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    氯胺B溶液在雞球蟲病疫苗培養(yǎng)及保存中的應(yīng)用

    2020-03-30 08:34:18宋予震李建華
    中國獸醫(yī)雜志 2020年11期
    關(guān)鍵詞:氯胺四價艾美耳

    董 青 , 宋予震 , 李建華

    (1. 吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 , 吉林長春130062 ; 2. 河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 , 河南鄭州450011)

    雞球蟲病(Coccidiosis)是雞常見且危害十分嚴(yán)重的寄生蟲病,是由一種或多種球蟲引起的急性流行性寄生蟲病。該病主要危害10~30日齡的雛雞或35~60日齡的青年雞,發(fā)病率高達50%~70%,致死率高達80%[1]。當(dāng)前對球蟲病的控制主要還是依靠抗球蟲藥,但由于抗球蟲藥物的廣泛使用甚至濫用,雞球蟲耐藥性的產(chǎn)生已成為無法避免的問題。因此,疫苗免疫開始成為對雞球蟲病進行防治的一個重要趨勢[2-4]。目前,生產(chǎn)上常用的雞球蟲疫苗為球蟲卵囊弱毒活疫苗[4-6]。但由于雞球蟲特有的發(fā)育繁殖方式,即雞卵囊必須經(jīng)過孢子化過程才具有感染性,因此,卵囊的培養(yǎng)及保存將直接關(guān)系疫苗的成本及免疫的成敗。目前在實驗室中可以使用的卵囊培養(yǎng)液通常為2.5%的重鉻酸鉀溶液[7]。但重鉻酸鉀是一種重金屬化合物,長期使用會殘留于動物機體和環(huán)境中,影響人類和動物健康。隨著人們生活的不斷提高,綠色畜牧業(yè)得到了快速發(fā)展,全社會對肉食食品安全問題和環(huán)境保護問題越來越重視。因此,尋找一種穩(wěn)定性好,無污染,具有廣譜殺菌能力的溶液作為雞球蟲卵囊培養(yǎng)液和保存液是必需的。本試驗旨在探討氯胺B(苯磺酰氯胺鈉鹽)溶液對雞球蟲病四價活疫苗(柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲)的培養(yǎng)和保存條件,并通過對其孢子化率和免疫保護效果進行檢測,探索保存雞球蟲活疫苗的有效、安全、無毒副作用的方法。

    1 材料與方法

    1.1 生產(chǎn)用種毒蟲株的來源 柔嫩艾美耳球蟲早熟減毒株(ETZZ株),分離自河南省鄭州市市郊某雞場;毒害艾美耳球蟲早熟減毒株(ENLY株),分離自河南省洛陽市某雞場;堆型艾美耳球蟲自然弱毒株(EAXY株),分離自河南省信陽市某雞場;巨型艾美耳球蟲自然弱毒株(EMZZ株),分離自河南省鄭州市市郊某雞場。這4種種毒蟲株在河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院進行早熟選育,純化后保存。

    1.2 實驗動物 SPF雞,由新興大華農(nóng)禽蛋有限公司SPF實驗動物中心提供。剛出殼后的1日齡SPF雞放入專用雞盒運回實驗室,在進行嚴(yán)格消毒的無球蟲的育雛室內(nèi)飼養(yǎng)至2~4周齡;禽舍的最初溫度控制在30~35 ℃,每周遞減2 ℃,直至室溫,濕度控制在55%~65%;24 h光照;飼喂經(jīng)高壓滅菌、無任何藥物添加的SPF雞全價育雛顆粒飼料;飲水引自天然泉水,采用純凈水設(shè)備經(jīng)過三重反滲透凈化處理,且加入紫外線和臭氧消毒,確保飲水無球蟲。

    1.3 雞球蟲病四價活疫苗 疫苗由河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院研制。利用成熟早熟選育技術(shù),在河南省雞球蟲病流行疫區(qū)分離的具有良好免疫原性的柔嫩艾美耳球蟲(Emeriatanella,E.tenella)、堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)、巨型艾美耳球蟲(E.maxima)及毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)作為雞球蟲病活卵囊疫苗的候選蟲株,研制了雞球蟲病四價活疫苗(柔嫩艾美耳球蟲ETZZ株+毒害艾美耳球蟲ENLY株+堆型艾美耳球蟲EAXY株+巨型艾美耳球蟲EMZZ株)。

    1.4 疫苗檢驗用蟲株 柔嫩艾美耳球蟲早熟減毒株(ETAY株),分離自河南省安陽市某雞場;毒害艾美耳球蟲早熟減毒株(ENSQ株),分離自河南省商丘市某雞場;堆型艾美耳球蟲自然弱毒株(EALZ株),分離自河南省林州市某雞場;巨型艾美耳球蟲自然弱毒株(EMPY株),分離自河南省濮陽市某雞場。這4種疫苗檢驗用蟲株在河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院進行早熟選育,純化后保存。

