氣調(diào)醇化過程中片煙細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化

陳善義 范堅強 李菁菁 何偉 顏奕華 陳義強 林儉 包可翔 張瑞強

摘 ?要：氣調(diào)醇化是片煙醇化的一種方法。微生物尤其是細(xì)菌在片煙醇化過程中對煙葉的吸食品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用。為研究氣調(diào)醇化過程中片煙細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，利用Illumina MiSeq測序平臺比較氣調(diào)防霉殺蟲階段（S1）、氣調(diào)醇化階段（S2）及氣調(diào)保質(zhì)階段（S3）共36份樣品的細(xì)菌16S rDNA序列的多樣性。結(jié)果表明，從S1到S3的過程中，片煙中細(xì)菌的物種豐富度和多樣性水平呈增加趨勢。S1階段片煙的優(yōu)勢種群為鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬和甲基桿菌屬，其占比在整個氣調(diào)醇化過程中呈逐漸下降趨勢;S2階段的優(yōu)勢種群為芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和伯克霍爾德菌屬，其中芽孢桿菌屬和伯克霍爾德菌屬在整個氣調(diào)醇化過程中占比呈先上升后下降的趨勢;S3階段細(xì)菌種群分布較為均勻。非度量多維尺度分析結(jié)果表明，3個醇化階段的樣品可以較明顯地區(qū)分開來?？梢姡瑲庹{(diào)醇化過程中片煙的細(xì)菌種群組成非常豐富，不同醇化階段活躍的微生物類群有所不同，鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬和甲基桿菌屬主要在醇化前期參與了煙葉醇化過程，而芽孢桿菌屬和伯克霍爾德菌屬則主要在醇化后期發(fā)揮著微生物醇化的作用。

關(guān)鍵詞：片煙;氣調(diào)醇化;16S rDNA;微生物區(qū)系

Alteration of Bacterial Community Structures of Tobacco Strips During Controlled Atmosphere Aging

CHEN Shanyi¹， FAN Jianqiang^1*， LI Jingjing^1*， HE Wei¹， YAN Yihua¹， CHEN Yiqiang¹，

LIN Jian¹， BAO Kexiang¹， ZHANG Ruiqiang²

（1. Technology Centre， China Tobacco Fujian Industrial Co.， Ltd.， Xiamen 361021， China; 2. Xiamen Tobacco Industrial Co.， Ltd.， Xiamen 361022， China）

Abstract： Controlled atmosphere aging （CAA） is a method of tobacco strips aging. Microorganisms， especially bacteria， play an important role in smoking quality of tobacco during the aging process. In order to study the alteration of bacterial community structure in tobacco strips during the process of CAA， the diversity of bacterial 16S rDNA sequences were carried out. 36 samples were compared by using Illumina MiSeq sequencing platform in three stages including the mildew and insect control stage（S1）， the aging stage （S2） and the quality guarantee stage（S3） . The results showed that the species richness and diversity of bacteria in tobacco strips increased from S1 to S3. The dominant populations of tobacco strips in S1 wereSphingomonas，PseudomonasandMethylobacterium， with a proportion of which gradually decreased during the whole process of CAA. The dominant populations in S2 wereBacillus，BurkholderiaandSphingomonas， with a proportion ofBacillusandBurkholderiaincreased first and then decreased in the whole process. The distribution of bacteria population in S3 was more uniform. Nonmetric multidimensional scaling analysis showed that the samples of three aging stages could be distinguished clearly. It was clear that the tobacco strips in CAA process harbored abundant levels of bacteria， and the active microbial groups were different in different aging stages.Sphingomonas，PseudomonasandMethylbacteriumwere mainly involved in the early process， whileBacillusandBurkholderiamainly played an important role in the later process.

Keywords： tobacco strips; controlled atmosphere aging; 16S rDNA; microbiota

片煙醇化是卷煙生產(chǎn)上提高煙葉吸食品質(zhì)的必經(jīng)環(huán)節(jié)。未經(jīng)醇化的煙葉存在雜氣重，吸味辛辣、煙氣不夠細(xì)膩、刺激性大等缺陷，需通過醇化以促使煙葉中對感官吸食品質(zhì)不利的化學(xué)成分充分轉(zhuǎn)化，達到吸味醇和的目的^[1]。氣調(diào)醇化法是片煙醇化的一種方法，其主要通過依次在氣調(diào)防霉殺蟲階段、氣調(diào)醇化階段和氣調(diào)保質(zhì)階段控制不同的氧氣濃度、溫濕度，實現(xiàn)片煙的防霉、殺蟲、醇化及延長片煙適宜使用期的目的^[2]。氣調(diào)醇化法相對于自然醇化法具有對環(huán)境友好（無需磷化鋁熏蒸）、醇化周期易于調(diào)控、醇化質(zhì)量最佳狀態(tài)保持時間較長等優(yōu)勢^[3]，在片煙的倉儲養(yǎng)護上得以逐步推廣和應(yīng)用。

