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    酶解對(duì)豆腐干凝膠結(jié)構(gòu)和理化特性的影響

    2020-03-31 04:29:30陳凡凡吳長(zhǎng)玲郭增旺王中江
    食品科學(xué) 2020年5期
    關(guān)鍵詞:豆腐干二硫鍵巰基

    陳凡凡,滕 飛,韓 松,吳長(zhǎng)玲,周 艷,郭增旺,王中江,李 楊

    (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

    豆腐干是休閑食品中最具代表性的豆制品之一,其富含人體所必需的8 種氨基酸、不飽和脂肪酸、卵磷脂、礦物質(zhì)(鈣、鐵、磷)及VB等,具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。與傳統(tǒng)豆腐相比,豆腐干的保藏期更長(zhǎng),味道咸香爽口,硬中帶韌,是常見(jiàn)于中國(guó)各大菜系中的一道美食[2],在豆制品中占據(jù)相當(dāng)大的比重。

    傳統(tǒng)的豆腐干制作主要包括清洗、浸泡、制漿、煮漿、點(diǎn)鹵、破腦、壓坯、劃坯和晾干等工序。其中,制漿是豆腐干生產(chǎn)的重要工序,直接影響豆腐干的出品率和產(chǎn)品特性。目前,制漿工藝主要包括干法和濕法兩種。干法制漿主要利用高速旋轉(zhuǎn)葉輪的沖擊力,使物料以極高速率與靜刀片產(chǎn)生碰撞、剪切、摩擦,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)物料的粉碎,這種制漿工藝對(duì)設(shè)備要求高、能耗高、處理量小,粉碎后存在纖維顆粒粒度大、粉碎效率低以及引起豆?jié){口感不細(xì)膩等問(wèn)題[3]。而濕法制漿工藝主要是借助膠體磨、超聲波和高壓均質(zhì)進(jìn)行制備,通過(guò)減小豆?jié){的粒徑,使其分布更加緊密均勻。制漿工藝對(duì)豆?jié){的粒度、穩(wěn)定性、大豆蛋白凝膠性以及后續(xù)凝膠成型、豆腐的口感、凝膠強(qiáng)度、硬度等都具有顯著的影響。

    研究表明,高疏水性基團(tuán)的暴露量和低蛋白分子質(zhì)量更有助于豆腐干(凝膠)的產(chǎn)品特性提升[4]。酶解技術(shù)是對(duì)蛋白資源進(jìn)行高效轉(zhuǎn)化利用的工藝技術(shù),能夠改變蛋白構(gòu)象及分子間/內(nèi)作用力,斷裂肽鍵,水解大分子蛋白,形成各種功能性多肽[5]。該技術(shù)不僅能提升蛋白的消化吸收效率和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[6-7],還能改善蛋白的功能和理化特性[8],因此在生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。而風(fēng)味蛋白酶是一種微酸性環(huán)境下水解蛋白質(zhì)的真菌蛋白酶/肽酶復(fù)合體[9],可以有效地將疏水性氨基酸從脯氨酸末端切除,不僅能夠脫除蛋白水解物的苦味,增進(jìn)和改善水解液風(fēng)味[10],同時(shí)能夠水解蛋白質(zhì)。由于呈味氨基酸的增加和蛋白質(zhì)的水解,使其風(fēng)味和蛋白質(zhì)消化吸收率均得到改善。酶解技術(shù)的催化反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)能耗低,是一種“綠色化學(xué)”的生產(chǎn)技術(shù)[11],適合工業(yè)化生產(chǎn)。但酶解過(guò)度又會(huì)造成一些功能性質(zhì)的喪失,酶解時(shí)間的控制對(duì)蛋白制品的結(jié)構(gòu)和功能起到至關(guān)重要的作用[12]。目前,酶解技術(shù)對(duì)蛋白影響的研究較多,其中關(guān)于豆腐干的研究主要集中在風(fēng)味的改善[13-14]、質(zhì)構(gòu)的優(yōu)化[15]和保藏方法[16]的探索,而酶解技術(shù)在豆腐干生產(chǎn)加工的應(yīng)用和作用機(jī)制仍鮮有深入研究。

