鈉-氫交換體1抑制劑治療心力衰竭大鼠

孫桂芳 孫俊峰 王孝微

哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞膜分布鈉-氫交換體1(Na+-H+exchanger 1, NHE-1)，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)pH值，維持Na+和Ca2+穩(wěn)態(tài)。心力衰竭(HF)時(shí)神經(jīng)內(nèi)分泌因子釋放，促進(jìn)心臟NHE-1 表達(dá)及活性增加，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)pH值增加，Na+、Ca2+超載，參與心肌重構(gòu)、心臟功能障礙[1～5]。給予NHE-1抑制劑可糾正HF心肌肥厚，改善心臟功能[6～10]。

心臟β-腎上素能受體(β-adrenergic receptor, β-AR)興奮，通過(guò)NHE-1途徑參與心肌肥厚及纖維化[1, 10]。研究證明心臟β-AR長(zhǎng)期激活后阻遏NHE-1，可延緩HF[10]。在β-AR激動(dòng)的初始階段即拮抗NHE-1以評(píng)價(jià)其對(duì)HF的療效，尚未有報(bào)道。因此，本研究應(yīng)用大劑量異丙腎上腺素(isoproterenol, ISO)建立HF動(dòng)物模型，早期應(yīng)用NHE-1高選擇性抑制劑cariporide(car)治療，觀察心臟結(jié)構(gòu)及功能變化[11]。

資料與方法

1.HF動(dòng)物模型建立及實(shí)驗(yàn)分組：44 只Wistar 雄性大鼠, 體質(zhì)量180～220g, 由哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。該實(shí)驗(yàn)獲得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。30 只大鼠腹部皮下注射 ISO (美國(guó)Sigma公司)，劑量為340mg/kg, 間隔24h，重復(fù)注射1次。注射ISO大鼠隨機(jī)分為HF組及HF+car組，每組15只。14只大鼠以相同方式腹部皮下注射0.9%NaCl注射液0.5ml，隨機(jī)分為對(duì)照組及對(duì)照+car組，每組7只。HF+car組、對(duì)照+car組自第3天起每日給予car(美國(guó)R&D生物公司)，劑量為30mg/kg，溶解于固定劑量飲用水中，保證每日喝完。HF組、對(duì)照組給予常規(guī)飲水，一共喂養(yǎng)8周。

2.心臟彩超檢查：8周后，大鼠給予戊巴比妥鈉(上海生物化學(xué)制藥廠)腹腔注射，劑量為40mg/kg。麻醉后取平臥位，應(yīng)用Vevo 770超聲心動(dòng)儀 (加拿大Visual sonics公司) 檢查。探頭置于左側(cè)胸前，取得規(guī)范的二維超聲心動(dòng)圖左心室長(zhǎng)軸切面，在此切面上將取樣線置于腱索水平獲得規(guī)范的M型超聲左心室波群，測(cè)量左心室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)、舒張末期內(nèi)徑(LVDd)，記錄左心室射血分?jǐn)?shù) (LVEF)、短軸縮短率(LVFS)。測(cè)量3個(gè)不同的心動(dòng)周期，每個(gè)指標(biāo)取均值。以LVEF<50%定義為HF模型成功。

3.測(cè)量左心室質(zhì)量/體質(zhì)量：分離出左心室, 用電子天平(浙江東新儀器設(shè)備有限公司)稱重, 計(jì)算左心室質(zhì)量/體質(zhì)量。

4.左心室病理檢查：以左心室室間隔中間段為基準(zhǔn)，截取該部位左心室橫截面, 以4%多聚甲醛溶液固定24h以上，常規(guī)石蠟包埋，均勻間斷切片5～10張，層厚4μm，行HE染色。石蠟切片脫蠟后行Masson膠原染色。用麗春紅酸性品紅液染色5～10min。蒸餾水沖洗，1%磷鉬酸溶液處理5min。直接用2%苯胺藍(lán)溶液復(fù)染5min。1%冰醋酸處理1min。用乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封閉。所用試劑為北京化學(xué)試劑公司提供。

5.心肌膠原測(cè)定：應(yīng)用病理圖像分析儀(Motic Image Advanced 3.0, 中國(guó)麥克奧迪實(shí)業(yè)有限公司)定量測(cè)定心肌膠原含量。Masson膠原染色顯示心肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色。鏡下調(diào)節(jié)灰度區(qū)別膠原和非膠原成分，選擇5個(gè)內(nèi)徑相近的小動(dòng)脈橫切面測(cè)量小動(dòng)脈周?chē)z原面積(PVCA)、管腔橫截面積(VLCA)，計(jì)算PVCA/VLCA[12]。在鏡下，心肌間質(zhì)膠原面積(ICVF)為心肌間質(zhì)無(wú)血管區(qū)域膠原面積與所測(cè)視野面積的百分比。每組選擇7個(gè)切片，每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，結(jié)果取均值。

結(jié) 果

1.HF動(dòng)物模型建立情況：8周后HF組大鼠存活9只，存活率為60%。HF+car組大鼠存活12只，存活率為80%。HF與HF+car組存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，HF組大鼠均存在活動(dòng)后呼吸頻率增快及幅度增加，食欲降低，運(yùn)動(dòng)減少。HF組與HF+car組心臟彩超檢查比較，LVEF均<50%，HF模型成功建立。