煙葉醇化過程主要包括化學(xué)變化、酶催化和微生物作用3個方面。微生物尤其是細(xì)菌，在片煙醇化過程中對煙葉的吸食品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用^[4-5]。有關(guān)煙葉醇化過程中細(xì)菌區(qū)系變化的研究主要集中在自然醇化法^[6-10]，對于氣調(diào)醇化法鮮有報道。本課題組分析了云南沾益、貴州長順、福建尤溪、河南確山4個產(chǎn)地的片煙在自然醇化過程中細(xì)菌菌群的多樣性^[10]，然而對于氣調(diào)醇化過程中片煙菌群的動態(tài)變化尚不明確。為此，以上述產(chǎn)地的片煙為材料，在自然醇化3個月的基礎(chǔ)上，依次加以氣調(diào)防霉殺蟲、氣調(diào)醇化及氣調(diào)保質(zhì)處理并在各處理階段末尾取樣，利用Illumina MiSeq測序平臺比較氣調(diào)醇化過程中不同醇化階段片煙細(xì)菌16S rDNA序列的多樣性，明確細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，旨在為有益微生物的挖掘和氣調(diào)醇化技術(shù)的改進提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

試驗樣品為2014年生產(chǎn)的片煙，產(chǎn)地為云南沾益（品種為云煙87）、貴州長順（品種為云煙87）、福建尤溪（品種為CB-1）、河南確山（品種為云煙87），部位包含上部、中部、下部。片煙于廈門東孚煙葉倉庫采用氣調(diào)醇化法進行醇化。醇化過程分氣調(diào)防霉殺蟲（于氧氣濃度為2%的密封條件下保持3個月，代號S1）、氣調(diào)醇化（于氧氣濃度為8%的密封條件下保持6個月，代號S2）及氣調(diào)保質(zhì)（于氧氣濃度為2%的密封條件下保持6個月，代號S3）3個階段。試驗于2015年5月至2016年8月期間進行，于每個醇化階段結(jié)束后進行取樣。采用5點取樣法進行取樣，具體參照包可翔等^[10]的研究。整個試驗過程取樣36份（表1）。

1.2? 方法

1.2.1? 基因組DNA提取和PCR擴增? 樣品基因組DNA的提取和PCR擴增方法參照包可翔等^[10]的研究。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收目標(biāo)片段，用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美國Axygen公司，AP–GX–250）進行目標(biāo)片段的純化，然后用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit試劑盒（美國Invitrogen公司，P7589）和FLx800熒光酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）對擴增子進行定量，均一化后混勻。

1.2.2? MiSeq測序? 使用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit試劑盒（美國Illumina公司，F(xiàn)C-121-4003）對混勻后的擴增子進行文庫構(gòu)建。并利用Illumina MiSeq高通量測序平臺（上海派森諾生物科技股份有限公司）進行細(xì)菌16S rDNA測序。

1.2.3? 數(shù)據(jù)處理與分析? 使用Qiime 1.9.0軟件^[11]和Mothur 1.31.2軟件^[12]對測序所得的原始序列進行過濾、嵌合體去除，獲得優(yōu)質(zhì)序列。將獲得的優(yōu)質(zhì)reads以97%為劃定閥值進行操作分類單元（Operational taxonomic unit， OTU）聚類，并利用Greengenes數(shù)據(jù)庫（http：//greengenes.secondgenome. com/）^[13]進行注釋。剔除宿主葉綠體和線粒體序列后，統(tǒng)計各樣品細(xì)菌群落門、屬所占比例，最后利用Excel 2007軟件進行不同醇化階段樣品OTU的韋恩圖分析?；贠TU聚類結(jié)果，利用Mothur 1.31.2軟件對36份樣品的細(xì)菌群落進行α多樣性指數(shù)分析、樣品間非度量多維尺度（Nonmetric Multidimensional Scaling， NMDS）分析及基于主要屬所占比例的樣品聚類熱圖分析。Chao指數(shù)為估算樣品中微生物豐富度的指數(shù)^[14]，Shannon指數(shù)為估算樣品中微生物多樣性的指數(shù)^[15]。