    為進(jìn)一步探究酶解與豆腐干結(jié)構(gòu)特性的關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)采用風(fēng)味蛋白酶對(duì)制漿工藝中的漿液進(jìn)行不同程度的酶解,分析酶解技術(shù)對(duì)漿液巰基含量、二硫鍵含量、表面疏水性的影響;再將豆?jié){加工制成豆腐干,通過(guò)物性測(cè)定儀測(cè)定其質(zhì)構(gòu)特性,掃描電子顯微鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu),低頻核磁共振儀測(cè)定其水分分布,從而分析酶解時(shí)間對(duì)豆腐干結(jié)構(gòu)特性的影響;通過(guò)測(cè)定出品率、持水性、失水率、消化特性和感官特性進(jìn)而分析酶解時(shí)間對(duì)豆腐干產(chǎn)品特性的影響,從而探究酶解技術(shù)對(duì)豆腐干結(jié)構(gòu)和產(chǎn)品特性的影響及作用機(jī)制,為豆腐干品質(zhì)改性和酶解技術(shù)在豆制品的應(yīng)用理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    ‘黑農(nóng)84’大豆(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%) 哈爾濱佰盛糧油有限公司;食用氯化鎂 安琪酵母股份有限公司;Flavourzyme500 MG風(fēng)味蛋白酶(活力不小于20 U/mg) 丹麥諾維信公司;谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶 江蘇一鳴生物股份有限公司;胰蛋白酶 上海翊圣生物科技有限公司;胃蛋白酶 甘肅天森藥業(yè)有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    PQ-001核磁共振儀 上海紐邁電子科技有限公司;DK-S12數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;DM-Z80自動(dòng)分渣磨漿機(jī) 河北鐵獅磨漿機(jī)械有限公司;Quanta 200F掃描電子顯微鏡 美國(guó)FEI公司;TA.XT2i型物性測(cè)試儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司;電磁爐佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 豆腐干的制備

    制備流程:清洗→浸泡→磨漿→過(guò)濾→酶解→煮漿→點(diǎn)鹵→破腦→壓坯→劃坯→晾干

    取一定質(zhì)量的大豆,清洗去雜,浸泡,大豆和水的質(zhì)量比為1∶5,在10~20 ℃下浸泡12~18 h,按大豆和水質(zhì)量比1∶5磨漿,過(guò)濾3 次除渣,風(fēng)味蛋白酶的添加量為0.12 mg/mL,酶解不同時(shí)間(0、10、20、30、40、50、60 min)后,攪抖加熱保持沸騰5 min,待溫度降至95 ℃時(shí),添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,于90 ℃加入豆?jié){質(zhì)量20%的鹵水(1 g/100 mL),靜置10~15 min,破腦、壓坯、劃坯,在105 ℃下進(jìn)行風(fēng)干30 min,得不同酶解時(shí)間的豆腐干。

    1.3.2 漿液指標(biāo)的測(cè)定

    1.3.2.1 漿液水解度的測(cè)定

    取不同酶解時(shí)間的樣品漿液20 mL,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的胃蛋白酶,在37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h。用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定,使其pH值為7,并記錄NaOH的消耗量,漿液水解度按公式(1)計(jì)算。

    式中:VNaOH為NaOH消耗體積/mL;α為α-NH2基團(tuán)的解離度;cNaOH為NaOH濃度/(mol/L);mp是蛋白質(zhì)水解的質(zhì)量/g;htot為底物蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)/(mmol/g)。根據(jù)Adler-Nissen[17]的研究結(jié)果,htot為7.75 mmol/g,α為0.44。