2.心臟彩超：對(duì)照組與對(duì)照+car組心臟彩超檢查比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，HF組及HF+car組LVDs、LVDd增加(P<0.05)，LVEF、LVFS降低(P<0.05)。與HF組比較，HF+car組上述指標(biāo)顯著改善(P<0.05)，詳見(jiàn)表1。

表1 心臟彩超結(jié)果

與對(duì)照組比較,*P<0.05; 與HF組比較,#P<0.05

3.左心室質(zhì)量/體質(zhì)量：對(duì)照組(1.63±0.23mg/g)與對(duì)照+car組(1.66±0.14mg/g)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HF組(2.03±0.18mg/g)、HF+car組(1.83±0.13mg/g)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，HF+car組顯著低于HF組(P<0.05)。

4.左心室HE和Masson膠原染色：對(duì)照組與對(duì)照+car組左心室HE和Masson膠原染色比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，HF組HE染色顯示心內(nèi)膜下心肌散在凝固性壞死，纖維形成；Masson膠原染色顯示心肌間質(zhì)、血管外周膠原沉積。與HF組比較，HF+car組左心室心肌壞死及膠原沉積顯著改善。HE染色見(jiàn)圖1，Masson膠原染色見(jiàn)圖2。

圖1 心肌HE染色(×400)A.對(duì)照組；B.對(duì)照+car組；C.HF組；D.HF+car組;對(duì)照組、對(duì)照+car組心肌纖維排列整齊，HF組↑箭頭所示心肌纖維壞死，箭頭所示膠原沉積;與HF組比較，HF+car組上述異常改善

圖2 心肌Masson膠原染色(×400)A.對(duì)照組；B.對(duì)照+car組；C.HF組；D.HF+car組;箭頭所示膠原為藍(lán)色,HF組心肌膠原沉積,與之比較，HF+car組膠原減少

5.心肌膠原定量分析：分析顯示對(duì)照組與對(duì)照+car組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HF組、HF+car組ICVF、PVCA/VLCA較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。HF+car組上述指標(biāo)顯著低于HF組(P<0.05)，詳見(jiàn)表2。

表2 心臟膠原定量分析

與對(duì)照組比較,*P<0.05; 與HF組比較,#P<0.05

討 論

大鼠皮下注射大劑量ISO，促進(jìn)體內(nèi)兒茶酚胺釋放增加，激動(dòng)心臟β-AR，出現(xiàn)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、氧化應(yīng)激等損傷，導(dǎo)致心肌急性壞死，進(jìn)而產(chǎn)生心肌重構(gòu)、心臟功能障礙[12，13]。ISO注射8周后存活大鼠出現(xiàn)HF癥狀，心肌病理顯示壞死、纖維化，左心室肥厚并擴(kuò)張以及收縮功能障礙，說(shuō)明HF模型成立。由于其病理生理改變近似特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病，是經(jīng)典的慢性HF動(dòng)物模型。

與對(duì)照組比較，對(duì)照+car組各項(xiàng)指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明car對(duì)正常大鼠心臟無(wú)影響。本研究證明早期應(yīng)用car治療HF大鼠，減輕心肌壞死、纖維化、左心室肥厚及擴(kuò)張，提高左心室收縮功能。既往研究拮抗NHE-1是在心臟β-AR長(zhǎng)期激動(dòng)后進(jìn)行[10]。與之不同，本研究大鼠連續(xù)2天注射ISO結(jié)束后第3天即給予car治療。8周后car延緩HF，這表明HF時(shí)干預(yù)NHE-1，適宜在早期階段進(jìn)行。

離體研究顯示,去甲基腎上腺素引起培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞蛋白合成增加, ET-1刺激培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞蛋白合成增加，這些都可以被NHE-1抑制劑阻斷，表明NHE-1是上述因子調(diào)控心肌肥厚的下游通路[14，15]。HF時(shí)心臟NHE-1活化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+超載。Na+內(nèi)流，激活蛋白激酶C。Ca2+作為細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的第二信使，激活絲裂原活化蛋白激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶, 這些途徑均導(dǎo)致心肌細(xì)胞增生、肥大[16]。car改善HF大鼠心肌肥厚可能源于糾正心肌細(xì)胞Na+、Ca2+分布異常。car縮小壓力負(fù)荷及容量負(fù)荷過(guò)重所致HF的兔子心肌細(xì)胞長(zhǎng)度及寬度，揭示了其逆轉(zhuǎn)左心室重構(gòu)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[6]。

心臟β-AR激活促進(jìn)心肌纖維化[17]。car減少HF大鼠心肌膠原沉積，表明NHE-1參與了β-AR激動(dòng)所致的心肌纖維化。研究證實(shí)NHE-1抑制劑逆轉(zhuǎn)不同原因所致HF時(shí)心肌纖維化[3, 4, 9, 10]。β1-AR轉(zhuǎn)基因小鼠顯示心肌肥大、纖維化、收縮功能降低，心臟NHE-1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯上升[10]。采用car治療該動(dòng)物模型，阻遏了心肌纖維化及肥大, 同樣證實(shí)NHE-1活化是β-AR激動(dòng)導(dǎo)致心肌肥大和纖維化的必要途徑。

HF時(shí)各種神經(jīng)內(nèi)分泌因子激活，通過(guò)NHE-1途徑激活復(fù)雜的下游通路，參與心肌重構(gòu)。本研究揭示早期拮抗NHE-1能延緩HF，為HF治療提供新靶點(diǎn)。