棘孢木霉T-6對煙草促生及對黑脛病和根黑腐病的抗病作用

宋玉娟 韓雪蓮 張安盛 王玉軍 高克祥 梁元存

摘 ?要：利用生防菌防治土傳病害是植物病害防治中的重要措施，在溫室盆栽條件下研究了棘孢木霉T-6對煙草促生和抗病效果。結果表明，棘孢木霉T-6對煙草黑脛病菌、煙草根黑腐病菌的菌絲生長抑制率分別達49.62%、59.23%;溫室盆栽條件下，棘孢木霉T-6對黑脛病和根黑腐病的防治效果分別達到74.45%和75.14%。棘孢木霉T-6處理后提高了煙草葉片葉綠素含量、類胡蘿卜素含量和超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶的活性，棘孢木霉T-6處理的煙株生長狀況明顯好于對照。棘孢木霉T-6能夠促進煙株生長和提高煙草對黑脛病和根黑腐病的抗性，具有良好的應用潛力。

關鍵詞：煙草;棘孢木霉T-6;黑脛病;根黑腐病;生物防治

Effects of?Trichoderma asperellum?T-6 on Growth Promotion， Control of Black Shank and Black Root Rot in Tobacco

SONG Yujuan¹， HAN Xuelian¹， ZHANG Ansheng²， WANG Yujun¹， GAO Kexiang¹， LIANG Yuancun^1*

（1. College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian， Shandong 271018， China; 2. Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan， 250100， China）

Abstract： UsingTrichodermaspp. to control plant soil-borne diseases is a promising field in biological control. In order to investigate the effect ofT. asperellumT-6 on tobacco growth and resistance to soil-borne fungi， spore suspensions ofT. asperellum?T-6 were inoculated into soil， and then pot experiments were conducted in greenhouse. The results showed that hyphal growth ofPhytophthora parasiticaandThielaviopsis basicolawas inhibited byT. asperellumT-6， and the inhibited rates were 49.62% and 59.23%， respectively. Control efficiency ofT. asperellumT-6 on black shank and black root rot reached 74.45% and 75.14%. AfterT. asperellumT-6 pretreatment， the content of chlorophyll and carotenoids and the activities of three resistance-related enzymes in tobacco leaves were increased， and the growth of tobacco treated withT. asperellumT-6 were better than control. Taken together， the results from this study indicated thatT. asperellum?T-6 could control tobacco black shank and black root rot effectively， and promote tobacco growth.

Keywords： tobacco;Trichoderma asperellum; black shank; black root rot; biological control

煙草黑脛病是煙草寄生疫霉（Phytophthora parasitica）引起的菌物性土傳病害，造成的年均損失約為12 303.3萬元^[1-2]。煙草根黑腐病是由基生根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）引起的真菌性土傳病害，在我國各煙區(qū)均有發(fā)生，嚴重地塊發(fā)病率可達30%以上^[3]。近年來，由于煙草種植面積的調整，耕作制度及煙草品種的變化，煙草黑脛病和根黑腐病有加重趨勢^[1]。我國主要采用甲霜靈等化學農藥來防治黑脛病和根黑腐病，長期使用化學農藥容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，導致防治效果下降^[4]和環(huán)境污染。

生物防治是煙草病害防治中的重要方法之一。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種具有防治煙草黑脛病和根黑腐病的生防菌。例如綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）對煙草疫霉游動孢子的釋放抑制率達52.24 %，對煙草黑脛病的盆栽防效達96.29%^[5]。拮抗放線菌吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）能夠抑制煙草根黑腐病病原菌菌絲的生長，它的無菌濾液能夠抑制孢子萌發(fā)，即使孢子萌發(fā)，芽管也會畸形^[6]。本試驗在溫室條件下研究棘孢木霉T-6 對煙草生長發(fā)育的影響，探討其對煙草抗病性的誘導作用，旨在為進一步開發(fā)木霉制劑提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