    1.3.2.2 漿液表面疏水性的測(cè)定

    參考Kato等[18]的8-苯氨基-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)熒光探針?lè)y(cè)定蛋白表面疏水性并進(jìn)行適當(dāng)修正。用0.1 mol/L的中性磷酸鹽緩沖溶液稀釋,10 000 r/min高速離心處理0.5 h除去沉淀物,以Lowery法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)量濃度,通過(guò)磷酸鹽緩沖液的逐步稀釋,調(diào)控蛋白溶液質(zhì)量濃度為0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mg/mL,取40 μL濃度為8 mmol/L的ANS溶液滴加至4 mL不同質(zhì)量濃度的蛋白溶液中,經(jīng)振蕩混勻后靜置3 min,在熒光分光光度計(jì)下進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)試,測(cè)試條件為激發(fā)波長(zhǎng)λex=390 nm,發(fā)射波長(zhǎng)λem=468 nm,掃描夾縫5 nm,掃描速率10 nm/s。將熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)量濃度作線性圖,以初始段的斜率計(jì)為蛋白的表面疏水性。

    1.3.2.3 漿液的巰基和二硫鍵含量測(cè)定

    取150 mg蛋白加入10 mL 0.1 mol/L pH 8.0的磷酸鹽緩沖液(含有1 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% SDS),充分混勻后8 000 r/min離心30 min,利用Lowery法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)量濃度。量取3 mL蛋白溶液加入上述磷酸鹽緩沖液后,滴入0.1 mL 5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid),DNTB)溶液(39.6 mg DNTB溶解于10 mL上述磷酸鹽緩沖液中制得),充分振蕩混合后室溫水浴1 h,之后在4 ℃ 8 000 r/min下離心30 min,取上清液,以不加DNTB作為空白對(duì)照,在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以摩爾消光系數(shù)13 600 L/(mol·cm)計(jì)算游離巰基含量(式(2))。取1 mL蛋白溶液,依次加入0.05 mL β-巰基乙醇及4 mL 0.1 mol/L尿素-鹽酸胍混合溶液(5∶8,V/V),充分混合后進(jìn)行室溫1 h水浴處理,之后將10 mL三氯乙酸(12 g/100 mL)加入溶液中,室溫水浴處理1 h,再以4 500 r/min離心10 min獲取沉淀物,重復(fù)上述試劑和水浴處理兩次后,將最終沉淀物溶解在10 mL上述磷酸鹽緩沖液中,再加入0.08 mL DNTB試劑,劇烈振蕩搖勻后在室溫條件下水浴處理1 h,再加入10 mL 12 g/100 mL的三氯乙酸,室溫條件下水浴處理1 h,將混合溶液在4 ℃、4 500 r/min下離心10 min。蛋白沉淀物再次分散于20 mL 12 g/100 mL的三氯乙酸溶液中,充分離心棄去三氯乙酸,重復(fù)3 次上述處理后,4 ℃、4 500 r/min離心30 min。以不加DNTB作為空白對(duì)照,測(cè)定上清液在412 nm波長(zhǎng)處的吸光度,以摩爾消光系數(shù)13 600 L/(mol·cm)計(jì)算蛋白中總巰基含量(式(2))。二硫鍵含量按式(3)計(jì)算。

    式中:A412nm為加Ellman試劑時(shí)樣品的吸光度;D為稀釋系數(shù);ρ為樣品蛋白最終質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

    1.3.3 豆腐干質(zhì)構(gòu)的測(cè)定

    參考劉銘[20]的方法,并稍作改動(dòng),豆腐干用TA.XT2i物性測(cè)定儀進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測(cè)定。用P5探頭在豆腐干的中部取樣并進(jìn)行測(cè)定。具體參數(shù)為:測(cè)前速率為5.00 mm/s,測(cè)中速率為1.00 mm/s,測(cè)后速率為10.00 mm/s,模式為壓縮比,壓縮比為30%,兩次間隔3.00 s,壓力為5.0 g,測(cè)定豆腐干硬度、凝聚性、咀嚼性、彈性和回復(fù)力[21]。

    1.3.4 豆腐干微觀結(jié)構(gòu)的觀察

    根據(jù)劉銘[20]的方法并略加修改,觀察豆腐干微觀結(jié)構(gòu)。將待測(cè)樣品用雙面刀切成2 mm×5 mm薄片,用體積分?jǐn)?shù)2.5%、pH 6.8的戊二醛于4 ℃浸泡2.0 h進(jìn)行固定。然后用不同體積分?jǐn)?shù)(50%、70%、80%、90%和100%)的乙醇脫水,每次10~15 min,之后分別用V(無(wú)水乙醇)∶V(純叔丁醇)=1∶1混合溶液置換一次,每次15 min,用真空冷凍干燥機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行干燥,最后進(jìn)行噴金,觀察時(shí)加速電壓為20 kV,放大倍數(shù)為5 000[22]。