某菌群所占比例（某菌群reads數(shù)/樣品總reads數(shù)）×100%。

2? 結(jié)? 果

2.1? 測序結(jié)果及α多樣性分析

36份片煙樣品平均獲得64 440條有效reads，去除低質(zhì)量reads后平均獲得60 937條優(yōu)質(zhì)reads，優(yōu)質(zhì)reads占有效reads數(shù)的94.56%。這些reads歸屬于1606個OTUs（包括36份樣品共有和特有OTUs）。其中，710個OTUs為3個醇化階段所共有，占總OTU個數(shù)的44.21%;S1、S2、S3階段特有的OTU個數(shù)分別為40、68、414，分別占總OTU個數(shù)的2.49%、4.23%、25.78%（圖1）。

隨著氣調(diào)醇化過程的進行，12個等級的片煙中細(xì)菌的平均OTU個數(shù)、Chao值指數(shù)表現(xiàn)增加的趨勢，表明細(xì)菌的物種豐富度增加;Shannon指數(shù)值也呈上升趨勢，說明細(xì)菌的多樣性隨著氣調(diào)醇化的進行而增加（表2）。S1、S2、S3階段兩兩之間的細(xì)菌物種豐富度和多樣性水平差異均達到極顯著水平。氣調(diào)醇化過程完成之后（S3），物種豐富度、多樣性指數(shù)平均值比氣調(diào)防霉殺蟲階段（S1）分別上升了232.25%和156.07%。

2.2? 門水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化分析

從各門的占比平均值方面來說（圖2），氣調(diào)醇化過程中片煙的細(xì)菌以變形菌門（Proteobacteria，平均占比43.20%～72.43%）、厚壁菌門（Firmicutes，平均占比11.49%～37.63%）為主，且變形菌門為優(yōu)勢菌門。隨著氣調(diào)醇化過程的進行，變形菌門占比從S1階段的72.43%逐漸下降至S3階段的43.20%，而厚壁菌門占比則從S1階段的11.49%逐漸上升至S3階段的37.63%;S1、S2階段的變形菌門平均占比差異顯著，厚壁菌門平均占比差異極顯著;而S2、S3階段的變形菌門和厚壁菌門平均占比差異均不顯著（表3）。

2.3? 屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化分析

由圖3可知，在能鑒定至屬水平的菌屬中，片煙氣調(diào)醇化過程中平均占比≥2%的細(xì)菌種群為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、紅球菌屬（Rhodococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、鏈球菌屬（Streptococcus）、伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）、乳球菌屬（Lactococcus）、李斯特菌屬（Listeria）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）、勞爾氏菌屬（Ralstonia）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、顫螺菌屬（Oscillospira）共15個菌屬。此外，S1、S2、S3階段分別有占比為38.08%、30.16%、42.48%的OTU無法鑒定至屬水平，表明氣調(diào)醇化過程中的片煙含有大量的未知細(xì)菌。

氣調(diào)醇化過程中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)變化較大。在能鑒定至屬水平的菌屬中，S1階段的細(xì)菌以鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬和甲基桿菌屬為相對的優(yōu)勢菌群（平均占比≥7%），S2階段則以芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和伯克霍爾德菌屬為優(yōu)勢菌群（平均占比≥7%），而S3階段的主要菌屬占比差異較小（2.11%～5.76%），細(xì)菌種群分布相對前2個階段而言較為均勻（圖3）。在能鑒定至屬水平的菌屬中，共有7個菌屬在氣調(diào)醇化過程中（S1至S3階段）占比發(fā)生了較大的變化。鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬、甲基桿菌屬在樣品中的平均占比表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢;芽孢桿菌屬、伯克霍爾德菌屬則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;乳酸菌屬、乳球菌屬總體上表現(xiàn)出上升的趨勢（表4）。

