免疫熒光法在微生物快速檢驗(yàn)中的應(yīng)用分析

黃智明

【摘要】 目的 探討免疫熒光法在微生物快速檢驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值。方法 150例確診為上呼吸道感染患者， 對(duì)所有患者的鼻、咽、喉部分泌物標(biāo)本采用免疫熒光法進(jìn)行快速檢驗(yàn)， 觀察分析所有患者的病毒感染率與病毒感染種類(lèi)。結(jié)果 150例患者病毒感染135例， 病毒感染率為90.00%;其中腺病毒感染38例（28.15%）， 占比最高， 其次流感病毒A為28例（20.74%）、流感病毒B為22例（16.30%）、呼吸道合胞病毒為17例（12.59%）、副流感病毒2為11例（8.15%）、副流感病毒3為11例（8.15%）、副流感病毒1為8例（5.93%）。結(jié)論 免疫熒光法可快速檢驗(yàn)上呼吸道感染患者病毒感染率與病毒感染種類(lèi)， 可作為患者疾病進(jìn)展與預(yù)后判斷的參考依據(jù)， 推薦臨床廣泛應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】 免疫熒光法;微生物;快速檢驗(yàn);上呼吸道感染

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.03.044

免疫熒光技術(shù)是結(jié)合免疫學(xué)方法與熒光標(biāo)記技術(shù)來(lái)研究特異性蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布情況的一種研究技術(shù)， 主要是由于熒光素所散發(fā)出來(lái)的熒光可被熒光顯微鏡檢出， 進(jìn)而可對(duì)抗原進(jìn)行精準(zhǔn)的細(xì)胞定位[1]。此方法不僅檢驗(yàn)速度快， 而且敏感度與特異度均較高， 現(xiàn)已成為診斷學(xué)中最常用的方法之一， 臨床常將其應(yīng)用于細(xì)菌、真菌以及病毒等微生物的快速檢驗(yàn)中， 且取得了滿意效果[2]。臨床發(fā)現(xiàn)， 大部分的上呼吸道感染是由病毒感染引起， 常見(jiàn)病毒包括流感病毒、副流感病毒、腺病毒以及呼吸道合胞病毒等[3]。準(zhǔn)確地診斷致病病毒類(lèi)型， 再給予針對(duì)性治療對(duì)患者預(yù)后改善具有重要意義。本研究選取了150例上呼吸道感染患者， 對(duì)其鼻、咽喉分泌物標(biāo)本采用免疫熒光法進(jìn)行快速檢驗(yàn)， 具體報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2018年1月～2019年1月本院收治的150例確診為上呼吸道感染患者作為本次研究對(duì)象， 其中男84例， 女66例;年齡12～77歲， 平均年齡（47.52±16.48）歲;身高155～192 cm， 平均身高（168.62±8.25）cm;體重43～95 kg，?平均體重（65.83±9.73）kg;文化程度：大專及以上25例， 高中48例， 初中53例， 小學(xué)及以下24例;疾病類(lèi)型：鼻部感染65例， 咽部感染55例， 喉部感染30例;合并癥：急性心肌炎11例， 風(fēng)濕熱6例， 腎炎5例。

1. 2 方法

1. 2. 1 試劑 使用美國(guó)DHI公司生產(chǎn)的熒光檢測(cè)試劑盒， 具體包含熒光標(biāo)志單克隆抗體試劑盒與熒光標(biāo)志抗體試劑盒， 主要是針對(duì)流感病毒A、流感病毒B、腺病毒、呼吸道合胞病毒以及副流感病毒1、2、3型試劑盒;另外， 還有封閉液、濃縮型洗滌液以及病原體對(duì)照載玻片。