    1.3.5 豆腐干保水性的測(cè)定

    1.3.5.1 豆腐干持水性

    根據(jù)Puppo等[23]的方法進(jìn)行測(cè)定并稍加修改。稱取2 g(精確到0.000 1 g)豆腐干,放入底部有脫脂棉的50 mL離心管中,以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min后稱質(zhì)量并記錄(m1),置于105 ℃下干燥至恒質(zhì)量(m0)[24],按式(4)計(jì)算持水性。

    1.3.5.2 豆腐干失水率

    根據(jù)李里特等[22]的方法進(jìn)行測(cè)定,并稍加修改。稱取2 g(精確到0.000 1 g)豆腐干,然后用利刃按十字均勻切成4 塊,平放在底部為金屬網(wǎng)的塑料盒中,每隔5 h稱一次質(zhì)量,共放置30 h。豆腐干每次稱量的質(zhì)量與豆腐干原樣品的質(zhì)量差同豆腐干原樣品質(zhì)量的比例,即為豆腐干的失水率[25]。

    1.3.6 豆腐干水分狀態(tài)的測(cè)定

    根據(jù)Bertram等[26]的方法并稍加修改,采用低場(chǎng)核磁共振弛豫測(cè)定樣品的橫向弛豫時(shí)間T2。測(cè)定條件:質(zhì)子共振頻率為22.6 MHz,測(cè)量溫度為32 ℃。豆腐干離心去掉的水分后直接放入直徑為25 mm的核磁管中,隨后立即放入PQ-001核磁共振儀中進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定參數(shù)為:時(shí)間(90°脈沖與180°脈沖之間的時(shí)間)為200 s,重復(fù)掃描4 次,重復(fù)間隔時(shí)間為1 000 ms,得到8 000 個(gè)回波,所得CPMG指數(shù)衰減曲線采用儀器自帶的MultiExpInv Analysis軟件進(jìn)行反演得到T2圖譜,對(duì)各峰面積進(jìn)行累計(jì)積分得到峰面積記為S21、S22及S23,其分別代表T21、T22及T233 個(gè)組分水的比例[27-28]。

    1.3.7 豆腐干的體外消化測(cè)定

    根據(jù)Dupont等[29]的方法,稍作改動(dòng)。用體積分?jǐn)?shù)為38%的濃HCl溶液和去離子水配制pH 2.0的稀HCl溶液。將豆腐干壓碎并稱10 g置于90 mL上述稀HCl溶液中混合,在37 ℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱10 min,然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的胃蛋白酶,并在37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h。之后用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的胰蛋白酶,在37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)2 h。每個(gè)樣品的消化液取20 mL,在沸水浴中水浴10 min滅酶。實(shí)驗(yàn)平行3 組,重復(fù)兩次。水解開(kāi)始時(shí),調(diào)節(jié)pH值為胃蛋白酶的最適值,在反應(yīng)過(guò)程中不斷攪抖。胃消化完后,用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定,使其pH值為7,并記錄NaOH的消耗體積,然后按式(1)計(jì)算出大豆蛋白的水解度。

    1.3.8 豆腐干的感官評(píng)價(jià)

    豆腐干感官評(píng)價(jià)見(jiàn)表1。感官評(píng)定的標(biāo)準(zhǔn)參考GB 2712—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 豆制品》[30],感官評(píng)價(jià)方法主要通過(guò)看、聞、嘗進(jìn)行。取4 cm2豆腐干放在90 mm平板中,觀察豆腐干的色澤和組織狀態(tài),聞其氣味,最后置于口中咀嚼豆腐干樣品,品嘗滋味。樣品提供給10 位食品專業(yè)人員,按照制定的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)打分,計(jì)算平均分。

    表 1 豆腐干感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of dried tofu

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次,結(jié)果表示為 ±s,利用SPSS Statistics 22軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05為顯著性差異。采用Origin 8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)、圖表進(jìn)行處理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 酶解對(duì)漿液的水解度的影響