2.4? 不同醇化階段樣品間的NMDS分析及聚類分析

NMDS分析可通過樣本在低維空間中的排序情況來描述樣品間的距離遠(yuǎn)近關(guān)系，以考察不同樣品之間微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性。由圖4可知，總體上，3個醇化階段的樣品能明顯地區(qū)分開;S1、S2階段的樣品在NMDS二維圖上距離相對較近，而S3階段的樣品與S1、S2階段的樣品距離相對較遠(yuǎn)。這說明氣調(diào)保質(zhì)處理6個月后的片煙其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較前2個階段發(fā)生了明顯的變化。

熱圖（Heatmap）分析進一步說明了36份樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分組情況。由圖5可知，S1、S2階段大多數(shù)樣品（各10個，圖中藍(lán)色虛框標(biāo)注）形成一個小的分枝，S3階段的7個樣品（圖中紅色虛框標(biāo)注）形成另一小分枝;此外S3階段的3個樣品（圖中黑色虛框標(biāo)注）形成一個獨立的分枝。這說明S1、S2階段的樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較相似，S3階段的樣品與S1、S2階段樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，這與NMDS的分析結(jié)果相一致。

3? 討? 論

利用MiSeq高通量測序技術(shù)對氣調(diào)醇化過程中片煙的細(xì)菌進行16S rDNA多樣性分析，獲得了不同醇化階段細(xì)菌區(qū)系的變化規(guī)律。陳竹亭等^[7]對福建產(chǎn)地的上、中、下部自然醇化片煙的細(xì)菌多樣性研究表明，整個24個月的醇化過程中細(xì)菌的種類數(shù)有不明顯的減少。本研究發(fā)現(xiàn)，從S1到S3階段，細(xì)菌的OTU數(shù)目呈增加趨勢。造成這種差異的可能原因有以下2個方面：①氣調(diào)醇化法氧氣濃度較低，造成厭氧和兼性厭氧細(xì)菌得以大量繁殖;②測序方法不同。陳竹亭等^[7]的研究采用的是16S rDNA克隆文庫法，而本研究采用的是MiSeq高通量測序法，該方法能夠涵蓋更多序列，靈敏度更高。本研究中，氣調(diào)醇化過程中片煙表面的細(xì)菌在門分類水平上以變形菌門、厚壁菌門為主，這與龔俊^[9]對自然醇化烤煙的微生物區(qū)系的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著氣調(diào)醇化的進行，變形菌門的占比下降，厚壁菌門的占比上升，可能原因是厚壁菌門的大多數(shù)能產(chǎn)生芽孢，更能適應(yīng)不利的環(huán)境而得到富集。

在屬分類水平上，從S1階段到S3階段，有30.16%～42.48%的OTU無法鑒定至屬水平，表明醇化過程中的片煙含有大量的未知細(xì)菌，這與龔俊^[9]的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬、甲基桿菌屬、芽孢桿菌屬、伯克霍爾德菌屬、乳酸菌屬、乳球菌屬7個菌屬在氣調(diào)醇化過程中占比發(fā)生了較大的變化，它們當(dāng)中的某些屬在氣調(diào)醇化過程中對煙葉的醇化質(zhì)量可能起著重要的作用。研究表明鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬能降解煙葉中的煙堿^[16-18]。芽孢桿菌屬能降解煙葉中的蛋白質(zhì)^[19-21]、β胡蘿卜素^[21]、淀粉^[21-22]、纖維素^[20-21，23]、果膠^[20，24]、TSNAs^[25]、木質(zhì)素^[26]等物質(zhì)，生成對提升感官質(zhì)量有利的小分子物質(zhì)。S1階段以鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬和甲基桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，S2階段則以芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和伯克霍爾德菌屬為優(yōu)勢菌屬。因此，鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬和甲基桿菌屬可能主要在醇化前期參與了煙葉醇化過程，而芽孢桿菌屬和伯克霍爾德菌屬則可能主要在醇化后期發(fā)揮作用。甲基桿菌屬、伯克霍爾德菌屬、乳酸菌屬、乳球菌屬在片煙氣調(diào)醇化過程中起的作用有待于進一步的研究。本研究結(jié)果有助于揭示片煙氣調(diào)醇化的微生物作用機理，挖掘氣調(diào)醇化過程中的有益微生物并改進氣調(diào)醇化技術(shù)。

