DPPA2和Cyclin H在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

徐紀(jì)偉 孫丹華

胃癌是我國消化系統(tǒng)疾病中最常見的惡性腫瘤。在胃癌早期沒有臨床特異性癥狀及體征，導(dǎo)致臨床診斷非常困難。當(dāng)發(fā)現(xiàn)胃癌時(shí)已經(jīng)成為進(jìn)展期腫瘤，腫瘤細(xì)胞早已出現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移，臨床治療效果不理想，患者預(yù)后較差，生存率較低。

細(xì)胞周期蛋白H的穩(wěn)定表達(dá)能激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent-kinases，CDK)復(fù)合物發(fā)生磷酸化，從而精確調(diào)控細(xì)胞的整個(gè)生長、分裂及增殖的過程，若細(xì)胞周期蛋白H出現(xiàn)異常表達(dá)情況就會(huì)造成細(xì)胞周期進(jìn)程失控的局面，刺激細(xì)胞不斷發(fā)生分裂出現(xiàn)無限制的增殖情況，最終會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)惡性腫瘤。

多能性相關(guān)基因2 (developmental pluripotency associated gene 2，DPPA2)是近幾年在多能性細(xì)胞中新發(fā)現(xiàn)的特異表達(dá)基因，與機(jī)體發(fā)育過程中細(xì)胞的多能性密切相關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞增殖、部分腫瘤以及胚胎發(fā)育過程中DPPA2呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，而在細(xì)胞分化過程中DPPA2卻呈現(xiàn)逐漸減少趨勢，直到成體組織中呈現(xiàn)出不表達(dá)或微弱表達(dá)。DPPA2存在著進(jìn)化保守序列SAP結(jié)構(gòu)域，可以介導(dǎo)蛋白與特異的DNA結(jié)合，還可以作為轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合靶基因的啟動(dòng)子區(qū)，通過表觀遺傳調(diào)控胚胎干細(xì)胞的染色體結(jié)構(gòu)重塑、細(xì)胞核構(gòu)建及RNA代謝過程[1,2]。目前有關(guān)發(fā)育多能性相關(guān)基因2和細(xì)胞周期蛋白H的研究還沒有涉及到胃癌組織，需要對此開展深入的研究報(bào)道。

本研究測定組織內(nèi)DPPA2和Cyclin H的表達(dá)情況，分析DPPA2和Cyclin H與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，探討其在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中內(nèi)在關(guān)系。

材料與方法

1.材料:60例胃癌組織和對應(yīng)癌旁組織(距離邊緣2cm)均來自漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院2010年5月～2015年5月期間就診的患者。其中，男性36例，女性24例，患者年齡26～77歲，平均年齡是52.5±2.5歲，按照WHO胃癌組織學(xué)分類分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將樣本歸類如下：分化程度：高分化13例，中分化19例，低分化28例；腫瘤直徑分級(jí)：<5cm有27例，≥5cm有33例；浸潤深度：黏膜下6例，淺肌層15例，深肌層28例，外膜11例。手術(shù)前所有患者均沒有經(jīng)過任何化學(xué)藥物治療及放射性治療，通過手術(shù)切除腫瘤組織后，經(jīng)病理診斷證實(shí)為胃癌。本研究所有實(shí)驗(yàn)均通過漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)通過，標(biāo)本采集和研究過程均符合赫爾辛基宣言。所有患者均明確本研究內(nèi)容并簽署知情同意書。

2.主要試劑和儀器：羊抗人DPPA2多克隆抗體、鼠抗人Cyclin H多克隆抗體(美國圣魯克茲生物公司)，兔抗人β-actin多克隆抗體、生物素標(biāo)記羊抗兔抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，生物素標(biāo)記兔抗山羊抗體、生物素標(biāo)記馬抗鼠抗體、ABC試劑(北京中杉生物技術(shù)有限公司)，RM2235型切片機(jī)(德國Leica公司)。