    圖 1 風(fēng)味蛋白酶水解不同時(shí)間的漿液水解度Fig. 1 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis of soymilk protein

    由圖1可知,隨著酶解時(shí)間的不斷延長(zhǎng),漿液的水解度呈逐漸增大的趨勢(shì),且當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到30 min時(shí),水解度增加趨勢(shì)逐漸趨于平緩。風(fēng)味酶作為一種生物催化劑,初期與反應(yīng)底物充分接觸后,能夠有效催化蛋白質(zhì)的分解反應(yīng);但隨著反應(yīng)的進(jìn)行,水解產(chǎn)物不斷增加,反應(yīng)底物減少,酶解反應(yīng)速率不再上升,并趨于一個(gè)極限值。

    2.2 酶解對(duì)漿液表面疏水性的影響

    圖 2 不同酶解時(shí)間對(duì)漿液表面疏水性的影響Fig. 2 Effect of hydrolysis time on surface hydrophobicity of soymilk

    由圖2可知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),漿液的表面疏水性呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),且在酶解時(shí)間為30 min時(shí)表面疏水性達(dá)到最大,這與適當(dāng)酶解可暴露漿液的疏水性基團(tuán)有關(guān)。研究表明,酶解過(guò)程對(duì)蛋白的影響具有雙向性。在酶解初期,蛋白質(zhì)發(fā)生解聚,掩蓋在分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露,疏水相互作用增強(qiáng);當(dāng)酶解時(shí)間為30 min時(shí),蛋白結(jié)構(gòu)充分打開(kāi),會(huì)暴露出大量的疏水性殘基,表面疏水性達(dá)到峰值,蛋白處于展開(kāi)與交聯(lián)的臨界點(diǎn)[31];而隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng),蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象進(jìn)一步發(fā)生改變,水解產(chǎn)物之間重新折疊形成能量較低的新構(gòu)象,促使疏水性氨基酸被隱藏,進(jìn)而導(dǎo)致水解產(chǎn)物表面疏水性降低[32-34]。

    2.3 酶解對(duì)漿液的巰基和二硫鍵含量的影響

    由圖3可知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),二硫鍵、總巰基和游離巰基含量均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),且在酶解時(shí)間為30 min時(shí),二硫鍵含量達(dá)到最大值,而總巰基和游離巰基含量在酶解10 min時(shí)達(dá)到最大值,這表明酶解時(shí)間對(duì)巰基含量具有顯著影響。在酶解初期,蛋白部分結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,二硫鍵斷裂形成巰基暴露到分子表面[35],總巰基和游離巰基含量增加。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白分子可能發(fā)生聚集,蛋白質(zhì)中的活性巰基易被氧化生成二硫鍵[36](形成二硫鍵或其他形式的物質(zhì))并發(fā)生脫巰基反應(yīng),造成游離巰基和總巰基含量減少[37],而二硫鍵含量增加。隨著酶解的繼續(xù)進(jìn)行,重新聚集的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞,形成了分子質(zhì)量較大的肽段,且酶解時(shí)間越長(zhǎng)肽鍵越短,同時(shí),二硫鍵、總巰基和游離巰基含量降低[38],而二硫鍵的形成和漿液形成凝膠的質(zhì)構(gòu)特性密切相關(guān)。此結(jié)果和Zhao Guanli等[39]所研究堿性蛋白酶水解花生分離蛋白的結(jié)果相一致。

    圖 3 不同酶解時(shí)間對(duì)漿液巰基和二硫鍵含量的影響Fig. 3 Effect of hydrolysis time on the contents of sulfhydryl groups and disulfide bonds in soymilk protein

    2.4 酶解對(duì)豆腐干質(zhì)構(gòu)特性的影響

    表 2 酶解時(shí)間對(duì)豆腐干質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 2 Effect of hydrolysis time on texture of dried tofu