4? 結(jié)? 論

研究結(jié)果表明，片煙在氣調(diào)醇化過程中，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化，細(xì)菌的物種豐富度和多樣性水平呈增加之勢。在門分類水平上，變形菌門、厚壁菌門為優(yōu)勢菌門，在氣調(diào)醇化過程中占比分別呈下降、上升的趨勢。在屬分類水平上，氣調(diào)醇化過程中活躍的細(xì)菌主要為鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬、甲基桿菌屬、芽孢桿菌屬和伯克霍爾德菌屬;鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬和甲基桿菌屬主要在醇化前期參與了煙葉醇化過程，而芽孢桿菌屬和伯克霍爾德菌屬則主要在醇化后期發(fā)揮著微生物醇化的作用。

參考文獻

1. 王永紅，趙敏，潘廣樂，等. 倉儲方式對復(fù)烤煙葉醇化品質(zhì)及表面細(xì)菌多樣性的影響[J]. 煙草科技，2018，51（11）：36-42.

WANG Y H， ZHAO M， PAN G L， et al. Effects of storage methods on aging and bacterial diversity of redried tobacco[J]. Tobacco Science & Technology， 2018， 51（11）： 36-42.

1. 范堅強，陳義強，宋紀(jì)真，等. 一種四段式煙葉醇化方法：CN201210513271.8[P]. 2013-4-24.

FAN J Q， CHEN Y Q， SONG J Z， et al. Four-stages alcoholization method for tobacco： CN201210513271.8[P]. 2013-4-24.

1. 楊欣玲，楊永鋒，張俊嶺，等. 氣調(diào)貯存技術(shù)對片煙醇化質(zhì)量的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，46（10）：153-159.

YANG X L， YANG Y F， ZHANG J L， et al. Effect of controlled atmosphere storage （CAS） technology on the alcoholization quality of flue-cured tobacco lamina[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences， 2017， 46（10）： 153-159.

1. 曾曉鷹，楊金奎，段焰青，等. 煙葉生物酶活性與其等級和醇化時間的相關(guān)性[J]. 煙草科技，2009（5）：48-51.

ZENG X Y， YANG J K， DUAN Y Q， et al. Enzyme activities in flue-cured tobacco and their correlations with tobacco grades and aging duration[J]. Tobacco Science & Technology， 2009（5）： 48-51.

1. 朱大恒，陳銳，陳再根，等. 烤煙自然醇化與人工發(fā)酵過程中微生物變化及其與酶活性關(guān)系的研究[J]. 中國煙草學(xué)報，2001，7（2）：26-30.

ZHU D H，CHEN R，CHEN Z G，et al. The relationship between microorgnisms and enzyme activites in flue-cured tobacco during aging and fermentation[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2001， 7（2）： 26-30.

1. ZHAO M Q， WANG B X， LI F X， et al. Analysis of bacterial communities on aging flue-cured tobacco leaves by 16S rDNA PCR-DGGE technology[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2007， 73（6）： 1435-1440.
2. 陳竹亭，焉婷婷，湯朝起，等. 應(yīng)用16S rDNA克隆文庫技術(shù)分析陳化煙葉細(xì)菌多樣性[J]. 中國煙草學(xué)報，2012，18（4）：77-82.

CHEN Z T， YAN T T， TANG C Q， et al. Analyzing bacterial diversity in aging flue-cured tobacco leaves using 16S rDNA clone library analysis[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2012， 18（4）： 77-82.

1. 伍雪瑩，梁書利，韓雙艷，等. 不同陳化期烤煙葉表細(xì)菌的多樣性及發(fā)育分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，41（18）：28-33，38.

WU X Y， LIANG S L， HAN S Y， et al. Diversity and phylogenetic analysis of bacterial communities on flue-cured tobacco leaves at different aged phases[J]. Guangdong Agricultural Sciences， 2014， 41（18）： 28-33， 38.

1. 龔俊. 烤后片煙儲存過程中微生物多樣性及變化動態(tài)[D]. 上海：華東師范大學(xué)，2015.

GONG J. The diversity and dynamic of microorganism on flue-cured tobacco leaves during different aged phases[D]. Shanghai： East China Normal University， 2015.

1. 包可翔，林儉，何偉，等. 不同產(chǎn)地和部位對片煙自然醇化過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響[J]. 煙草科技，2017，50（4）：10-17.

BAO K X， LIN J， HE W， et al. Effects of growing area and stalk position on bacterial community structure in tobacco strips during aging[J]. Tobacco Science & Technology， 2017， 50（4）： 10-17.