    1.5 主要試劑 氯胺B,購自百靈威科技有限公司;重鉻酸鉀,購自鄭州科邦生物科技有限公司;甘油,購自天津化學(xué)試劑科技有限公司;食鹽,購自蘭州市鹽業(yè)公司;次氯酸鈉,購自鄭州市德眾化學(xué)試劑公司。

    1.6 雞球蟲新鮮卵囊的制備 取生產(chǎn)用4種艾美耳球蟲蟲種溶液,孢子化卵囊計數(shù),稀釋成5.0×104個孢子化卵囊/mL。經(jīng)口感染10只2~4周齡SPF雞,每只接種1 mL(每只雞的感染量為5.0×104個孢子化卵囊),分別應(yīng)于感染后118、121、121 h和130 h檢出卵囊。分別收集感染后118~216 h、121~216 h、121~204 h、 130~204 h的糞便并分離卵囊,飽和鹽水漂浮法純化卵囊,然后用20%次氯酸鈉溶液處理卵囊,離心洗滌(3 000 r/min,10 min),收集卵囊。

    1.7 雞球蟲卵囊在氯胺B溶液中的孢子化 配制2.5%的重鉻酸鉀溶液及5種濃度的氯胺B溶液:0.6%、1.2%、2.4%、4.8%、10%;分別將新鮮收集的4種雞球蟲卵囊各分成7組,用100 mL不同濃度氯胺B溶液、高純水和2.5%重鉻酸鉀重懸,每組1.0×106個卵囊/mL,置于28 ℃水浴搖床震蕩培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后15、20、25、30、40 h和60 h,血球計數(shù)板計數(shù)法記錄孢子化卵囊的數(shù)量,計算孢子化率。

    1.8 無菌檢驗 卵囊孢子化結(jié)束后,每組孢子化卵囊按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進行無菌檢驗。

    1.9 雞球蟲病四價活疫苗在氯胺B溶液中保存時間的研究

    1.9.1 性狀檢驗和卵囊計數(shù) 分別將氯胺B溶液中保存的雞球蟲病四價活疫苗于2~8 ℃放置0、3、8、11個月和13個月,觀察各保存期的疫苗性狀是否發(fā)生變化;通過對各保存期疫苗中孢子化卵囊計數(shù),評價保存時間對疫苗卵囊數(shù)量的影響。

    1.9.2 效力檢驗 設(shè)計5次試驗,每次試驗分為9組,分別為4個免疫組、1個空白組和4個攻蟲對照組,每組10只SPF雞,分置隔離器內(nèi)飼養(yǎng)(添加薄膜)。5個批次免疫組試驗雞于3日齡分別經(jīng)口接種5個保存期(于2~8 ℃放置0、3、8、11個月和13個月) 的雞球蟲病四價活疫苗1羽份,接種后21 d進行攻蟲試驗,相同批次4個免疫組及相應(yīng)的4個攻蟲對照組試驗雞分別灌服5.0×104個柔嫩艾美耳球蟲安陽株(ETAY株)孢子化卵囊、5.0×104個毒害艾美耳球蟲商丘株(ENSQ株)孢子化卵囊、15.0×104個 堆型艾美耳球蟲林州株(EALZ株)孢子化卵囊、10.0×104個巨型艾美耳球蟲自然弱毒株(EMPY株)孢子化卵囊,觀察5~7 d,統(tǒng)計各組存活率,并剖檢所有試驗雞,檢查腸道部位(柔嫩艾美耳球蟲檢查盲腸;巨型及毒害艾美耳球蟲檢查小腸中段;堆型艾美耳球蟲檢查十二指腸)的病變并記分。

    1.10 氯胺B溶液的安全性試驗 配制1.2%氯胺B溶液。取3~5日齡SPF雞20只,隨機分為2組,試驗組10只雞,每只經(jīng)口灌服10倍使用劑量1.2%氯胺B溶液(100 μL);另10只雞作為空白對照組,分置隔離器中飼養(yǎng),觀察灌服后7~14 d內(nèi)雞體健康狀況,統(tǒng)計存活率及相對增重率。

    2 結(jié)果

    2.1 雞球蟲新鮮卵囊的制備 通過雞體傳代獲得ETZZ株新鮮卵囊4.4×107個/只、ENLY株2.1×107個/只、EAXY株7.6×107個/只和EMZZ株3.1×107個/只。

    2.2 雞球蟲卵囊在不同培養(yǎng)液中的孢子化 4種球蟲卵囊在1.2%的氯胺B溶液中孢子化25~40 h均可達到90%以上的孢子化率,其中EAXY株在25 h 即可達到90%以上的孢子化率,而EMZZ株在40 h才可達到90%以上的孢子化率,ENLY株和ETZZ株卵囊則在30 h即可達到90%以上的孢子化率,見表1。

    表1 4種卵囊在不同培養(yǎng)液中的孢子化率Table 1 Spore rate in different mediums of E. tenella strains

