利福昔明軟膏劑中藥物含量檢測(cè)方法的建立

查 娜 , 徐 飛 , 蔣玲玉 , 李秀波

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 國(guó)家飼料藥物基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室 ， 北京 海淀 100081)

奶牛蹄病是奶牛業(yè)常見的重要疾病之一,該病輕則引起奶牛跛行，重則引起奶牛生產(chǎn)性能下降甚至淘汰。引起奶牛蹄炎的主要致病菌是鏈球菌、大腸埃希菌、沙門菌和酵母菌等病原菌[1]，目前在臨床上治療方法主要是藥物溶液浸泡或者肌內(nèi)注射普魯卡因青霉素等抗生素[2-4]。這些方法的弊端是只能改善牛的跛行癥狀，但不能從牛群中徹底消滅該病，此外藥物浸泡的方法也會(huì)對(duì)土壤和水體造成污染。利福昔明[5](Rifaximin)屬利福霉素類衍生物，是首個(gè)非氨基糖苷類半合成抗菌藥，具有局部給藥的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：它口服不易吸收、安全、高效、低殘留且抗菌譜廣，對(duì)大多數(shù)環(huán)境菌有較好療效。在奶牛乳房炎和奶牛子宮炎癥的防治上具有較好的應(yīng)用[6]。開發(fā)利福昔明局部給藥制劑對(duì)治療奶牛臨床疾病具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也可以有效預(yù)防用藥后耐藥性的產(chǎn)生，以達(dá)到預(yù)防和治療動(dòng)物疾病，減少養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失的目的，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

本試驗(yàn)室開發(fā)了一種奶牛蹄病局部用利福昔明軟膏劑。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)該制劑的質(zhì)量情況，本試驗(yàn)開發(fā)并建立了該利福昔明軟膏劑中藥物含量的檢測(cè)方法，并應(yīng)用于該制劑的穩(wěn)定性試驗(yàn)評(píng)價(jià)中。

1 材料與方法

1.1 材料 高效液相色譜儀(Waters 2695)，購(gòu)自美國(guó)Waters公司；色譜柱:WondaSil C18-WR 250 mm×4.6 mm，5 μm，日本島津公司；凡士林、丙三醇、羊毛脂，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；利福昔明軟膏劑(15 g∶45 mg)， 由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所國(guó)家飼料藥物基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)；利福昔明對(duì)照品(含量為95.7%，批次為130542-200601)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；利福昔明原料藥(含量為98.1%，批次為80621-91-4)，購(gòu)自浙江思賢制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 利福昔明軟膏劑的制備 將利福昔明無菌粉經(jīng)超微粉碎得到利福昔明無菌微粉，按比例加入凡士林[7]、乳化劑以及防凍劑溶劑，35 ℃條件下150 r/min 持續(xù)攪拌0.5 h后，加入利福昔明藥物，繼續(xù)攪拌1 h得最終制劑。

1.2.2 利福昔明軟膏劑中藥物含量方法建立

1.2.2.1 色譜條件 流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相D為0.1%(v/v)甲酸水溶液。程序梯度見表1；柱溫:40 ℃；進(jìn)樣量:20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng):276 nm。

表1 利福昔明的流動(dòng)相梯度及流速Table 1 Mobile phase gradient and flow rate of rifximine

1.2.2.2 對(duì)照品工作溶液配制 精密稱取利福昔明對(duì)照品10.45 mg(相當(dāng)于利福昔明10.00 mg)，將稱量的對(duì)照品用甲醇溶解稀釋，再轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容，最終制備成 100 μg/mL 的對(duì)照品工作液。分別取適量并用甲醇稀釋為60 μg/mL的工作液，進(jìn)樣20 μL至液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

1.2.2.3 樣品前處理 精密稱取利福昔明軟膏劑1.0 g(相當(dāng)于利福昔明3.0 mg)于50 mL離心管中，加入乙腈25 mL，渦旋5 min，置于25 ℃超聲水浴中30 min，4 000 r/min離心5 min；將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，精密量取上層溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖[8-9]。

1.2.2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 參考《中國(guó)獸藥典》(2015年版)附錄66要求，將供試品儲(chǔ)備液用流動(dòng)相稀釋成濃度為60 μg/mL的溶液，取20 μL注入高效液相色譜儀，記錄對(duì)稱因子、理論塔板數(shù)。將對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋成濃度為60 μg/mL的對(duì)照品溶液，取20 μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5針，考察重復(fù)性。