3.免疫組化：將切片先放置100μl的10%小牛血清封閉，室溫放置30min，切片滴加羊抗人DPPA2多克隆抗體(1∶300倍稀釋)或鼠抗人Cyclin H多克隆抗體(1∶100倍稀釋)，4℃過夜，用PBS洗除一抗，再加入生物素標(biāo)記兔抗山羊抗體或生物素標(biāo)記馬抗鼠抗體，室溫放置30min，用PBS洗除二抗，加入ABC 試劑，DAB 染色。陰性對照不加入一抗，只加入二抗。

4.Western blot法檢測：蛋白樣品上樣，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)到PVDF，置脫脂奶粉(50g/L)TBST液中2h，用TBS漂洗，加入DPPA2多克隆抗體、Cyclin H多克隆抗體、β-actin多克隆抗體(1∶1000)，4℃放置12h，用TBS洗除一抗，加入生物素標(biāo)記兔抗山羊抗體或生物素標(biāo)記馬抗鼠抗體或生物素標(biāo)記羊抗兔抗體(1∶1000)，放置2h，用TBS洗除二抗，加入ABC試劑，避光放置1h，用TBS漂洗，加入DAB，查看結(jié)果，測目的條帶與β-actin條帶灰度比值。

5.免疫組化結(jié)果判定:切片DPPA2或Cyclin H細(xì)胞染色強(qiáng)度分級(jí)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞基本沒顏色記0分，呈淺黃色記1分，呈棕黃色記2分，呈棕褐色記3分。切片陽性細(xì)胞百分比分級(jí)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：200倍陽性細(xì)胞率<10%記0分，10%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。將切片內(nèi)DPPA2或Cyclin H染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比評分相乘，≤1分是陰性表達(dá)，1～3(不含1)分是低水平表達(dá)，>3分是高水平表達(dá)。

6.Western blot法結(jié)果判定:應(yīng)用圖像分析軟件對Western blot法檢測條帶進(jìn)行密度掃描，通過測定DPPA2、Cyclin H和β-actin的條帶灰度值，計(jì)算各種組織的DPPA2和Cyclin H蛋白相對表達(dá)量，相對表達(dá)量=A目的蛋白/Aβ-actin×100%。

結(jié) 果

1.免疫組化檢測DPPA2和Cyclin H表達(dá):通過對胃癌組織、對應(yīng)癌旁組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)DPPA2主要出現(xiàn)于細(xì)胞核，Cyclin H主要出現(xiàn)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。DPPA2和Cyclin H在胃癌組織內(nèi)的表達(dá)水平均明顯高于癌旁組織，DPPA2和Cyclin H在胃癌組織中的陽性率分別為91.7%(55/60)和90.0%(54/60)，而兩者在對應(yīng)癌旁組織中的陽性率分別為8.30%(5/60)和6.67%(4/60)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=80.056，P=0.000；χ2=83.705，P=0.000)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，胃癌組織中DPPA2與Cyclin H蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.754，P=0.029,圖1)。

圖1 免疫組化檢測DPPA2和Cyclin H在兩種組織中的表達(dá)(×400)A.胃癌組織中DPPA2的表達(dá)；B.癌旁組織中DPPA2的表達(dá)；C.胃癌組織中Cyclin H的表達(dá)；D.癌旁組織中Cyclin H的表達(dá)

2.Western blot法檢測DPPA2和Cyclin H的表達(dá):Western blot法檢測得到的PVDF膜在對應(yīng)的分子量區(qū)域(38kDa)可以觀察到一條抗原條帶，即檢測的Cyclin H組織蛋白條帶，在對應(yīng)的相對分子質(zhì)量區(qū)域(34kDa)可以觀察到另一條抗原條帶，即檢測的DPPA2組織蛋白條帶。通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)胃癌組織中DPPA2和Cyclin H呈現(xiàn)明顯的高水平表達(dá)，而癌旁組織中發(fā)現(xiàn)他們呈現(xiàn)少量表達(dá)(P<0.01)，和免疫組化的結(jié)果一致(圖2)。

