山東牛輪狀病毒的分離鑒定及其卵黃抗體應(yīng)用試驗(yàn)

秦曉冰 ， 周建梅 ， 張洪亮 ， 單 虎

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 山東 青島 266109)

牛輪狀病毒(Bovine rotavirus，BRV)屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，是以引起犢牛精神沉郁、食欲減退和水樣腹瀉為主要特征的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)的傳染病，常伴有繼發(fā)感染而引起犢牛死亡[1-2]。BRV普遍存在于污染的飼料、器具、飲水及患病牛的排泄物中，消化道為主要的傳播途徑，多發(fā)于30日齡內(nèi)的犢牛，成年牛往往呈隱性感染而持續(xù)排毒。犢牛感染BRV尚無特效療法，通常采取隔離和對(duì)癥治療，常因犢牛心衰和代謝性酸中毒而導(dǎo)致死亡，死亡率高達(dá)50%以上[3]。

BRV為雙鏈RNA病毒，包含6種結(jié)構(gòu)蛋白VP1～VP4、VP6、VP7和6種非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1～NSP6，根據(jù)VP4和VP7外殼蛋白基因型的差別BRV可以分為G型和P型，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有12個(gè)G型和11個(gè)P型[4]。VP4、VP6、VP7這3種結(jié)構(gòu)蛋白有良好的免疫原性，成為疫苗的研究熱點(diǎn)，但不同基因型之間的交叉保護(hù)性差，使得BRV疫苗研究非常困難[5-6]。卵黃抗體作為一種特異性免疫球蛋白，已經(jīng)在家禽和家畜的多種病毒病的防治中取得了顯著的效果，但有關(guān)BRV的緊急預(yù)防與治療的報(bào)道還非常鮮見[7]。

本試驗(yàn)利用山東省犢牛腹瀉病料分離鑒定了BRV，制作了油乳劑滅活苗，并用該滅活苗多次免疫蛋雞，利用純化的卵黃抗體對(duì)犢牛進(jìn)行了攻毒保護(hù)試驗(yàn)，旨在為犢牛BRV提供安全良好的保護(hù)，為有效預(yù)防和治療犢牛BRV提供了一種新思路。

1 材料與方法

1.1 樣本與細(xì)胞系 2018年7月在山東省萊西市某牧場(chǎng)采集犢牛腹瀉樣品6份，BRV參考毒株、MA-104(恒河猴胎腎傳代細(xì)胞系)和兔抗牛源牛輪狀病毒VP6重組蛋白的陽(yáng)性血清，由山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；瓊脂糖、50×TAE、核酸提取試劑盒，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DL-2 000 DNA Marker、HiScriptII One Step RT-PCR Kit(Dye Plus)，均購(gòu)自Vazyme公司；0.25% DETA-胰酶，購(gòu)自Gibco公司。Biofuge primor高速臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(H-2050-R1型，湖南長(zhǎng)沙湘怡檢測(cè)設(shè)備有限公司)；超低溫冰箱(MDF382E型，SANYO公司)；PCR擴(kuò)增儀(Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600)；電子天平(德國(guó)Sartorius BS-210S)；瓊脂糖水平電泳槽(DYCD-31D，北京六一儀器有限公司)；電泳儀(Powerpac basic型，BIO-RAD)；光凝膠成像系統(tǒng)(AT126D型，臺(tái)灣)。

