白芍總苷對(duì)缺血性腦損傷大鼠海馬線粒體ATP酶活性及ATP含量的影響

陳小麗 徐 洲 王小波 陳 剛

線粒體功能障礙所致ATP耗竭在缺血性腦損傷發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，而其與線粒體ATP酶密切相關(guān)[1]。線粒體ATP酶主要包括Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶，三者均為ATP能量依賴(lài)性轉(zhuǎn)運(yùn)酶，能夠逆濃度交換轉(zhuǎn)運(yùn)線粒體內(nèi)Na+、K+、Ca2+、Mg2+離子，維持線粒體Ca2+平衡[2，3]。而當(dāng)缺血性腦損傷發(fā)生后，線粒體功能受損而導(dǎo)致ATP合成受阻，進(jìn)而影響ATP酶活性，導(dǎo)致線粒體Ca2+超載而引發(fā)細(xì)胞凋亡[4]。白芍總苷(total glucosides of paeonia，TGP)是從白芍干燥根中得到芍藥苷(paeoniflorin)、羥基芍藥苷 (hydroxy-paeoniflorin)、芍藥花苷(paeonin)、芍藥內(nèi)酯苷(albiflorin)、苯甲酰芍藥苷 (benzoylpaeoniflorin)等具有生理功效成分的混合物的總稱(chēng)，張玥等[5]研究發(fā)現(xiàn)白芍總苷能夠改善血液流變學(xué)指標(biāo)，史晴晴等[6]研究發(fā)現(xiàn)白芍總苷能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)而對(duì)缺血性腦損傷起到一定的保護(hù)作用，此外史晴晴等[7]還發(fā)現(xiàn)白芍總苷通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡而對(duì)腦缺血中樞海馬組織具有保護(hù)作用。本研究將探討白芍總苷是否對(duì)缺血性腦損傷大鼠海馬線粒體ATP酶活性、ATP含量具有影響，既往相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道尚不多見(jiàn)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)8周齡雄性SD大鼠，平均體質(zhì)量250±20g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(冀)2018-004，動(dòng)物批次號(hào)：20190114009；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(冀)2018-003。實(shí)驗(yàn)前清潔環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，光照/黑暗周期1∶1，恒室溫25±1℃，相對(duì)濕度60%～70%；術(shù)前24h禁食，飲水不限。

2.藥物與試劑：白芍總苷膠囊購(gòu)自寧波立華制藥有限公司[國(guó)藥準(zhǔn)字H20055058，規(guī)格：0.3g/粒(含芍藥苷不少于104mg)，批號(hào)：201712005]。HE試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所(批號(hào)：20180129)；TTC購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司(批號(hào)：150824)；ATP、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：180924、181115、180620、180809)。

3.主要儀器：H-7650型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；RM2125型石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；BH-2型倒置光學(xué)顯微鏡及攝像(日本Olympus公司)；MP2002型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；UV759型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海圣科儀器設(shè)備有限公司)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(北京麥克奧迪儀器儀表有限公司)。

4.模型復(fù)制：參照王新鳳等[8]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法復(fù)制缺血性腦損傷大鼠模型：(1)線栓制作：取直徑0.235mm釣魚(yú)線并剪制3.5cm長(zhǎng)度分段，輕輕灼燒一側(cè)呈釘子冒狀，于距離“釘子冒”一側(cè)18～20mm處做標(biāo)記，備用。(2)模型制備：腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，頸部正中切口，剝離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈(充分暴露三者分叉處)，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，于分叉處近心端頸總動(dòng)脈切口、插入線栓進(jìn)頸內(nèi)動(dòng)脈，遇阻力止，深度距分叉處約18mm，固定線栓后逐層縫合，消毒。假手術(shù)組大鼠除不插入線栓外，其余操作同模型組。

5.分組與給藥：取缺血性腦損傷大鼠模型120只，按照數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、白芍總苷50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg組，每組30只；另取同齡雄性SD大鼠30只設(shè)為假手術(shù)組。精確稱(chēng)取白芍總苷膠囊內(nèi)充藥物400mg，加入0.9%NaCl注射液10ml制備白芍總苷溶液，濃度為40mg/ml，并依次稀釋制備20mg/ml、10mg/ml濃度的白芍總苷溶液；術(shù)后第2天，白芍總苷各劑量組分別灌胃給予相應(yīng)濃度藥物(5ml/kg)，假手術(shù)組和模型組灌胃給予0.9%NaCl注射液(5ml/kg)，1次/天，共28天。