    由表2可知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),豆腐干的硬度、彈性、咀嚼性、凝聚性和回復(fù)力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),且在酶解時(shí)間為30 min時(shí)達(dá)到最大,這表明酶解時(shí)間對(duì)豆腐干的結(jié)構(gòu)特性影響是雙向的。豆腐干結(jié)構(gòu)特性的改善與凝膠彈性和硬度的增強(qiáng)取決于蛋白間的疏水相互作用、非共價(jià)相互作用強(qiáng)度[40],而疏水相互作用、非共價(jià)相互作用的增強(qiáng)需要提高疏水基團(tuán)的暴露量和二硫鍵的形成量,研究表明酶解可使?jié){液中蛋白主鏈結(jié)構(gòu)展開(kāi)并發(fā)生斷裂,促進(jìn)疏水基團(tuán)的暴露和二硫鍵的形成[41]。但當(dāng)酶解時(shí)間過(guò)大,蛋白分子鏈斷裂嚴(yán)重,其粒徑過(guò)小,不易形成網(wǎng)狀組織結(jié)構(gòu),并且分子間相互作用減小,進(jìn)而導(dǎo)致豆腐干內(nèi)部結(jié)構(gòu)較差和質(zhì)構(gòu)特性減弱[6]。這和酶解時(shí)間對(duì)漿液的影響結(jié)果相一致。

    2.5 酶解對(duì)豆腐干微觀結(jié)構(gòu)的影響

    圖 4 豆?jié){酶解不同時(shí)間后所制成豆腐干的掃描電子顯微鏡圖Fig. 4 Scanning electron micrographs of dried tofu made from soymilk hydrolyzed for different durations

    由圖4可知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),豆腐干的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì),致密性先增大后減小,且在酶解時(shí)間為30 min時(shí),孔徑最小、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)均勻致密。蛋白分子鏈間的的疏水作用是形成凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)[42],蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和體積可影響凝膠的微觀結(jié)構(gòu)[4]。經(jīng)過(guò)適度酶解后,大豆蛋白的疏水相互作用力增強(qiáng)[43],巰基和二硫鍵含量增多,促進(jìn)了凝固劑對(duì)蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)聚集和肽鏈間結(jié)合程度的增強(qiáng),使豆腐干的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加致密和孔徑減小[41]。但過(guò)度酶解會(huì)引起蛋白分子質(zhì)量減小,肽鏈變短,破壞蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu),弱化分子間的作用,進(jìn)而減弱維持凝膠結(jié)構(gòu)的作用力[6],使豆腐干的組織結(jié)構(gòu)松散。豆腐干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的致密性和均一性可直接影響豆腐干硬度、彈性,蛋白結(jié)合越緊密,硬度越大且彈性越好,當(dāng)凝膠結(jié)構(gòu)的作用力減小時(shí),組織結(jié)構(gòu)松散,硬度和彈性也減小,這和質(zhì)構(gòu)的研究結(jié)果相一致。

    2.6 酶解對(duì)豆腐干的持水性和失水率的影響

    由圖5可知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),豆腐干持水性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),且在30 min時(shí)達(dá)到峰值;由圖6可知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),同一樣品的失水率呈現(xiàn)增大趨勢(shì),且在酶解時(shí)間為30 min時(shí)增大趨勢(shì)較為緩慢;不同樣品在同一放置時(shí)間,樣品的失水率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)先減小后增大趨勢(shì),且在酶解時(shí)間為30 min時(shí)達(dá)到最低。持水性和失水率直接影響著豆腐干的鹵制口感、加工特性和貨架期[44]。豆腐干的持水性取決于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中蛋白和水之間的水合作用和凝膠的空間結(jié)構(gòu)。所失水分通常是部分自由水和不易流動(dòng)水,這兩種水分狀態(tài)分別受凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的致密程度與蛋白-蛋白之間結(jié)合緊密程度的影響較大[45]。凝膠結(jié)構(gòu)的致密程度取決于巰基和疏水性基團(tuán)的數(shù)量[46],而蛋白-蛋白之間結(jié)合緊密程度與極性基團(tuán)的暴露量密切相關(guān)。研究表明,漿液經(jīng)過(guò)適度酶解后,促使蛋白結(jié)構(gòu)被打開(kāi),進(jìn)而提高巰基基團(tuán)和疏水性基團(tuán)的暴露量[41],促使蛋白疏水作用增強(qiáng),進(jìn)而增強(qiáng)豆腐干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的致密性和均一性,提高豆腐干的彈性和回復(fù)性;巰基基團(tuán)和疏水性基團(tuán)暴露的同時(shí)游離出氨基和羧基,蛋白分子結(jié)合水的能力提高[47],進(jìn)而影響部分不易流動(dòng)水包埋量。當(dāng)施加一定的外力時(shí)其空間容量不變,結(jié)構(gòu)的扭曲擠壓不能排出其中的水分,從而使豆腐干的持水性增強(qiáng),失水率降低。但是過(guò)度酶解會(huì)導(dǎo)致網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遭到破壞,維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的作用力被弱化,持水性降低和失水率增多。