    2.3 無菌檢驗 除高純水組平板長滿細菌外,重鉻酸鉀和氯胺B組平板均未生長細菌。

    2.4 雞球蟲病四價活疫苗在氯胺B溶液中保存時間的研究

    2.4.1 性狀檢測和卵囊計數(shù) 重懸于氯胺B溶液中的雞球蟲病四價活疫苗分別于2~8 ℃放置0、3、8、11個月和13個月后,性狀均無明顯變化,仍為無色透明液體,瓶底有少許沉淀;卵囊數(shù)量無明顯變化,每羽份疫苗的卵囊數(shù)仍保持為(1 700±170)個。見表2。

    表2 不同保存時間雞球蟲病四價活疫苗的卵囊計數(shù)結(jié)果Table 2 Oocysts of tetravalent live vaccine agaist coccidiosism in different storage times

    2.4.2 效力檢驗 免疫新鮮雞球蟲病四價活疫苗于2~8 ℃保存11個月后仍可以保護4個攻蟲蟲株的感染,試驗雞剖檢后十二指腸、小腸及盲腸的病變記分均≤1分,而攻蟲對照組各試驗雞相應(yīng)腸道的病變記分均≥3分,空白組各試驗雞均健康存活。見表3。

    表3 雞球蟲病四價活疫苗(于2~8 ℃保存11個月)的免疫效力檢驗結(jié)果Table 3 Immunization efficiency of tetravalent live vaccine agaist coccidiosis in preservation of 11 months at 2~8 ℃

    但四價活疫苗于2~8 ℃保存13個月后對4個攻蟲蟲株的感染保護力降低,試驗雞剖檢后十二指腸、小腸及盲腸的病變記分均≥1分,而攻蟲對照組各試驗雞相應(yīng)腸道的病變記分均≥3分,空白組各試驗雞均健康存活。

    2.4.3 安全性試驗 給予10倍使用劑量1.2%氯胺B溶液后14 d內(nèi),所有試驗雞均健康存活,試驗組和空白對照組存活率均為100%;試驗組與空白對照組各試驗雞相對增重率均無明顯差異,試驗組和空白對照組相對增重率分別為99.8%和100%。

    3 討論

    2.5%的重鉻酸鉀溶液常作為雞球蟲卵囊培養(yǎng)液和保存液。它可以殺滅卵囊所攜帶的及環(huán)境中的微生物,減少競爭性氧消耗,有利于雞球蟲卵囊的保存[7]。但是重鉻酸鉀是一種重金屬化合物,長期使用會殘留于動物機體和環(huán)境中,影響人類和動物健康。近年來,我國不少學(xué)者在雞球蟲卵囊培養(yǎng)和保存的開發(fā)和應(yīng)用方面也取得了一些成績。

    龔振興等采用山梨酸鉀水溶液作為雞球蟲卵囊培養(yǎng)和保存液,試驗證實,1%~3%山梨酸鉀水溶液對卵囊孢子化不產(chǎn)生影響,且具有明顯的抑菌作用,能顯著提高在4 ℃下長時間保存的雞球蟲卵囊活力,如應(yīng)用到雞球蟲病活疫苗,將顯著提高疫苗保存期,降低生產(chǎn)成本[8]。

    譚志堅等采用氯胺T(對甲苯磺酰氯胺鈉)與純凈水以(0.5~8.0)∶100的比例經(jīng)充分搖勻制備而構(gòu)成的氯胺T溶液作為雞球蟲卵囊培養(yǎng)和保存液,經(jīng)過該培養(yǎng)液和保存液處理的球蟲卵囊,其孢子化率高達80%以上,無菌檢驗結(jié)果為陰性,雞球蟲卵囊在4~8 ℃保存9個月未受影響,效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的2.5%重鉻酸鉀溶液[9]。

    與氯胺T相似,氯胺B為白色或微黃的晶體或粉末,也是一種有機氯消毒劑,含有效氯26%~28%,易溶于水、穩(wěn)定性好,無污染,是一種具有廣譜殺菌能力的消毒劑。主要用于飲用水食具、水果蔬菜消毒、養(yǎng)殖水質(zhì)和搪瓷器具消毒。還可用于乳牛乳房及擠奶杯的清洗及家畜泌尿道和化膿創(chuàng)的沖洗消毒等。

    本試驗發(fā)現(xiàn),1.2%的氯胺B溶液中可使雞球蟲卵囊孢子化率提高至90%以上,同時抑制細菌的生長,對雞體無毒副作用。同時疫苗在2~8 ℃保存至11個月活力仍不受影響,表現(xiàn)出良好的免疫保護效果。

    綜上所述,1.2%的氯胺B溶液可以取代重鉻酸鉀作為雞球蟲活疫苗的培養(yǎng)和保存液。氯胺B溶液的發(fā)現(xiàn)克服了已有技術(shù)的一些缺點,實現(xiàn)了目前球蟲活疫苗技術(shù)生產(chǎn)工藝上的突破和創(chuàng)新,避免了重金屬物質(zhì)(重鉻酸鉀)或防腐劑(甲醛)在雞體內(nèi)的殘留和環(huán)境污染。

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