6.神經(jīng)功能評(píng)分：5組大鼠各隨機(jī)取8只大鼠，行盲法10分制神經(jīng)功能評(píng)分[9]：置大鼠于地面上，向缺血對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈，計(jì)1分；提鼠尾，缺血對(duì)側(cè)前肢腕屈曲計(jì)1分、肘屈曲計(jì)2分、肩內(nèi)旋計(jì)3分；缺血對(duì)側(cè)推動(dòng)時(shí)阻力下降，據(jù)下降程度計(jì)1～3分；置金屬網(wǎng)上，據(jù)缺血對(duì)側(cè)肌張力下降程度計(jì)1～3分。

7.腦梗死體積的測(cè)定：取神經(jīng)功能評(píng)分完成后的各組8只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后，冰上迅速斷頭取腦組織，預(yù)冷冰鹽水沖洗干凈后置-20℃冰箱凍存0.5h，去除額級(jí)，在視交叉水平行冠狀位等距切片，厚度為2mm。浸入預(yù)配置好的恒溫37℃濃度1%的TTC溶液，避光孵育0.5h，每5min翻動(dòng)腦切片1次以使之均勻著色。染色后灰白色為腦梗死區(qū)、紅色為正常腦組織，拍照后應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算切片梗死面積，腦梗死體積百分比(%)=(右側(cè)腦梗死面積×切片厚度/右側(cè)腦體積)×100%。

8.腦組織含水量的測(cè)定：5組大鼠各隨機(jī)取8只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后，冰上迅速斷頭取腦組織，去除繡球、小腦和腦干后稱(chēng)重為濕重；然后用錫紙包裹后置110℃干燥箱烘烤至恒重，稱(chēng)重為干重，腦組織含水量(%)=[(濕重-干重)/濕重]×100%。

9.HE染色法進(jìn)行組織病理學(xué)檢查：5組大鼠各隨機(jī)取8只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后開(kāi)胸暴露心臟，于左心室置入一灌注針頭、右心耳做一切口，快速灌洗0.9%NaCl注射液，直至右心耳切口處流出的液體清澈停止，然后再用濃度為4%多聚甲醛溶液繼續(xù)進(jìn)行灌注固定，灌注速度由快到慢，大鼠完全僵硬后，斷頭取腦置4%多聚甲醛溶液繼續(xù)固定24h。經(jīng)固定的腦組織進(jìn)行石蠟包埋和切片，切片厚度2μm，經(jīng)二甲苯透明、梯度乙醇脫蠟水化處理，然后行HE染色：蘇木精溶液浸泡5min、2次各30s水沖洗、PBS溶液返藍(lán)、30s水沖洗、伊紅溶液浸泡30s、然后性梯度乙醇脫水、二甲苯透明處理、中性樹(shù)膠封片，倒置光學(xué)顯微鏡觀察并照相保存。

10.透射電子顯微鏡(TEM)觀察超微結(jié)構(gòu)：各組隨機(jī)取6只大鼠，參照上一步方法行心臟灌流固定至肝臟顏色明顯變淡時(shí)，立即斷頭取腦并剝離海馬，切割成約1mm3小塊后置4℃預(yù)冷的3%戊二醛溶液中于4℃冰箱固定2h，PBS溶液浸洗30min，置于1%四氧化鋨溶液于4℃下再固定2h，然后依次經(jīng)梯度乙醇脫水、還氧丙烷置換、環(huán)氧樹(shù)脂Epon812浸透、包埋、聚合、光學(xué)顯微鏡下定位后，超薄切片(60nm)，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，經(jīng)10000倍TEM觀察海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)并拍照。

11.線粒體ATP酶活性、ATP含量及游離Ca2+濃度測(cè)定：取各組剩余8只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后，冰上迅速斷頭取腦組織，去除小腦、腦干后剝?nèi)∪毖獋?cè)大腦海馬組織，參照高永超等[10]報(bào)道的方法制備線粒體：加入適量冷裂解液制備10%腦組織勻漿液，第1次4℃低溫離心(3000r/min離心5min)后取上清液、第2次4℃低溫離心(12000r/min離心30min)后取沉淀，即為海馬線粒體，經(jīng)超聲波破碎后，嚴(yán)格按照各檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明步驟測(cè)定Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性，以每小時(shí)每毫克蛋白分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為1活力單位[μmol Pi/(mg Pro·h)]；采用比色法、通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定ATP含量。采用原子化學(xué)發(fā)光法，以CaCO3為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定中樞海馬區(qū)線粒體內(nèi)游離Ca2+濃度。

