炎癥相關(guān)細(xì)胞因子及趨化因子在小鼠自身免疫性肝損傷不同時(shí)期的表達(dá)及作用

艾 國(guó) 雒真龍 張志成 王 鳴

細(xì)胞因子的合成和代謝，相互之間的拮抗或協(xié)同效益等在免疫和炎性反應(yīng)中扮演重要角色，并與肝臟病理?yè)p傷密切相關(guān)[1，2]。促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子在肝臟中的過(guò)度表達(dá)可造成炎癥過(guò)程，是肝臟炎癥疾病的驅(qū)動(dòng)力量之一，而具有募集免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子作用的趨化因子亦可能參與其中。近年來(lái)的研究已經(jīng)闡明一些重要的細(xì)胞因子在慢性肝臟疾病(如慢乙肝、脂肪肝、酒精肝、原發(fā)性膽汁性肝硬化等)中的作用，也有研究者關(guān)注了部分細(xì)胞因子在自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)發(fā)病中的作用，但是目前對(duì)自身免疫性肝炎的不同狀態(tài)下和肝臟內(nèi)環(huán)境中促炎性、抗炎性以及趨化因子這3類細(xì)胞因子的水平變化和相互關(guān)系的研究尚不多見(jiàn)[3～6]。為此，筆者選取并檢測(cè)了促炎性細(xì)胞因子IL-6 和TNF-α，抗炎性細(xì)胞因子IL-10，以及趨化因子CXCL10在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肝炎(experimental autoimmune hepatitis，EAH)小鼠發(fā)病期和緩解期中的表達(dá)水平差異和相互關(guān)系，探討自身免疫性肝損傷的機(jī)制，以期為自身免疫性肝炎的早期診斷和及時(shí)治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.動(dòng)物:雌性SPF級(jí)C57BL/6小鼠40只，4～6周齡，體質(zhì)量20～22g，購(gòu)買并飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，供給無(wú)菌飲水及清潔飼料，適應(yīng)環(huán)境溫度及濕度。

2.主要試劑:PCR擴(kuò)增引物(武漢大風(fēng)生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成)；RT-PCR試劑盒(日本東洋紡公司)；IL-6、TNF-α、 IL-10和CXCL10 ELISA試劑盒(達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；弗氏完全佐劑(美國(guó)Sigma公司)；組織蛋白抽提劑(武漢賽維爾生物有限公司)。

3.動(dòng)物模型建立及分組:將小鼠隨機(jī)分為模型組和正常對(duì)照組，每組各20只；按照造模型方法建立EAH模型[7]。造模后第2周及6周，每組取6只小鼠，乙醚吸入麻醉后，眼眶動(dòng)脈采取外周血，靜置離心后取血清，檢測(cè)轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST水平；小鼠處死后，取肝組織一部分予以4%甲醛固定，行石蠟包埋切片和HE染色，然后光鏡下閱片觀察肝組織的病理改變情況；一部分快速凍存于液氮中以提取總RNA和組織蛋白。

4.real-time PCR檢測(cè)肝組織炎性相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子的mRNA表達(dá)水平：采用TRIzol試劑等提取肝組織總RNA，定量反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后用SYBR GreenⅠ熒光染料技術(shù)在25μl PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)：內(nèi)參：GADPH：5′-CAGTGCCAGCCTCTGCTCAT-3′(上游引物)，5′-ATACTCAGCACCAGCACAT-3′(下游引物)；IL-6：5′-GACAAAGCCAGAGTCCTTCAGAGAGATACAG-3′(上游引物)，5′-TTGGATGGTCTTGGTCCTTAGCCAC-3′(下游引物)；TNF-α：5′-CCACCACGCTCTTCTGTCTACTG-3′(上游引物)，5′-GCCATAGAACTGATGAGAGG-3′(下游引物)；IL-10：5′-AACATACTGCTAACCGACTC-3′(上游引物), 5′-ATGCTCCTTGATTTCTGG-3′(下游引物)；CXCL10：5′-CCAAGTGCTGCCGTCATTTTC-3′(上游引物)，5′-GGCTCGCAGGGATGATTTCAA-3′(下游引物)。real-time PCR反應(yīng)條件：95℃ 1min，95℃ 15s，58℃ 20s，72℃ 40s，主循環(huán)40次，采用2-△△CT法，通過(guò)所獲循環(huán)閾值(Ct)計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。

5.ELISA法檢測(cè)肝組織炎性相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子蛋白表達(dá)水平:稱取50mg肝組織加入400μl含有PMSF的組織蛋白抽提液中，電動(dòng)勻漿后，2000r/min離心10min，提取上層清液即組織蛋白液，用ELISA試劑盒依照說(shuō)明書步驟檢測(cè)肝組織勻漿中IL-6、TNF-α、IL-10和CXCL10的含量，酶標(biāo)儀450nm檢測(cè)待測(cè)樣本，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程，然后將樣本的吸光度值代入回歸方程，得到濃度值。