1. 2. 2 快速檢驗(yàn)方法 ①標(biāo)本收集和處理：a.使用負(fù)壓吸引器取患者2～3 ml的鼻、咽及喉部分泌物， 然后將分泌物放置無(wú)菌生理鹽水中待檢。b.對(duì)分泌物進(jìn)行反復(fù)性地吹打， 然后放置于離心管內(nèi)。c.將分泌物離心， 控制轉(zhuǎn)速為500 r/min， 離心時(shí)間為8 min， 除去上清液。d.將遺留下來(lái)的沉淀物使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌， 然后混合均勻。e.對(duì)沉淀物再次進(jìn)行離心處理， 除去上清液， 重復(fù)多次， 直至上清液不再粘稠為止。f.將最后遺留的沉淀物溶解在0.5～1.0 ml的磷酸鹽緩沖液中， 再進(jìn)行反復(fù)吹打， 直至其成為細(xì)胞懸液為止。g.將細(xì)胞懸液點(diǎn)在病原體對(duì)照載玻片上， 保持每孔25 μl。h.風(fēng)干點(diǎn)樣孔， 然后使用冷丙酮對(duì)其進(jìn)行固定10 min， 待檢。②熒光染色：a.于對(duì)照載玻片樣孔內(nèi)細(xì)胞中滴入20 μl對(duì)應(yīng)熒光抗體， 然后在37℃的保溫盒內(nèi)孵育30 min， 也就是在1～7號(hào)樣孔內(nèi)一次性地滴入熒光標(biāo)志抗體進(jìn)行陰性對(duì)照， 而采用熒光標(biāo)志單克隆抗體作為陽(yáng)性對(duì)照， 以流感病毒A、流感病毒B、腺病毒、呼吸道合胞病毒以及副流感病毒1、2、3型試劑盒作為樣品孔。b.使用濃縮型洗滌液對(duì)載玻片內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)洗滌， 然后使用蒸餾水充分洗滌1 min。c.等待蒸餾水完全風(fēng)干之后， 在載玻片孔內(nèi)再滴入1滴封閉液， 然后將蓋玻片蓋好， 最后使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1. 3 診斷原則與陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn) ①診斷原則：當(dāng)被熒光標(biāo)志的對(duì)應(yīng)病毒特異性單克隆抗體與其抗原相互結(jié)合之后， 形成了一種結(jié)合復(fù)合物， 使用熒光顯微鏡觀察可發(fā)現(xiàn)為綠色熒光， 但未被染色的會(huì)被Evas藍(lán)染而成為紅色。②陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：若熒光顯微鏡下顯示為綠色熒光代表陽(yáng)性， 若無(wú)熒光代表陰性;若熒光顯微鏡放大200倍時(shí)， 發(fā)現(xiàn)不低于2個(gè)熒光細(xì)胞則代表陽(yáng)性。

2 結(jié)果

150例患者病毒感染135例， 病毒感染率為90.00%;其中腺病毒感染38例（28.15%）， 占比最高， 其次流感病毒A為28例（20.74%）、流感病毒B為22例（16.30%）、呼吸道合胞病毒為17例（12.59%）、副流感病毒2為11例（8.15%）、副流感病毒3為11例（8.15%）、副流感病毒1為8例（5.93%）。見(jiàn)表1。

3 討論

上呼吸道感染是鼻腔、咽部及喉部急性炎癥的總稱， 從廣義角度來(lái)說(shuō)， 其不是一個(gè)疾病診斷， 而屬于一組疾病， 包含普通感冒、咽結(jié)膜熱、病毒性咽炎、喉炎、細(xì)菌性咽-扁桃體炎以及皰疹性咽峽炎等;從狹義角度來(lái)說(shuō)， 也被成為普通感冒， 屬于臨床最常見(jiàn)的一種急性呼吸道感染疾病， 具有發(fā)病率高、自限性等特點(diǎn)[4， 5]。本研究采用免疫熒光法對(duì)150例上呼吸道感染患者鼻、咽、喉部的分泌物標(biāo)本進(jìn)行檢驗(yàn)， 結(jié)果顯示， 150例患者病毒感染135例， 病毒感染率為90.00%;其中腺病毒感染38例（28.15%）， 占比最高， 其次流感病毒A為28例（20.74%）、流感病毒B為22例（16.30%）、呼吸道合胞病毒為17例（12.59%）、副流感病毒2為11例（8.15%）、副流感病毒3為11例（8.15%）、副流感病毒1為8例（5.93%）。可見(jiàn)對(duì)上呼吸道感染患者的鼻、咽、喉部分泌物標(biāo)本采用免疫熒光法進(jìn)行檢驗(yàn)， 可快速、準(zhǔn)確地檢驗(yàn)患者感染率與感染病毒的種類(lèi)， 效果較為可靠。免疫熒光法使用的試劑是患者的血清與其免疫熒光抗體， 此檢驗(yàn)要求試劑要對(duì)關(guān)鍵部分抗體有著較高的特異性， 也就是單特異性抗體制劑[5]。近些年來(lái)， 隨著人工合成免疫原技術(shù)的不斷發(fā)展與進(jìn)步， 研究發(fā)現(xiàn)， 沙門(mén)氏菌群的特異性抗原決定簇屬于一種雙糖， 所以很多研究者首先采用人工合成法對(duì)這種雙糖進(jìn)行高濃度地合成， 然后再將其與蛋白質(zhì)結(jié)合， 形成一種免疫原， 最后便可合成群特異性較強(qiáng)的單特異性抗體[7]。近年來(lái)新發(fā)展而成的單克隆抗體制備技術(shù)也為單特異性抗體的制備奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