1.1.1? 供試生防菌和病原菌 ?棘孢木霉（Trichoderma asperellum） T-6及煙草黑脛病菌和根黑腐病菌由本實驗室保存。

1.1.2? 供試煙草品種 ?云煙87。

1.1.3? 供試培養(yǎng)基? PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1000 mL）;燕麥培養(yǎng)基（燕麥30 g，瓊脂粉17 g，蒸餾水定容至1000 mL）。

1.2? 試驗地點和方法

1.2.1? 試驗地點 ?本試驗于2017—2018年在山東農業(yè)大學真菌和真菌病害實驗室進行。

1.2.2? PDA平板對峙拮抗試驗 ?黑脛病菌絲塊（直徑5 mm）接種至距培養(yǎng)皿平板（直徑9 cm）距中心2 cm處，25 ℃培養(yǎng)1 d后，在培養(yǎng)皿平板另一側距中心2 cm 處接種棘孢木霉T-6，以空白瓊脂塊為對照，28 ℃培養(yǎng)3 d后，測量黑脛病菌菌落直徑并計算抑菌率。抑菌率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。根黑腐病菌的對峙培養(yǎng)同上。

1.2.3? 孢子懸浮液的制備? 棘孢木霉T-6活化后在PDA平板上培養(yǎng)7 d，用無菌水洗脫孢子配制成濃度為1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹spores/mL的孢子懸浮液。黑脛病菌產(chǎn)孢采用梁元存等^[7]的方法，制備成濃度為1×10⁵spores/mL游動孢子懸浮液。根黑腐病菌活化后在PDA平板上培養(yǎng)10 d，用無菌水洗脫孢子配制成濃度為2×10⁵spores/mL的孢子懸浮液。

1.2.4? 棘孢木霉對煙草的促生作用 ?分別設定1×10⁷、1×10⁸和1×10⁹spores/mL的棘孢木霉T-6孢子懸浮液處理，每株煙草灌根接種20 mL孢子懸浮液（塑料盆內徑12 cm，高度10 cm）。以20 mL無菌水為對照。木霉處理60 d后，取出煙株用清水洗凈根部，自然條件下風干后測量煙株鮮質量、根長、莖粗、最大葉長、最大葉寬，將煙株放置于烘箱中105 ℃殺青30 min，60 ℃繼續(xù)烘干48 h，取出測量整株干質量。每處理15株，重復3次。

1.2.5? 棘孢木霉對黑脛病和根黑腐病防治效果? 從育苗盤中選擇長勢一致苗齡60 d的煙苗移栽，緩苗一周。處理組：每株煙草灌根接種20 mL 1×10⁸spores/mL棘孢木霉T-6孢子懸浮液，2 d后，再接種5 mL的1×10⁵spores/mL煙草黑脛病菌游動孢子懸浮液或5 mL的1×10⁵spores/mL煙草根黑腐病菌孢子懸浮液。對照組：不接種棘孢木霉T-6孢子懸浮液，只接種5 mL的1×10⁵spores/mL煙草黑脛病菌游動孢子懸浮液或5 mL的1×10⁵spores/mL煙草根黑腐病菌孢子懸浮液。每處理15株，重復3次。接種病原菌2周后，按照文獻[1]調查各處理煙株的發(fā)病情況，計算病情指數(shù)和相對防效。

1.2.6? 煙草根系活力的測定 ?根系活力的測定參考白寶璋等^[8]的方法。

1.2.7 ?煙草葉片生理指標的測定? 煙株用濃度為1×10⁸spores/mL的棘孢木霉T-6孢子懸浮液灌根處理后，在2、4、6、8、10、12 d時，各處理取從上至下數(shù)第4片展開的葉片，液氮速凍后研磨混勻，測定的生理指標和方法包括：葉綠素含量的測定參考李合生^[9]的方法，過氧化物酶（peroxidase，POD）的活性測定參考張龍翔^[10]的方法，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性測定參考高俊鳳^[11]的方法，過氧化氫酶（catalase，CAT）的活性測定參考劉萍等^[12]的方法。

