒性應(yīng)激反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)缺乏、蛋白毒性應(yīng)激、缺氧等不良生存環(huán)境中存活[19]；HSP70使腫瘤細(xì)胞抵抗正常細(xì)胞凋亡信號(hào)[20]。綜合上述研究可推測(cè)HSP70可能通過(guò)使WNT信號(hào)通路中β-catenin等蛋白數(shù)量及活性升高、減輕蛋白毒性應(yīng)激反應(yīng)及抑制腫瘤細(xì)胞凋亡等作用機(jī)制，促進(jìn)FAP息肉癌變及腸癌進(jìn)展，需要進(jìn)一步研究明確HSP70 促進(jìn)FAP腸息肉癌變中的具體作用機(jī)制。

綜上所述，本研究中4周息肉開(kāi)始出現(xiàn)時(shí)HSP70表達(dá)略有升高，在8周息肉開(kāi)始癌變及12周腸癌生長(zhǎng)浸潤(rùn)時(shí)HSP70表達(dá)持續(xù)性顯著升高，提示HSP70在息肉的形成過(guò)程中作用不明顯，但在腸息肉癌變及腸癌浸潤(rùn)生長(zhǎng)發(fā)揮重要的作用。本研究探索了HSP70在FAP腸道息肉中表達(dá)的變化情況及其意義，為FAP患者預(yù)防息肉癌變及結(jié)直腸癌免疫治療提供新策略。