1.3 病毒分離培養(yǎng) 用pH 7.0的PBS把病料稀釋成0.2 g/mL的懸液，振蕩2 min，5 000 r/min離心10 min，取上清。上清液除菌后加入終濃度為20 μg/mL 的胰酶，37 ℃激活30 min，接種1 mL于鋪滿單層MA104細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37 ℃培養(yǎng)1 h，每瓶加入7 mL終濃度1 μg/mL胰酶細(xì)胞維持液，5%的CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，逐天觀察，培養(yǎng)96 h后收毒。按上述方法繼續(xù)傳8代后，細(xì)胞出現(xiàn)穩(wěn)定病變80%以上時(shí)收毒，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒純化與毒價(jià)測(cè)定 將BRV病毒液加入到蜀牛瓶，加入NaCl和聚乙二醇PEG 6 000， 使其終濃度分別為2.5%和10%，4 ℃攪拌過夜，離心收集沉淀，加入緩沖液和氯仿后，離心收集上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將激活的病毒液混合物用DMEM營(yíng)養(yǎng)液10倍梯度稀釋，從10-1到10-8稀釋液依次吸取100 μL接種到長(zhǎng)滿單層MA104細(xì)胞的96孔細(xì)胞板上，設(shè)6個(gè)重復(fù)與正常細(xì)胞對(duì)照。37 ℃、5%的 CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，加入100 μL的無血清終濃度1 μg/mL胰酶細(xì)胞維持液。連續(xù)觀察5 d，計(jì)錄細(xì)胞病變的孔數(shù)，按照Reed-Muench法計(jì)算病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量TCID50。

1.5 病毒鑒定。

1.5.1 RT-PCR 鑒定 根據(jù)GenBank登錄的輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)株NCDV和代表株IND株的高保守區(qū)VP6基因，設(shè)計(jì)上游引物：5′-GTCGAAGGCACATTATACTCC-3′；下游引物：5′-GATTGTGGTGCAATTCCATTT-3′。引物由上海派森諾生物科技有限公司合成，目的片段長(zhǎng)度為284 bp。按TaKaRa 核酸提取試劑盒說明書進(jìn)行病毒RNA提取，以RNA樣品為反轉(zhuǎn)錄模板，依照HiScriptII One Step RT-PCR Kit(Dye Plus)說明書進(jìn)行VP6基因的RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(50 μL)：基因組RNA 2 μL，引物(20 μmol/L) 各2 μL，One Step Enzyme Mix 2.5 μL，2×One Step Mix 25 μL，RNase free ddH2O 16.5 μL。反應(yīng)程序：50 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定后回收。

1.5.2 病毒的電鏡觀察 將20 μL的病毒液滴在銅網(wǎng)上，靜置20 min，吸去多余毒液，加5 μL的磷鎢酸染色液染色4 min，用濾紙吸干，置透射電鏡下觀察。

1.6 BRV卵黃抗體的制備與效價(jià)檢測(cè) BRV病毒液中加入甲醛調(diào)終濃度為0.2%，混勻，37 ℃滅活48 h，將滅活液用1.3方法盲傳3代，檢查細(xì)胞有無病變。將滅活液與弗氏不完全佐劑按1∶2混合并充分乳化，2 mL/只三點(diǎn)肌內(nèi)注射140日齡雞，免疫后21 d和42 d各加強(qiáng)免疫1次，同時(shí)設(shè)立注射生理鹽水對(duì)照組。收集首免后7～70 d的雞蛋，采用水稀釋硫酸銨鹽析法提純卵黃抗體，采用瓊脂擴(kuò)散法(AGP)測(cè)定收集的卵黃抗體IgY效價(jià)[8-9]。