1.2.8 ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計 ?采用 DPS軟件，Duncan新復極差法，在0.05水平上分析差異顯著性。

2? 結? 果

2.1 ?棘孢木霉T-6對黑脛病菌和煙草根黑腐病菌的拮抗作用

對峙培養(yǎng)3 d后，棘孢木霉T-6對煙草黑脛病菌、煙草根黑腐病菌的抑制率分別達49.62%、59.23%，對照組和處理組病原菌的菌落半徑差異顯著（表1）。

處理組病原菌菌落邊緣的菌絲稀疏、長勢減弱，而對照病原菌生長正常，呈圓形向四周擴展。繼續(xù)培養(yǎng)7 d后觀察到病原菌的菌落被棘孢木霉T-6吞噬覆蓋，說明棘孢木霉T-6能夠重寄生2種病原菌（圖1）。

2.2? 棘孢木霉T-6對煙株生長發(fā)育的影響

從表2可以看出，經(jīng)棘孢木霉T-6處理后，煙草的根長、株高、鮮質量、干質量均有明顯增加，而莖粗、最大葉長、最大葉寬沒有顯著變化。其中濃度為1×10⁸spores/mL和1×10⁹spores/mL時比濃度為1×10⁷spores/mL的促生效果好，但兩者之間差異不顯著，因此從經(jīng)濟的角度來看，使用濃度為1×10⁸spores/mL的棘孢木霉T-6孢子懸浮液更適合。此時，它的根長增加了58.14%，株高增加了45.37%，干質量增加了67.65%，鮮質量增加了77.44%。以上結果表明棘孢木霉T-6能有效改善煙草的農藝性狀，提高生物量。

2.3? 棘孢木霉T-6對煙草黑脛病的防治效果

如表3所示，接種棘孢木霉T-6后病情指數(shù)為16.08，對照組的病情指數(shù)為62.94，防治效果達到了74.45%。經(jīng)棘孢木霉T-6處理的煙苗，接種黑脛病菌后植株發(fā)病明顯推遲，發(fā)病程度較輕，植株生長發(fā)育正常。而對照煙苗發(fā)病嚴重，植株生長受到嚴重影響，葉片變黃枯萎（圖2）。以上結果說明棘孢木霉T-6可以增強煙草植株對黑脛病的抗病能力。

2.4? 棘孢木霉T-6對煙草根黑腐病的防治效果

如表4所示，經(jīng)棘孢木霉T-6處理的煙株發(fā)病較輕，其病情指數(shù)為13.71，顯著低于對照組55.14，對照植株生長受到嚴重影響（圖3），根系大多壞死且呈黑色。防治效果達到了75.14%。以上結果說明棘孢木霉T-6可以提高煙草對根黑腐病的抗病能力。

2.5 ?棘孢木霉T-6對煙草根系活力、葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響

從圖4A可以看出，在棘孢木霉T-6處理2、4、6、8、10、12 d后，煙草根系活力分別高出對照組的68.63%、50.82%、59.26%、53.45%、22.81%、1.70%。圖4B表明，處理組的葉綠素含量與對照組差異顯著，在棘孢木霉T-6處理2、4、6、8、10、12 d后，處理組的葉綠素含量分別高出對照組的9.58%、31.5%、50.63%、43.56%、27.9%、32.49%。圖4C表明，處理組的類胡蘿卜素含量與對照相比差異顯著，在處理2、4、6、8、10、12 d后，處理組的類胡蘿卜素含量分別高出對照組3.27%、44.44%、47.17%、35.23%、57.46%、45.26%。以上結果均表明，棘孢木霉T-6能夠提高煙草根系活力，增加煙草葉片葉綠素和類胡蘿卜素的含量。

2.6 ?棘孢木霉T-6對煙草葉片中POD、SOD、CAT酶活性的影響

圖5顯示，接種棘孢木霉T-6的煙草葉片酶活性要高于對照，其中在接種棘孢木霉T-6 4 d時，3種酶活性達到最大值，此時處理煙株葉片的POD、SOD、CAT酶活性分別比對照高出47.26%、27.52%、46.78%，在測定的12 d內，棘孢木霉處理的煙草3種酶活性均比對照高。這些結果表明棘孢木霉T-6能夠提高煙草體內防御酶的活性。