結(jié) 果

1.各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分測(cè)定結(jié)果：模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而與模型組比較，白芍總苷100mg/kg、200mg/kg組神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(P<0.01)，提示白芍總苷對(duì)缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能具有保護(hù)作用，詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積、含水量

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01

2.各組大鼠腦梗死體積的觀察與測(cè)定結(jié)果：各組大鼠大腦組織切片經(jīng)TTC避光染色后發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組腦組織均勻著色、呈紅色，未見(jiàn)梗死灶；模型組腦組織可見(jiàn)明顯蒼白色梗死灶，與模型組比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)白芍總苷不同劑量治療28天能夠不同程度減小缺血性腦損傷大鼠大腦組織梗死灶，其中白芍總苷200mg/kg組梗死灶減小較為明顯。通過(guò)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦梗死體積百分比顯著升高，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而與模型組比較，白芍總苷100mg/kg、200mg/kg組腦梗死體積百分比顯著降低(P<0.05或P<0.01)，詳見(jiàn)表1、圖1。

圖1 各組大鼠腦組織梗死狀況(TTC染色，蒼白色為腦組織梗死區(qū))A.假手術(shù)組；B.模型組；C.白芍總苷50mg/kg組；D.白芍總苷100mg/kg組；E.白芍總苷200mg/kg組

3.各組大鼠腦組織含水量測(cè)定結(jié)果:模型組大鼠腦組織含水量明顯升高，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而與模型組比較，白芍總苷100mg/kg、200mg/kg組含水量顯著降低(P<0.05),詳見(jiàn)表1。

4.各組大鼠中樞海馬病理學(xué)檢查結(jié)果：HE染色行組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠中樞海馬區(qū)神經(jīng)元排列整齊、結(jié)構(gòu)完整、層次清晰呈3～5層、邊界清楚，核膜核仁清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)均未見(jiàn)異常；模型組大鼠海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)明顯的病理性改變，具體表現(xiàn)為神經(jīng)元數(shù)量減少、間隙增大、層次邊界不清、胞體腫脹變大呈三角形、核固縮偏移等；較模型組，白芍總苷各劑量組中樞海馬區(qū)組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)病變呈不同程度改善，其中白芍總苷200mg/kg組上述效果最為顯著，表現(xiàn)為神經(jīng)元排列較為整齊，細(xì)胞分界清晰，可見(jiàn)少量神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)異常(圖2)。

圖2 各組大鼠中樞海馬區(qū)病理學(xué)檢查結(jié)果(HE，×400)A.假手術(shù)組；B.模型組；C.白芍總苷50mg/kg組；D.白芍總苷100mg/kg組；E.白芍總苷200mg/kg組

5.各組大鼠海馬線粒體超微結(jié)構(gòu)檢查結(jié)構(gòu)(圖3)：經(jīng)TEM檢測(cè)，假手術(shù)組中樞海馬區(qū)線粒體形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常；模型組線粒體較假手術(shù)組呈現(xiàn)明顯的病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為線粒體水腫、崩解，數(shù)量減少，嵴斷裂溶解、消失，嵴內(nèi)間隙增大等；而與模型組比較，白芍總苷各劑量組上述海馬區(qū)線粒體病理性超微結(jié)構(gòu)改變呈不同程度好轉(zhuǎn)，其中白芍總苷200mg/kg組效果最為顯著。

圖4 各組大鼠海馬區(qū)線粒體超微結(jié)構(gòu)(TEM，×10000)A.假手術(shù)組；B.模型組；C.白芍總苷50mg/kg組；D.白芍總苷100mg/kg組；E.白芍總苷200mg/kg組

6.各組大鼠海馬線粒體ATP酶活性測(cè)定結(jié)果:模型組大鼠海馬線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性均顯著降低，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而與模型組比較，白芍總苷100mg/kg、200mg/kg組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性均顯著升高(P<0.05或P<0.01),詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠海馬線粒體ATP酶活性