圖2 DPPA2和Cyclin H相對值1、3、5分別為3例患者的癌組織；2、4、6分別為3例患者的癌旁組織

3.DPPA2和Cyclin H表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系：DPPA2蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理資料的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，DPPA2蛋白與腫瘤分化(χ2=9.706，P=0.046)、浸潤深度(χ2=7.376，P=0.025)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=8.205，P=0.017)呈顯著相關(guān)性，而與性別(χ2=3.749，P=0.153)、年齡(χ2=0.523，P=0.770)、腫瘤直徑(χ2=0.302，P=0.860)和TNM分期(χ2=3.579，P=0.167)無相關(guān)性。Cyclin H蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Cyclin H蛋白與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=6.101，P=0.047)呈顯著相關(guān)性，而與性別(χ2=0.741，P=0.690)、年齡(χ2=2.048，P=0.359)、腫瘤直徑(χ2=1.414，P=0.493)、腫瘤分化(χ2=4.556，P=0.336)、浸潤深度(χ2=0.600，P=0.741)和TNM分期(χ2=1.026，P=0.599)無相關(guān)性(表1)。

討 論

細(xì)胞周期蛋白H在廣泛分布于真核細(xì)胞中，是一種含323個(gè)氨基酸殘基、分子量為38kDa的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，分子結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)A螺旋，但是沒有B片層，與周期蛋白C具有明顯同源性，通過結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶7形成CDK活化激酶復(fù)合物而發(fā)揮生物學(xué)作用，保持細(xì)胞進(jìn)行正常分裂增殖[3]。同時(shí)細(xì)胞周期蛋白H還是轉(zhuǎn)錄因子ⅡH亞基的組成部分，參與細(xì)胞周期調(diào)控、Ⅱ型轉(zhuǎn)錄和核苷酸切除修復(fù)。目前研究表明，細(xì)胞周期蛋白H在子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌以及惡性黑色素瘤等多種惡性腫瘤細(xì)胞中均出現(xiàn)明顯表達(dá)，并且它的表達(dá)水平可達(dá)到非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的1.4～3.0倍，與此同時(shí)相應(yīng)CDK活化激酶的抑制因子表達(dá)水平則出現(xiàn)明顯下降，導(dǎo)致大量的CDK活化激酶出現(xiàn)異常激活，進(jìn)而整個(gè)細(xì)胞周期調(diào)控過程失衡，細(xì)胞周期的頻率加快，最終促使細(xì)胞出現(xiàn)大量分裂增殖情況，因此細(xì)胞周期蛋白H異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要意義。

筆者研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中有大量Cyclin H的表達(dá)，這是由于Cyclin H是CDK活化激酶復(fù)合物重要的調(diào)節(jié)亞基，腫瘤組織中過度表達(dá)可以縮短細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞增殖。CDK活化激酶復(fù)合物是由Cyclin H、

表1 DPPA2和Cyclin H表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

CDK7和MAT1結(jié)合成的復(fù)合體，其中CDK7作為催化亞單位、Cyclin H作為調(diào)節(jié)亞單位，Cyclin H激活CDK7并結(jié)合形成異源二聚體，再與MAT1的結(jié)合促使活性進(jìn)一步提高[4]。Cyclin H高表達(dá)狀態(tài)可以合成大量CDK活化激酶復(fù)合物，促使細(xì)胞快速通過細(xì)胞周期調(diào)控的限定點(diǎn)，通過磷酸化有絲分裂型細(xì)胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin B，促使細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期，還可激活G1期細(xì)胞周期蛋CDK2/Cyclin E2，釋放E2F2轉(zhuǎn)錄因子，遺傳物質(zhì)DNA呈現(xiàn)高轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，促使細(xì)胞自G1期進(jìn)入S期，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期縮短、加快細(xì)胞增殖[5]。同時(shí)Cyclin H還可以通過促使RNA聚合酶Ⅱ大亞基發(fā)生磷酸化，從而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期過程、mRNA基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄和核苷酸切除修復(fù)的生物學(xué)作用。此外有研究表明Cyclin H過表達(dá)可以明顯促進(jìn)黏著斑激酶FAK磷酸化，與胞質(zhì)內(nèi)相應(yīng)的功能蛋白發(fā)生相互作用，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的黏附能力下降，容易發(fā)生遷移；若是抑制Cyclin H表達(dá)則會(huì)抑制黏著斑激酶FAK磷酸化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的黏附能力，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，這與筆者的研究結(jié)果一致[6]。