1.2.2.5 方法專屬性 考察了空白流動(dòng)相、空白輔料、對(duì)照品(60 μg/mL)及供試品(60 μg/mL)的方法色譜行為。

1.2.2.6 方法確證 通過檢測(cè)限、定量限、準(zhǔn)確度、精密度和線性范圍共5個(gè)方面進(jìn)行考察。采用逐步稀釋的方法[10]，按信噪比S/N≥3和S/N≥10計(jì)算檢測(cè)限和定量限；將利福昔明軟膏劑配方，配成高、中、低3個(gè)濃度的樣品(15 g∶54 mg、15 g∶45 mg、15 g ∶36 mg)，按照利福昔明軟膏劑含量測(cè)定所示方法處理樣品，日內(nèi)測(cè)5次，共測(cè)5 d，通過計(jì)算回收率考察準(zhǔn)確度；線性范圍是將利福昔明對(duì)照品制備成不同濃度的工作溶液，濃度分別為40、50、80、100、120 μg /mL和160 μg /mL，按照HPLC(高效液相色譜)法進(jìn)行檢測(cè)[11]，以峰面積對(duì)濃度作線性回歸，求出回歸方程及相關(guān)系數(shù)；精密度考察是將利福昔明軟膏劑按照1.2.2.1的色譜條件和1.2.2.3的樣品處理方法，配制成濃度為60 μg /mL的溶液進(jìn)行測(cè)定，以利福昔明峰面積計(jì)算回收率及變異系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性和系統(tǒng)適應(yīng)性

2.1.1 方法專屬性 取空白流動(dòng)相20 μL注入液相色譜儀，結(jié)果表明，空白流動(dòng)相對(duì)檢測(cè)并無干擾。將凡士林、羊毛脂及丙三醇按照比例制成無藥物添加的空白輔料，按照1.2.2.3方法處理后取20 μL進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，空白輔料對(duì)藥物峰無明顯干擾。以1.2.2.2和1.2.2.3所述方法操作分別得到利福昔明標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(圖1)及利福昔明軟膏劑藥物主峰色譜圖(圖2)。從圖中結(jié)果可見，利福昔明主成分峰與其他色譜峰完全分離，說明方法專屬性良好。

圖1 利福昔明標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖(60 μg/mL)Fig.1 Solution chromatogram of rifaximin standard(60 μg/mL)

圖2 利福昔明供試品溶液色譜圖(60 μg/mL)Fig.2 Chromatogram of test product solution(60 μg/mL)

2.1.2 系統(tǒng)適應(yīng)性 結(jié)果如表2所示，主峰出峰時(shí)間為10.308 min，峰面積為1 736 363，對(duì)稱因子在0.9～1.1，連續(xù)進(jìn)樣5針，所得RSD為0.23%，該方法系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

表2 系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)果Table 2 Results of system adaptability

2.2 方法檢測(cè)限與定量限 采用逐步稀釋的方法，按信噪比S/N≥3計(jì)算，檢測(cè)限LOD值為0.2 μg/g，按信噪比S/N≥10計(jì)算，定量限LOQ值為0.6 μg/g。

2.3 方法準(zhǔn)確度與精密度 理論上分別稱取原料藥54、45、36 mg，配制成高、中、低3個(gè)濃度的樣品，按照日內(nèi)測(cè)5次，日間測(cè)5次的方法，所得平均回收率分別為100.12%、98.16%和95.94%，日間變異系數(shù)分別為3.10%、2.59%和3.93%，準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results of accuracy and precision

2.4 方法的線性關(guān)系 按照HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，以利福昔明峰面積對(duì)利福昔明濃度作線性回歸，求出回歸方程Y=-9 378.26X+24 821.86，相關(guān)系數(shù)r2=0.999。利福昔明軟膏劑在40～160 μg /mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，如圖3。

圖3 利福昔明標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Rifaximin standard curve

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 利福昔明藥物含量檢測(cè)方法主要采用高效液相色譜法，目前采用較多的方法是歐洲藥典EP 8.0[12]，主要采用276 nm檢測(cè)波長(zhǎng)，甲酸銨甲醇等度洗脫條件。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由于其成分含鹽，極易造成色譜柱堵塞[13]，增加了儀器維護(hù)成本。因此，本試驗(yàn)優(yōu)化了利福昔明檢測(cè)方法，建立了一種不含鹽的流動(dòng)相體系，主要采用乙腈∶0.1%甲酸(v∶v)，與EP 8.0方法相比，該方法的峰面積更大，峰高更高，響應(yīng)更好，峰型較為尖銳。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本試驗(yàn)從190～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)233.7～293 nm處檢測(cè)響應(yīng)較好，基于以上結(jié)果，分別選擇了239 nm及276 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，考察其對(duì)供試品及對(duì)照品的波形、響應(yīng)、雜質(zhì)的檢測(cè)，結(jié)果表明，239 nm波長(zhǎng)下的響應(yīng)高于276 nm，但波形在14.00～20.00 min內(nèi)出現(xiàn)基線漂移。故選擇276 nm為本檢測(cè)方法的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 結(jié)果 該HPLC法線性良好，在40～160 μg/mL濃度范圍內(nèi)，藥物濃度與峰面積呈線性相關(guān)。高、中、低3個(gè)濃度的平均回收率分別為 100.12%、98.16%、95.94%，日間變異系數(shù)分別為 3.10%、2.59%、3.93%，表明該法的準(zhǔn)確性和精密性良好，本文建立了檢測(cè)利福昔明軟膏劑含量的HPLC方法。該方法檢測(cè)限為0.2 μg/g，定量限(LOQ)為0.6 μg/g，以 80、100、120 μg /mL 3個(gè)濃度水平進(jìn)行添加回收，回收率在95.94%～100.12%，日內(nèi)變異系數(shù)在1.45%～3.51%，日間變異系數(shù)<3.93%。