1. CAPORASO J G， KUCZYNSKI J， STOMBAUGH J， et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nature Methods， 2010， 7（5）： 335-336.
2. SCHLOSS P D， WESTCOTT S L， RYABIN T， et al. Introducing mothur： open-source， platform- independent， community-supported software for describing and comparing microbial communities[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2009， 75（23）： 7537-7541.
3. DE SANTIS T Z， HUGENHOLTZ P， LARSEN N， et al. Greengenes， a Chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible in ARB[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2006， 72（7）： 5069–5072.
4. PITTA D W， PINCHAK W E， DOWD S E， et al. Rumen bacterial diversity dynamics associated with changing from bermudagrass hay to grazed winter wheat diets[J]. Microbial Ecology， 2010， 59（3）： 511-522.
5. CHAO A， SHEN T J. Nonparametric estimation of Shannon's index of diversity when there are unseen species in sample[J]. Environmental and Ecological Statistics， 2003， 10（4）： 429-443.
6. CHEN C M， LI X M， YANG J K， et al. Isolation of nicotine-degrading bacterium?Pseudomonas?sp. Nic22， and its potential application in tobacco processing[J]. International Biodeterioration & Biodegradation， 2008， 62（3）： 226-231.
7. LI H J， LI X M， DUAN Y Q， et al. Biotransformation of nicotine by microorganism： the case of?Pseudomonas?spp.[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2010， 86（1）： 11-17.
8. 楊貴芹. 兩株高效尼古丁降解菌的分離鑒定及其尼古丁代謝途徑的分析[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2011.

YANG G Q. Isolation， identification and nitotine metabolism pathways analysis of two nicotine-degrading bacteria[D]. Hangzhou： Zhejiang University， 2011.

1. 王繼蓮，李明源，馬永凱，等. 細(xì)菌酶制劑對煙葉中蛋白質(zhì)的降解作用研究[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2014，22（4）：486-494.

WANG J L， LI M Y， MA Y K， et al. Using bacterial enzyme to degrade protein in tobacco（Nicotiana tabacum） leaves[J]. Journal of Agricultural Biotechnology， 2014， 22（4）： 486–494.

1. 張鴿，梁開朝，辛玉華，等. 四個國家雪茄外包皮煙葉表面細(xì)菌分離與活性測定[J]. 中國煙草科學(xué)，2018，39（2）：82-88.

ZHANG G， LIANG K C， XIN Y H， et al. Isolation and activity determination of surface bacteria in cigar wrapper leaves from four different countries[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（2）： 82-88.

1. 薛磊，鄭澤浩，郭志剛，等. 煙草增香細(xì)菌的篩選及其作用效果[J]. 中國煙草科學(xué)，2019，40（5）：60-67.

XUE L， ZHENG Z H， GUO Z G， et al. Screening and application of aroma-enhancing bacteria for tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（5）： 60-67.

1. XIE F H， QUAN S J， LIU D H， et al. Purification and characterization of a novel α-amylase from a newly isolated?Bacillus methylotrophicus?strain P11-2[J]. Process Biochemistry， 2014， 49（1）： 47-53.
2. 倪涵，馬永凱，林連兵，等. 玉溪醇化煙葉表面細(xì)菌酶制劑對煙葉中淀粉和纖維素的降解作用[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2012，20（3）：268-274.

NI H， MA Y K， LIN L B， et al. Degrading starch and cellulose in tobacco leaves by bacteria enzyme agents isolated from Yuxi tobacco leaf surface[J]. Journal of Agricultural Biotechnology， 2012， 20（3）： 268–274.

1. KAUR S J， GUPTA V K. Production of pectinolytic enzymes pectinase and pectin lyase by?Bacillus subtilis?SAV-21 in solid state fermentation[J]. Annals of Microbiology， 2017， 67（4）： 333-342.
2. WEI X T， DENG X W， CAI D B， et al. Decreased tobacco-specific nitrosamines by microbial treatment with?Bacillus amyloliquefaciens?DA9 during the air-curing process of burley tobacco[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2014， 62（52）： 12701-12706.
3. 鄭艷紅，戴蕓蕓，楊洋，等. 廢次煙葉提取液源木質(zhì)素降解菌Bacillus subtilis?SM降解特性[J]. 微生物學(xué)通報，2017，44（7）：1525-1534.

ZHENG Y H， DAI Y Y， YANG Y， et al. Lignin degrading characteristics ofBacillus subtilisSM isolated from tobacco waste extract[J]. Microbiology China， 2017， 44（7）： 1525-1534.