結(jié) 果

1.小鼠肝臟病理學(xué)改變:EAH組小鼠在建模后2周即發(fā)病期，肝臟HE染色顯示較多淋巴細(xì)胞在血管周圍和匯管區(qū)等部位浸潤(rùn)，肝細(xì)胞部分出現(xiàn)局灶性壞死，炎性反應(yīng)較明顯(圖1B)；而在緩解恢復(fù)期(6周)，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)以及肝細(xì)胞的壞死程度較2周減輕(圖1C)。正常小鼠肝臟HE染色則如圖1A所示。

2.小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平改變：EAH小鼠的ALT和AST水平在2周時(shí)較正常對(duì)照組(0周)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，兩者的升高與肝臟病理改變程度相一致。在6周時(shí)的ALT 水平較正常對(duì)照組略高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AST 水平則仍較正常對(duì)照組偏高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖1 小鼠肝臟病理改變(HE染色，×400)A.正常對(duì)照組；B.EAH組2周；C.EAH組6周

圖2 各組小鼠血清ALT、AST的生化檢測(cè)結(jié)果*P<0.05，**P<0.01

3.小鼠肝臟炎癥相關(guān)細(xì)胞因子及趨化因子mRNA水平變化:通過(guò)real-time PCR檢測(cè)觀察到， EAH小鼠肝臟組織IL-6(P=0.035)、TNF-α(P=0.047)、IL-10(P=0.032)和CXCL10(P=0.028)在2周時(shí)mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯增高，在6周時(shí)的IL-6(P=0.047)和IL-10(P=0.016)的mRNA表達(dá)水平仍稍高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TNF-α(P=0.082)和CXCL10(P=0.061)的mRNA表達(dá)水平略高于正常對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2周與6周之間比較，EAH小鼠肝組織IL-6 (P=0.080)、TNF-α (P=0.082)、IL-10(P=0.058)的mRNA表達(dá)水平下降但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CXCL10 mRNA水平下降(P=0.047)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖3 小鼠肝臟炎癥相關(guān)細(xì)胞因子及趨化因子mRNA水平變化*P<0.05

4.小鼠肝臟炎癥相關(guān)細(xì)胞因子及趨化因子蛋白水平變化：通過(guò)ELISA法檢測(cè)觀察到，EAH小鼠肝臟組織IL-6(P=0.004)、TNF-α(P=0.038)、IL-10(P=0.043)和CXCL10(P=0.035) 在2周時(shí)蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯增高，在6周時(shí)的IL-6(P=0.006)、TNF-α(P=0.015)和IL-10(P=0.045)的蛋白表達(dá)水平仍高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CXCL10(P=0.560)的蛋白表達(dá)水平略高于正常對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2周與6周之間比較，EAH小鼠肝組織IL-6 (P=0.015)和CXCL10 (P=0.040)的蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TNF-α(P=0.137)、IL-10(P=0.180) 的蛋白表達(dá)水平下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

圖4 小鼠肝臟炎癥相關(guān)細(xì)胞因子及趨化因子蛋白水平變化*P<0.05,**P<0.01

5.相關(guān)性分析：Pearson相關(guān)分析顯示，EAH小鼠肝組織勻漿中CXCL10與IL-6、TNF-α、IL-10均呈正相關(guān)(r分別為0.8214、0.8910、0.8504，P均<0.05)；IL-10與 IL-6、TNF-α均呈正相關(guān)(r分別為 0.9644、0.8897，P均<0.05)。

討 論

自身免疫性肝炎是異常的自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷和肝實(shí)質(zhì)炎性病變，目前在肝病方面關(guān)于相關(guān)細(xì)胞因子的研究結(jié)果尚存在一定差異，尤其在自身免疫性肝炎的細(xì)致變化仍具有一定研究空間。結(jié)合既往文獻(xiàn)，本研究選取部分細(xì)胞因子并就其在EAH中的表達(dá)變化進(jìn)行了探索分析。

研究結(jié)果顯示，在EAH發(fā)病期，肝臟內(nèi)的IL-6在mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高，同時(shí)伴隨血清轉(zhuǎn)氨酶升高和肝臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加。IL-6作為一種重要的炎性細(xì)胞因子，在宿主防御、調(diào)控B細(xì)胞、活化自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)、參與炎性反應(yīng)進(jìn)程中均發(fā)揮重要作用[8]。盡管其表達(dá)調(diào)控遵循轉(zhuǎn)錄機(jī)制，一旦轉(zhuǎn)錄后機(jī)制失調(diào)，持續(xù)產(chǎn)生的IL-6卻對(duì)慢性炎癥及自身免疫性疾病具有病理作用[9]。IL-6可通過(guò)gp130 激活JAK/STAT 信號(hào)通路介導(dǎo)炎性反應(yīng)[10]。IL-6/STAT3信號(hào)通路可招募并活化中性粒細(xì)胞(PMN)，經(jīng)過(guò)趨化、黏附，滲出血管壁浸潤(rùn)至肝實(shí)質(zhì)內(nèi)的PMN活化，可引起肝細(xì)胞的損傷[11]。已有臨床研究表明，慢性肝臟疾病、肝硬化患者血清IL-6水平的持續(xù)升高，對(duì)肝臟組織造成不良后果[6]。本研究顯示，IL-6的表達(dá)在緩解期雖有下降仍高于正常水平，這也說(shuō)明持續(xù)的IL-6表達(dá)可作用于整個(gè)自身免疫性炎癥發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程。