1.7 BRV卵黃抗體保護(hù)試驗(yàn) 將血清和糞便BRV抗體均為陰性的初生牛犢分為試驗(yàn)組(A)和對(duì)照組(B)，每組5頭。試驗(yàn)組犢牛出生后6 h，飼喂卵黃抗體膏1次(20 g/頭)，24 h后重復(fù)飼喂，3日齡始每日上、下午各喂食1次卵黃抗體粉(10 g/頭)，飼喂至18日齡，對(duì)照組不使用抗體。犢牛4日齡檢測(cè)糞便BRV為陰性后隔離飼養(yǎng)，2組全部經(jīng)口接種BRV，劑量為2 mL/頭(TCID50=10-5.62/mL)。4～7日齡，上下午各飼喂代用乳2L/頭，8日齡后上下午各加喂250 g犢牛顆粒料，自由飲水。分別于犢牛1、4、5、8、11、14日齡和18日齡采用RT-PCR檢測(cè)糞便BRV；用ELASA試劑盒檢測(cè)犢牛血清IgG，并用酶標(biāo)儀讀取吸光值(OD值)，計(jì)算抗體對(duì)BRV的抑制率，抑制率/%=[(陰性對(duì)照OD值-樣本OD值)/陰性對(duì)照OD值]×100%。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離、純化及毒價(jià)測(cè)定 病料接種MA104細(xì)胞后，盲傳至第4代開始出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPU)，第8代CPU穩(wěn)定。在接毒48 h后出現(xiàn)細(xì)胞固縮、變圓，72 h后細(xì)胞多數(shù)死亡，細(xì)胞液變黃，出現(xiàn)明顯CPU，陰性對(duì)照細(xì)胞無病變，見中插彩版圖1。經(jīng)蝕斑純化，病毒滴度為10-5.62TCID50/mL。

2.2 病毒鑒定

2.2.1 RT-PCR鑒定 純化的病毒培養(yǎng)物經(jīng)過RT-PCR擴(kuò)增出284 bp的特異性條帶，見圖2，與預(yù)期目標(biāo)條帶一致。經(jīng)BLAST比對(duì)，與GenBank中BRV的VP6基因序列相似性為99%，從分子水平證實(shí)該分離毒株為BRV，命名為SD-LX株。

圖2 分離BRV毒株的RT-PCR鑒定Fig.2 Isolated BRV RT-PCR identification1：陰性對(duì)照； 2：陽(yáng)性對(duì)照； 3：分離毒株培養(yǎng)物； M：DL-2 000 DNA marker1：Negative control; 2：Positive control; 3：Isolated BRV cultures; M：DL-2 000 DNA marker

2.2.2 SD-LX株電鏡觀察 將SD-LX株培養(yǎng)物電鏡下觀察，可見直徑60～70 nm的病毒粒子，呈典型的車輪狀形態(tài)(圖3)。

圖3 SD-LX株培養(yǎng)物透射電鏡觀察Fig.3 SD-LX viral cultures observed through transmission electron microscope

2.3 SD-LX株卵黃抗體的制備與效價(jià) 滅活的SD-LX株病毒液接種于MA104細(xì)胞和盲傳3代未有CPU，對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)典型CPU。BRV油苗注射產(chǎn)蛋母雞免疫后，卵黃抗體消長(zhǎng)規(guī)律見圖4。由圖4可知，油苗首免后2～3周IgY效價(jià)約在1.8 log2，二免后達(dá)到4.8 log2，三免后第2周可測(cè)得IgY抗體效價(jià)達(dá)到峰值6 log2，之后處于約5.5 log2。

圖4 免疫SD-LX株油苗后卵黃抗體制劑抗體效價(jià)消長(zhǎng)規(guī)律Fig.4 IgY titers after immunized oil vaccine of SD-LX strain

2.4 卵黃抗體對(duì)犢牛保護(hù)試驗(yàn) 攻毒后12～24 h，對(duì)照組犢牛均出現(xiàn)體溫升高，試驗(yàn)組有2頭正常，3頭升高。試驗(yàn)期內(nèi)對(duì)照組犢牛體重降低，并出現(xiàn)不同程度的腹瀉；試驗(yàn)組體重2頭升高，3頭降低，降低的犢牛出現(xiàn)輕微腹瀉。犢牛糞便BRV檢測(cè)見表1。由表1可知，卵黃抗體對(duì)A2、A3起到了良好的保護(hù)作用，治愈率為40%。