人DPPA2基因定位于第3號(hào)染色體上，包括9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，其cDNA編碼區(qū)長度為1393kb，主要編碼由298個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。DPPA2的氨基端存在著進(jìn)化保守序列SAP結(jié)構(gòu)域，它由35個(gè)氨基酸殘基組成，包括疏水氨基酸和極性氨基酸兩部分，有研究表明SAP結(jié)構(gòu)域剔除后，ZAR1L表達(dá)受到抑制，會(huì)導(dǎo)致受精卵分裂到2細(xì)胞期就停止，同時(shí)組蛋白去甲基化及染色體結(jié)構(gòu)的重新組織構(gòu)建，最終生殖細(xì)胞發(fā)育停滯[7]。此外，多能性細(xì)胞從細(xì)胞增殖到細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)換過程中要經(jīng)歷染色質(zhì)調(diào)節(jié)、非編碼RNA和組蛋白修飾，需要有esBAF染色質(zhì)重塑復(fù)合體等表觀遺傳學(xué)因子參與，復(fù)合體含有Brg1和BAF155的蛋白產(chǎn)物，是多能性細(xì)胞的核心基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)組成部分[8]。DPPA2可以結(jié)合Brg1和BAF155，與染色質(zhì)重塑復(fù)合體相互作用，抑制多能性細(xì)胞分化，參與細(xì)胞多能性的表觀遺傳調(diào)控[9]。研究人員發(fā)現(xiàn)在成肌細(xì)胞分化階段MyoD可以促使長鏈非編碼RNA大量出現(xiàn)，長鏈非編碼RNA引導(dǎo)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt1結(jié)合到DPPA2的啟動(dòng)子區(qū)域，將其CpG島甲基化，最終沉默DPPA2表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分化，這從另一方面說明DPPA2對抑制細(xì)胞分化有重要作用[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌組織中的腫瘤相關(guān)抗原PLAC1(CT92)及DPPA2均呈現(xiàn)陽性表達(dá)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)DPPA2陽性表達(dá)部位與腫瘤干細(xì)胞增殖分化高度依賴干細(xì)胞niche位于相同區(qū)域，這些情況說明在腫瘤干細(xì)胞內(nèi)DPPA2是一類腫瘤相關(guān)抗原，成為腫瘤抗原特異性免疫治療的新靶點(diǎn)[11]。研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞經(jīng)過丁酸誘導(dǎo)處理后，可以促使組蛋白H3發(fā)生乙?；?，誘導(dǎo)多能性相關(guān)基因啟動(dòng)子DNA發(fā)生去甲基化，從而大大提升了DPPA2表達(dá)水平，從而高效促進(jìn)重編程的進(jìn)行，因此DPPA2作為一種染色質(zhì)重塑因子，在體細(xì)胞重編程過程中由沉默狀態(tài)轉(zhuǎn)為激活狀態(tài)，促使細(xì)胞表觀遺傳信息改變，從而導(dǎo)致成體細(xì)胞重新轉(zhuǎn)為多能性干細(xì)胞的狀態(tài)[12]。另外采用染色質(zhì)修飾劑曲古菌素A和5-氮胞苷處理神經(jīng)球細(xì)胞，可以促使包括DPPA2在內(nèi)的多種干細(xì)胞多能性相關(guān)基因呈現(xiàn)高水平表達(dá)，加強(qiáng)組蛋白乙?；虳NA去甲基化，最終激發(fā)神經(jīng)球細(xì)胞的分化潛能，導(dǎo)致其橫向分化出造血能力[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，在通過對綿羊慢病毒易感性基因篩選過程中發(fā)現(xiàn)DPPA2的SNP位點(diǎn)和慢病毒感染率高度相關(guān)，這是由于DPPA2存在于精液和生殖道中，通過垂直傳播參與慢病毒的感染過程[14]。此外研究人員還通過染色體免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)技術(shù)中發(fā)現(xiàn)DPPA2出現(xiàn)于胚胎發(fā)育早期，DPPA2在胚胎干細(xì)胞中與Nkx2-5的調(diào)節(jié)區(qū)域結(jié)合，對肺部的生長發(fā)育有重要作用，還參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育與功能維持[15]。因此DPPA2既可以通過生殖系統(tǒng)參與慢病毒感染，還可以通過調(diào)控免疫系統(tǒng)和白細(xì)胞的形成參與慢病毒感染[16]。DPPA2可以通過結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平，或通過表觀遺傳方式調(diào)控染色體結(jié)構(gòu)的組織構(gòu)建，或在腫瘤干細(xì)胞內(nèi)DPPA2作為腫瘤相關(guān)抗原大量表達(dá)，或是作為染色質(zhì)重塑因子，在體細(xì)胞重編程過程中由沉默狀態(tài)轉(zhuǎn)為激活狀態(tài)，促使體細(xì)胞重新轉(zhuǎn)為多能性干細(xì)胞，DPPA2由于具有干細(xì)胞的多能性，所以研究人員常將其應(yīng)用于細(xì)胞鑒定。