與IL-6的表達(dá)變化類似，筆者發(fā)現(xiàn)促炎細(xì)胞因子TNF-α亦表現(xiàn)為發(fā)病期表達(dá)水平均升高，在緩解期隨著血清轉(zhuǎn)氨酶水平下降和肝內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，TNF-α的表達(dá)水平雖較發(fā)病期有所下降，但基本仍然高于正常水平。TNF-α主要是由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌，可觸發(fā)TNF-α和IL-6本身的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。TNF-α在機(jī)體的炎性反應(yīng)和免疫調(diào)控中具有較為重要的功能，即活化巨噬細(xì)胞、增加細(xì)胞毒性、抑制B細(xì)胞的激活及抗體的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)HLAⅡ類分子和黏附分子的表達(dá)，以及促進(jìn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)等。TNF-α的這些生物學(xué)效應(yīng)能夠加重機(jī)體自身免疫反應(yīng)，從而令自身免疫性疾病進(jìn)展加速[12]。在關(guān)于Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子與AIH相關(guān)性的研究中發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞的數(shù)量及分泌的細(xì)胞因子如IL-6和TNF-α等增加與肝臟炎癥和纖維化嚴(yán)重程度有關(guān)[13]。這也與筆者在EAH模型中觀察到的結(jié)果基本相符。結(jié)合本研究觀察結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，筆者推測(cè)IL-6及TNF-α作用于整個(gè)自身免疫性炎癥發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程，可作為炎性反應(yīng)的敏感指標(biāo)，亦是疾病進(jìn)展的重要影響因素。

IL-10是具有抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)、促進(jìn)體液免疫反應(yīng)和抗炎功能的細(xì)胞因子，在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[14]。IL-10可抑制單核細(xì)胞生成TNF-α、IL-1、IL-6、IFN-γ等細(xì)胞因子，刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-1受體拮抗劑，發(fā)揮抗炎功能[15]。本研究顯示，EAH小鼠肝臟IL-10的表達(dá)水平從發(fā)病期至緩解期均高于正常，且伴隨IL-6及TNF-α變化而變化，相關(guān)性分析顯示IL-10與 IL-6、TNF-α均呈正相關(guān)，而并非負(fù)相關(guān)，推測(cè)IL-10表達(dá)水平的這種變化可能為機(jī)體維持免疫平衡的代償性改變。以上幾種促炎性細(xì)胞因子與抗炎性細(xì)胞因子的表達(dá)變化和關(guān)系如上所述，那么跟兩者密切相關(guān)的趨化因子的表達(dá)狀況又會(huì)是如何？

趨化因子家族在肝臟微環(huán)境中關(guān)于細(xì)胞之間的信號(hào)調(diào)節(jié)方面的研究已逐漸受到重視[16]。其中CXCL家族可在某些自身免疫性疾病中發(fā)揮明顯的促炎效應(yīng)，如原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血和肝組織中CXCL9和CXCL10表達(dá)水平顯著增加，且隨疾病進(jìn)展而升高[17]。而在本研究中EAH小鼠肝臟內(nèi)CXCL10表達(dá)水平表現(xiàn)為在發(fā)病期增高，緩解期則下降。趨化因子本身能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞相結(jié)合，具有激活并趨化白細(xì)胞移動(dòng)的作用[18]。趨化因子信號(hào)系統(tǒng)對(duì)于效應(yīng)細(xì)胞和調(diào)節(jié)細(xì)胞的募集有關(guān)鍵作用，參與肝臟免疫性疾病的發(fā)生[19]。本研究中EAH小鼠肝臟內(nèi)CXCL10表達(dá)水平與IL-6、TNF-α、IL-10均呈正相關(guān)，表明CXCL10在自身免疫性肝炎中可能既募集表達(dá)促炎性細(xì)胞因子又能募集表達(dá)抗炎性細(xì)胞因子的免疫細(xì)胞，參與肝臟炎癥活動(dòng)，某種程度上可能具有雙向調(diào)節(jié)的作用。

綜上所述，促炎性細(xì)胞因子、抗炎性細(xì)胞因子及趨化因子等細(xì)胞因子形成錯(cuò)綜復(fù)雜的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，作用于肝臟并影響肝臟疾病發(fā)生、發(fā)展；理解這些細(xì)胞因子在疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的變化和作用，對(duì)于闡釋AIH的肝損傷機(jī)制具有重要意義；針對(duì)細(xì)胞因子的分子靶向治療也為肝臟疾病提供了新的診療思路和干預(yù)手段。