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01

7.各組大鼠海馬線粒體ATP含量及游離Ca2+濃度測(cè)定結(jié)果:模型組大鼠海馬區(qū)線粒體ATP含量顯著降低、Ca2+濃度顯著升高，與假手術(shù)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而與模型組比較，白芍總苷100mg/kg、200mg/kg組ATP含量升高且Ca2+濃度降低(P<0.05或P<0.01),詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠海馬線粒體ATP含量及游離Ca2+濃度

與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01

討 論

線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換場(chǎng)所，是缺血性腦損傷極易累及的細(xì)胞器。腦組織缺氧、缺血將導(dǎo)致細(xì)胞呼吸功能障礙、ATP酶活性降低、ATP合成受阻等而嚴(yán)重影響線粒體功能并加重缺血性腦損傷，所以線粒體保護(hù)或許是抑制缺血性腦損傷的有效途徑[11]。

2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法是檢查組織壞死的常用實(shí)驗(yàn)方法，其工作原理為T(mén)TC作為脂溶性光敏感復(fù)合物能夠與組織內(nèi)脫氫酶反應(yīng)生成三苯基甲臜而呈紅色，而壞死組織細(xì)胞內(nèi)缺乏脫氫酶而不能染色呈蒼白色[12]。腦組織水腫是缺血性腦損傷后常見(jiàn)并發(fā)癥，促使神經(jīng)功能損傷加速惡化，顱內(nèi)壓升高，腦血流量減少，最終導(dǎo)致腦疝和患者死亡[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠神經(jīng)功能明顯降低、缺血側(cè)腦組織可見(jiàn)明顯梗死灶、梗死體積達(dá)51.36%±8.52%、腦組織含水量顯著升高，而經(jīng)白芍總苷100mg/kg、200mg/kg(1次/日)治療28天能夠顯著改善缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能、減小腦梗死灶、降低腦水腫、改善缺血側(cè)海馬組織細(xì)胞病理性改變，提示白芍總苷對(duì)缺血性腦損傷具有一定的保護(hù)作用。

線粒體是細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換的場(chǎng)所，其功能本質(zhì)為氧化磷酸化，依賴(lài)線粒體結(jié)構(gòu)的高度完整性。本實(shí)驗(yàn)采用透射電子顯微鏡(TEM)觀察缺血性腦損傷大鼠中樞海馬區(qū)線粒體，結(jié)果顯示模型組大鼠線粒體呈現(xiàn)明顯的病理性超微結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為水腫、崩解，數(shù)量減少，嵴斷裂溶解、消失，嵴內(nèi)間隙增大等，該結(jié)果與賀平等[14]研究報(bào)道結(jié)果一致；而經(jīng)白芍總苷不同劑量治療28天能夠不同程度減輕上述超微結(jié)構(gòu)病變，高劑量組效果更為顯著，提示白芍總苷對(duì)缺血性腦損傷所致海馬線粒體損傷具有保護(hù)作用。

線粒體機(jī)構(gòu)受損將直接影響ATP的合成，進(jìn)而影響ATP能量依賴(lài)性的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性。Na+-K+-ATP酶活性降低將引發(fā)Na+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Na+濃度過(guò)高將引發(fā)Na+/Ca2+交換而使Ca2+進(jìn)入線粒體，生理狀態(tài)下在Ca2+-ATP 酶、Mg2+-ATP酶作用下能夠?qū)⑦^(guò)量的Ca2+泵出而維持線粒體Ca2+平衡，而在缺血性腦損傷病理狀態(tài)下Ca2+-ATP 酶、Mg2+-ATP酶活性降低導(dǎo)致線粒體內(nèi)Ca2+泵出受限而引發(fā)鈣超載[15，16]。線粒體鈣超載將影響其氧化磷酸化功能，進(jìn)一步抑制ATP合成，從而形成“ATP合成障礙-鈣超載”的“惡性循環(huán)”，加重腦能量代謝障礙，進(jìn)一步加重缺血性腦損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)白芍總苷100mg/kg、200mg/kg(1次/日)治療28天能夠顯著提高缺血性腦損傷大鼠海馬區(qū)線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性并提高ATP含量、降低Ca2+濃度，提示白芍總苷能夠改善缺血性腦損傷大鼠海馬線粒體功能的作用。

綜上所述，白芍總苷對(duì)腦組織缺血性損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與白芍總苷改善線粒體ATP酶活性、提高ATP含量、抑制線粒體損傷而保護(hù)線粒體功能有關(guān)。