    圖 5 豆腐干在不同酶解時(shí)間下的持水性Fig. 5 Water-holding capacity of dried tofu made from soymilk hydrolyzed for different durations

    圖 6 豆腐干在不同放置時(shí)間下的失水率Fig. 6 Water loss rate during storage of dried tofu made from soymilk hydrolyzed for different durations

    2.7 酶解對(duì)豆腐干的水分分布狀態(tài)的影響

    低場(chǎng)核磁共振可通過(guò)檢測(cè)豆腐干中氫質(zhì)子的弛豫時(shí)間來(lái)表征豆腐干中的水分狀態(tài)和水分分布,圖7a為整體水分分布圖,3 個(gè)峰分別對(duì)應(yīng)為結(jié)合水(T21,0.50~0.92 ms)、不易流動(dòng)水(T22,13.35~24 ms)和自由水(T23,132.08~240.1 ms)[20,48],峰面積為S21、S22、S23。弛豫時(shí)間表征豆腐干失去水分的能力,弛豫時(shí)間越長(zhǎng),質(zhì)子的自由度越大[49],水分子組分與大分子的結(jié)合越松散[50],水分越容易被排出。峰面積表征不同水分狀態(tài)下,水分的含量,且峰面積越大則水分含量越多。

    圖 7 豆腐干的低場(chǎng)核磁共振圖像Fig. 7 Low-field nuclear magnetic resonance images of dried tofu made from soymilk hydrolyzed for different durations

    由圖7c可知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),弛豫時(shí)間T22和S22呈先減小后增大趨勢(shì),且當(dāng)酶解時(shí)間為30 min時(shí),T22最短、S22最大。不易流動(dòng)水存在于微觀結(jié)構(gòu)中一些較小的間隙中,受蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響較大。不易流動(dòng)水的變化趨勢(shì)表明隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白-蛋白之間的交聯(lián)作用增強(qiáng),蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐漸致密,縮短蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)表面與水分子的距離,降低了T22,提高了不易流動(dòng)水的禁錮量。但隨著酶解時(shí)間持續(xù)延長(zhǎng),弱化了蛋白-蛋白間的作用力,進(jìn)而使不易流動(dòng)水的包埋量減少。

    由圖7d可知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),弛豫時(shí)間T23和S23呈先減小后增大趨勢(shì),且當(dāng)酶解時(shí)間為30 min時(shí),T23最短、S23最大。自由水存在于豆腐基質(zhì)中較大孔徑的孔洞之中,受蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響較小。豆腐干的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)由大小不一的孔洞和網(wǎng)孔組成,由掃描電子顯微鏡的觀察結(jié)果可知,漿液經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)拿附夂笾瞥傻亩垢桑淇斩春途W(wǎng)孔形成更加緊密均一。豆腐干凝膠的形成與蛋白顆粒的大小、疏水相互作用與二硫鍵含量有關(guān)[51],隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白質(zhì)逐漸解聚,疏水性基團(tuán)的暴露促進(jìn)了二硫鍵的形成或交換,致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)提供了較多自由水的儲(chǔ)存空間,自由水含量增多。但隨著酶解時(shí)間的逐漸延長(zhǎng),蛋白分子間的作用力逐漸弱化,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不易形成,對(duì)自由水的禁錮能力減弱,自由水含量減少。以上結(jié)果進(jìn)一步證明,適宜的酶解可顯著改善豆腐干的持水性和失水率。