表1 攻毒前后犢牛糞便BRV檢測(cè)Table 1 BRV in calf stools tested before or after challenges

根據(jù)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)分離的犢牛血清進(jìn)行BRV的IgG檢查結(jié)果與酶標(biāo)儀讀取的OD值(陰性對(duì)照：2.742 4；陽(yáng)性對(duì)照：0.069 9)，計(jì)算陽(yáng)性抑制率，結(jié)果見中插彩版圖5。由圖5可知，A2與A3抗體水平較其他個(gè)體高，A1、A4、A5的抗體水平低于A2、A3，但總體高于對(duì)照組。經(jīng)Duncan氏法分析，18日齡犢牛A1、A2、A3、A4抗體水平極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，A5顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，說明卵黃抗體有效率為100%，但因犢牛的個(gè)體差異治療效果不同。

3 討論

倪亞煒1985年在北京地區(qū)檢測(cè)了29份牛糞便，BRV的陽(yáng)性率為55.2%[10]。李鑫等[11]在2005—2006年間對(duì)我國(guó)山東省、山西省、北京市、內(nèi)蒙古等12個(gè)省市自治區(qū)的不同年齡、不同品種的1 760份 牛血清進(jìn)行了BRV感染調(diào)查，發(fā)現(xiàn)總體陽(yáng)性率達(dá)到了99%。張坤等[12]2014—2015年在新疆部分地區(qū)奶牛場(chǎng)，采集犢牛腹瀉糞便91份，BRV陽(yáng)性率為23.08%～90.91%。王牧川等[13]2015年對(duì)重慶市的8個(gè)肉牛場(chǎng)81份腹瀉糞便樣品進(jìn)行BRV檢測(cè)，陽(yáng)性率為66.7%。表明BRV在我國(guó)分布廣，危害性持久，是引起犢牛腹瀉的主要原因之一，制約了養(yǎng)牛業(yè)的持續(xù)發(fā)展。

本試驗(yàn)采用MA104細(xì)胞分離BRV，優(yōu)選濃度為20 μg/mL的胰蛋白酶處理病毒接種物以及無血清的終濃度為1 μg/mL胰蛋白酶的維持液，與魏鎖成等[14]探討的BRV細(xì)胞培養(yǎng)方法和葛雨[15]分離BRV的胰蛋白酶濃度均有所不同。表明BRV的分離培養(yǎng)與分離株的特性、病料新鮮度及陽(yáng)性病料中病毒的含量等有著密切的關(guān)系。本試驗(yàn)檢測(cè)BRV的PCR靶基因是編碼VP6蛋白的基因節(jié)段，該片段是A群RV的特異性抗原，在BRV不同血清型之間具有高度的保守性，是檢測(cè)BRV的首選靶基因[16]。這與周芳等[5]和陸亞東等[17]采用RT-PCR鑒定BRV的方法是一致的。

1973年美國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)BRV的G6型減毒疫苗，是目前世界上唯一商品化的BRV疫苗，我國(guó)BRV疫苗防控尚處于研發(fā)階段。常繼濤等[18]依據(jù)我國(guó)地區(qū)BRV流行株G6和G10，制作減毒疫苗免疫產(chǎn)前奶牛，犢牛通過哺乳獲得母源抗體從而獲得保護(hù)，為疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。卵黃抗體(IgY)是禽類血清中的免疫球蛋白(IgG)轉(zhuǎn)移到卵黃中形成的特異性多克隆抗體，因質(zhì)優(yōu)價(jià)廉、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，近年來廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病防控領(lǐng)域[19]。本試驗(yàn)采用水稀釋法，結(jié)合鹽析與透析來提純BRV的IgY，對(duì)出生4日齡的犢牛進(jìn)行了攻毒后口服保護(hù)試驗(yàn)，有效率與對(duì)照組相比達(dá)到了100%，治愈率為40%。這與Vega等[20]研究報(bào)道的口服BRV的IgY對(duì)犢?？商峁?0%的保護(hù)，且能減少BRV導(dǎo)致犢牛死亡率研究結(jié)果相符。本試驗(yàn)人工感染犢牛BRV，犢牛口服卵黃抗體獲得了有效的保護(hù)，表明IgY可以用于犢牛BRV的預(yù)防與治療。