3? 討? 論

目前，國內外有關木霉對植物病原菌物病害的防治已有很多報道，但棘孢木霉菌在煙草上的生防研究較少。本試驗發(fā)現(xiàn)棘孢木霉T-6對煙草黑脛病的防治效果達到75.18%，對煙草根黑腐病的防治效果達到76.94%。說明棘孢木霉T-6可以增強煙草植株對黑脛病、根黑腐病的抗病能力。棘孢木霉T-6生長速度快，可較快占據(jù)營養(yǎng)空間，而且對兩種病原菌都具有一定的抑菌和重寄生作用，這是棘孢木霉T-6參與抗病的生防機制。

有研究發(fā)現(xiàn)棘孢木霉T437能夠促進黃瓜根系的生長^[13]。一些生防細菌如地衣芽孢桿菌W10對煙草根長、株高、鮮質量都有明顯的促生作用^[14]。本試驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過棘孢木霉T-6處理后，根長、株高、鮮質量、干質量都有顯著的增加。木霉菌株能和植物建立共生關系，通過穿透植物的表皮在植物根系定殖并且產(chǎn)生刺激植物生長和誘導植物防御反應的化合物。

葉綠素和類胡蘿卜素是是衡量植物光合作用能力的重要指標，對植物的生長起決定性作用。根系能夠吸收無機鹽和水分，并且合成一些重要的物質，它是植物的重要器官之一。有研究表明短芽孢桿菌DZQ3處理煙株后，煙草體內的葉綠素含量比對照高出17.03%，煙草的根系活力高出對照38.34%，并且顯著促進煙草的生長發(fā)育^[15]。吳秉奇等^[16]發(fā)現(xiàn)煙草根際拮抗菌多粘類芽孢桿菌處理煙草后，煙草體內的葉綠素含量比對照高出14.97%，根系活力比對照高出13.13%，煙草的農藝性狀和生物量都有顯著增加。本試驗表明，經(jīng)過棘孢木霉T-6處理后，煙草體內的葉綠素含量、類胡蘿卜素含量和根系活力均顯著高于對照組，最終提高煙草的光合速率，加快碳水化合物的合成以滿足煙草生長的需要，根系活力的提高有利于煙草根系吸收土壤養(yǎng)分，促進煙草的生長。這也是棘孢木霉T-6對煙草的促生長機制之一。

研究表明，生物因子和非生物因子等多種誘導因子可誘導植物系統(tǒng)抗性^[17-18]，導致植物體內SOD、POD、CAT等防御酶活性的升高。POD是植物體內的一種重要的防御酶，參與合成木質素，能夠催化酚類的氧化。SOD和CAT與植物體內活性氧的清除密切相關^[19]。張良等^[20]發(fā)現(xiàn)長柄木霉和涇陽鏈霉菌復配能夠顯著增加煙草體內SOD、POD、CAT的活性。FUCHS^[21]研究表明生防菌能使植株產(chǎn)生應激反應，誘導植物抗性的產(chǎn)生。本試驗研究表明，棘孢木霉T-6能夠顯著提高煙草葉片中POD、SOD、CAT的活性。其中處理組的POD、SOD、CAT的酶活性均在第4天時出現(xiàn)了峰值，并且酶活性一直高于對照組。這些結果表明棘孢木霉T-6可提高煙草抗病相關的酶活性，從而合成更多的抗病相關產(chǎn)物，增強煙草對病害的抵抗力。

4? 結 ?論

本試驗結果表明，棘孢木霉T-6能提高煙草對黑脛病和根黑腐病兩種土傳菌物病害的抗性和抗病相關防御酶活性，并對煙草有較好的促生作用。但本文試驗僅為溫室盆栽結果，關于棘孢木霉T-6田間應用效果還有待進一步研究。

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