    2.8 酶解對(duì)豆腐干的體外消化率的影響

    圖 8 酶解豆腐干的體外消化率Fig. 8 Effect of hydrolysis time on in vitro digestibility of dried tofu

    由圖8可知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),體外消化率呈增大趨勢(shì),當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)30 min后,體外消化率增加程度減慢直至平緩,這表明經(jīng)風(fēng)味酶酶解后漿液制成的豆干,酶解時(shí)間越長(zhǎng)體外消化能力越強(qiáng),且在酶解時(shí)間超過(guò)30 min后體外消化率趨于一穩(wěn)定數(shù)值不變。經(jīng)過(guò)碾碎的豆腐干樣品溶于消化液中體外模擬人體消化,消化液中的酶作用于形成凝膠結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中。與未經(jīng)酶解相比,酶解預(yù)處理得到的豆腐干蛋白結(jié)構(gòu)被打開(kāi),分子質(zhì)量降低,更易被其他酶所酶解[13],因此增加了體外消化率,且更易被人體所消化吸收。不同酶解時(shí)間的蛋白隨著水解度的增大,其體外消化率逐漸升高[52]。因此適度酶解對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有明顯的提高效果,而且更利于人體吸收,尤其是對(duì)消化功能較差的人群(如老人、小孩等),消化率的提高有利于其吸收優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)成分。

    2.9 酶解對(duì)豆腐干感官評(píng)價(jià)的影響

    由圖9、表3可知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),豆腐干的感官評(píng)分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),且當(dāng)酶解時(shí)間為30 min時(shí),豆腐干總感官評(píng)分最高。收集感官評(píng)定人員信息得到,酶解30 min時(shí)的豆腐干形狀規(guī)則,薄厚和顏色均勻,口感細(xì)膩光滑,彈性和韌性足,翻折不易斷裂,有較好的咬合力,軟硬適中,氣孔細(xì)密均勻,結(jié)構(gòu)細(xì)膩,質(zhì)地均勻無(wú)凹陷,豆味較濃,無(wú)異味。而當(dāng)酶解時(shí)間長(zhǎng)于30 min時(shí),豆腐干口感松散,彈性和韌性較差,易斷裂。因此,當(dāng)酶解時(shí)間為30 min時(shí),豆腐干的感官效果最佳。這與2.4節(jié)中質(zhì)構(gòu)研究結(jié)果一致,表明豆腐干的口感與豆腐干內(nèi)部結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)特性緊密相關(guān)。

    圖 9 不同酶解時(shí)間對(duì)豆腐干感官品質(zhì)的影響Fig. 9 Effect of hydrolysis time on sensory evaluation of dried tofu

    表 3 豆腐干的感官評(píng)分結(jié)果Table 3 Sensory scores of dried tofu made from soymilk hydrolyzed for different durations

    3 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)采用風(fēng)味蛋白酶酶解技術(shù)調(diào)控制漿工藝制備豆腐干產(chǎn)品,研究酶解技術(shù)對(duì)豆腐干品質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性的影響。結(jié)果表明:隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),漿液的水解度、表面疏水性、巰基含量和二硫鍵含量發(fā)生顯著改變。且在酶解時(shí)間30 min時(shí),較未酶解樣品總巰基和游離巰基含量降低,水解度、表面疏水性和二硫鍵含量顯著提高。這表明酶解使大豆蛋白迅速降解,形成小分子多肽,暴露了大量的內(nèi)部疏水性基團(tuán)和極性分子,增大了蛋白-蛋白之間的作用力,促使豆腐干凝膠的形成。

    隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),豆腐干的質(zhì)構(gòu)特性、微觀結(jié)構(gòu)、水分分布和消化特性明顯改善,且當(dāng)酶解時(shí)間為30 min時(shí),持水性和體外消化速率提高,而失水率降低。這表明酶解技術(shù)對(duì)豆腐干結(jié)構(gòu)和品質(zhì)具有明顯的改善作用,從而為豆腐干的品質(zhì)改性和酶解技術(shù)在豆制品的應(yīng)用提供了理論參考。

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