筆者研究發(fā)現(xiàn)在低分化胃癌組織中DPPA2大量表達(dá)，這是由于DPPA2的編碼蛋白主要定位于細(xì)胞核中，由核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白KPNA7介導(dǎo)DPPA2基因，激活細(xì)胞堿性磷酸酶活化，促進(jìn)SOX2/OCT4干性調(diào)節(jié)復(fù)合物形成，增強(qiáng)NANOG表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，減少FST、PSX1等早期分化標(biāo)志基因表達(dá)，抑制細(xì)胞分化。已有研究發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育過程中，隨著細(xì)胞增殖減少而細(xì)胞逐漸開始轉(zhuǎn)入分化階段，DPPA2的表達(dá)也開始發(fā)生下調(diào)，這與本研究結(jié)果相結(jié)合，更進(jìn)一步證實(shí)了DPPA2主要是促進(jìn)細(xì)胞增殖而抑制細(xì)胞分化。

目前研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎干細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK2可以激活SOX2發(fā)生磷酸化，通過調(diào)節(jié)OCT4、KLF4誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞重編程為多能性細(xì)胞[17]。該作用在重編程過程中建立多能性狀態(tài)是必需的，但是不能維持多能性細(xì)胞的發(fā)育，因此通過CDK2蛋白介導(dǎo)的SOX2磷酸化僅促進(jìn)細(xì)胞多能性狀態(tài)的建立，而不能促進(jìn)細(xì)胞發(fā)育[18]。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中Cyclin H有大量表達(dá)，推測它可以通過CDK2介導(dǎo)SOX2大量磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞多能性狀態(tài)的建立，同時(shí)Cyclin H大量表達(dá)還可以促使細(xì)胞自G1期快速進(jìn)入S期，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期縮短、調(diào)控細(xì)胞增殖，并且SOX2大量激活，也可以促進(jìn)E2F2轉(zhuǎn)錄因子釋放，更進(jìn)一步激活CDX1/2，最終反饋促進(jìn)DPPA2大量表達(dá)[19]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中NANOG、OCT4陽性表達(dá)水平越高表明腫瘤細(xì)胞分化程度越低，惡性度越高，并且NANOG、OCT4大量表達(dá)可以通過調(diào)節(jié)MMP2降解細(xì)胞外間質(zhì)中的各種蛋白成分，重組細(xì)胞骨架，減少細(xì)胞黏附和促進(jìn)細(xì)胞遷移，可見NANOG、OCT4的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的惡性程度及轉(zhuǎn)移趨勢是呈正相關(guān)的。本研究發(fā)現(xiàn)在低分化和有淋巴轉(zhuǎn)移的胃癌組織中DPPA2大量表達(dá)，推論它主要是通過促進(jìn)NANOG、OCT4陽性表達(dá)水平升高，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞分化度低且容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。

DPPA2和Cyclin H在人胃癌組織中呈現(xiàn)高水平表達(dá)，對胃癌的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后具有重要意義，可以作為胃癌惡性程度和預(yù)后不良的標(biāo)志，在臨床診斷治療方面具有重要指導(dǎo)意義，但是胃癌的具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚，希望在以后的研究中能夠?qū)PPA2和Cyclin H進(jìn)行更加深入地了解。