免疫熒光法的技術(shù)原理是依據(jù)抗原抗體反應(yīng)原理， 把已知抗原或抗體標(biāo)記上熒光素再制備成一種熒光標(biāo)記物， 然后使用此類(lèi)熒光抗體（或抗原）作為分子探針對(duì)細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗體（或抗原）進(jìn)行檢驗(yàn)[8];由于在細(xì)胞或組織內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物表層含有熒光素成分， 當(dāng)使用熒光顯微鏡對(duì)標(biāo)本進(jìn)行觀察時(shí)， 熒光素在激發(fā)光照射下會(huì)發(fā)出亮度較大桔紅色或黃綠色的熒光， 同時(shí)也可觀察到熒光所在細(xì)胞或組織的具體位置， 進(jìn)而準(zhǔn)確地判斷出抗原或抗體的性質(zhì)、定位， 最后采用定量技術(shù)對(duì)其含量進(jìn)行準(zhǔn)確地測(cè)定[9]。目前， 臨床將免疫熒光技術(shù)分為熒光抗體法與熒光抗原法兩種， 其中應(yīng)用熒光抗體示蹤或檢驗(yàn)相應(yīng)抗原法稱為熒光抗體法;應(yīng)用已知熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢驗(yàn)相應(yīng)抗體法稱為熒光抗原法， 前者相對(duì)而言較為常用。另外， 臨床將應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察與檢驗(yàn)細(xì)胞、組織中抗原或半抗原物質(zhì)的方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)， 而免疫熒光細(xì)胞化學(xué)又分為直接法、間接法、補(bǔ)體法以及夾心法等[10]。本研究應(yīng)用免疫熒光法檢驗(yàn)上呼吸道感染患者鼻、咽、喉部的分泌物標(biāo)本僅需在實(shí)驗(yàn)室2 h內(nèi)， 并借助熒光顯微鏡以及相應(yīng)試劑盒便可檢驗(yàn)出150例上呼吸道感染患者的病毒感染率與病毒感染類(lèi)型， 操作簡(jiǎn)單、成本低廉， 可在一般實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開(kāi)展， 開(kāi)展局限性較小。雖本研究結(jié)果顯示免疫熒光法檢驗(yàn)上呼吸道感染患者鼻、咽、喉部分泌物標(biāo)本的效果較好， 但由于本研究所收集的病例數(shù)量較少， 所得研究結(jié)果可能會(huì)存在一定偏倚， 因此臨床還需擴(kuò)大研究規(guī)模進(jìn)行進(jìn)一步探究， 且還需對(duì)其他微生物感染類(lèi)疾病采用免疫熒光法進(jìn)行快速檢驗(yàn)， 以驗(yàn)證其檢驗(yàn)效果。

綜上所述， 免疫熒光法可快速檢驗(yàn)上呼吸道感染患者病毒感染率與病毒感染種類(lèi)， 可作為患者疾病進(jìn)展與預(yù)后判斷的參考依據(jù)， 推薦臨床廣泛應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] 王永蓉， 廉亞茹， 蔣國(guó)潤(rùn)， 等. 柯薩奇病毒A16型抗原與呼吸道黏膜上皮組織內(nèi)先天淋巴細(xì)胞的相互關(guān)系及其疫苗應(yīng)用價(jià)值. 微生物與感染， 2018， 13（6）：350-361.

[2] 張占東， 李媛媛， 吳清勝， 等. 免疫熒光法檢測(cè)桿狀病毒滴度的建立及驗(yàn)證. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志， 2018， 38（9）： 702-709.

[3] 馬小波， 梁朝霞， 徐慶雷， 等. 血清抗微生物抗體檢測(cè)在炎性腸病臨床診斷中的應(yīng)用. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2016， 37（22）：3159-3161.

[4] 舒林華， 許姜姜， 王淑， 等. 兒童社區(qū)獲得性肺炎致病微生物分布及與臨床特征的相關(guān)性. 中國(guó)當(dāng)代兒科雜志， 2015（10）：1056-1061.

[5] 邊片， 巴羅， 次仁德吉， 等. 高原地區(qū)藏族人群慢性鼻竇炎炎癥模式與微生物定植相關(guān)性研究. 西部醫(yī)學(xué)， 2018， 30（12）：1787-1792.

[6] 童春堂， 尤蘭華， 郭沛艷， 等. 慢性阻塞性肺疾病急性加重患者呼吸道病毒及非典型病原體的檢測(cè)分析. 中華肺部疾病雜志（電子版）， 2014， 7（2）：8-11.

[7] 田偉， 梁淳， 郭紅霞， 等. 自身免疫病患者急性上呼吸道感染病原體IgM抗體檢測(cè)結(jié)果分析. 標(biāo)記免疫分析與臨床， 2016， 23（9）：1095-1098.

[8] 王麗， 周光， 王磊利， 等. 2013-2016年14383例呼吸道感染患者9種病原體IgM抗體檢測(cè)結(jié)果分析. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志， 2018， 28（17）：2579-2582.

[9] 張智州， 路華敏. 間接免疫熒光法檢測(cè)IgM抗體在兒童呼吸道感染中的應(yīng)用. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床， 2019， 16（2）：249-252.

[10] 項(xiàng)薔薇， 羅運(yùn)春， 陳小芳. 溫州育英兒童醫(yī)院急性下呼吸道感染住院患兒病毒病原學(xué)研究. 中國(guó)實(shí)用兒科雜志， 2005， 20（12）：738-740.

[收稿日期：2019-09-11]