復(fù)方一枝蒿顆粒離乳前SD大鼠非臨床安全性評價研究

田義超，周 莉，龐 聰，毛閃閃，崇立明，李 俊，李 艷，冷英莉，孫祖越*

(1.湖北天勤生物科技有限公司武漢分公司，武漢 430075； 2.上海市計劃生育科學(xué)研究所藥理毒理學(xué)研究室，中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心，上海 200032； 3.新疆銀朵蘭維藥股份有限公司，烏魯木齊 830013)

兒童處于生長發(fā)育的特殊時期，器官的生理功能尚未發(fā)育成熟，對藥物的毒性敏感性與成年人具有較大差異[1-2]。近年來，兒科用藥的安全性評價越來越受到重視，2017年國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心頒布了《兒科用藥非臨床安全性研究技術(shù)指導(dǎo)原則(征求意見稿)》[3]，對兒科用藥非臨床安全性評價方案的設(shè)計提供了參考依據(jù)。復(fù)方一枝蒿顆粒為抗感冒的純中藥制劑，主要組成為新疆一枝蒿、板藍(lán)根和大青葉等，具有解表祛風(fēng)、涼血解毒的作用，多年臨床應(yīng)用表明其對感冒的治療具有顯著療效，在新疆具備良好的民眾基礎(chǔ)和認(rèn)知度[4-5]。目前，已有文獻報道復(fù)方一枝蒿顆粒對剛離乳大鼠非臨床安全性評價的研究，可支持3歲以上兒童用藥的臨床申報[6]，為了擴大用藥人群至1歲以上兒童，充分評價復(fù)方一枝蒿顆粒的安全性，本研究選取離乳前SD大鼠為研究對象，并遵照藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范(GLP)進行試驗，為兒童用藥提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD孕鼠(GD15，妊娠第15天)43只，體重360～440 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2016-002]，幼鼠160只，于PND15開始給藥，體重35～50 g。飼養(yǎng)于湖北天勤生物科技有限公司武漢分公司屏障系統(tǒng)[SYXK(鄂)2016-0090]，環(huán)境溫度20℃～26℃，日溫差≤4℃，濕度40%～70%，換氣次數(shù)每小時≥15次，光照每12小時明暗交替。實驗動物的使用遵循3R原則，動物使用前向本機構(gòu)的動物福利倫理委員會提出申請，批準(zhǔn)編號：IACUC(準(zhǔn))-2018-044。

1.2 主要試劑與儀器

復(fù)方一枝蒿顆粒干膏粉(新疆銀朵蘭維藥股份有限公司，批號：T180422)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，湖州展望藥業(yè)有限公司，批號：20170701)；戊巴比妥鈉(德國默克公司，批號：CK1604BM)；血清生化與血液學(xué)檢測試劑(希森美康生物科技有限公司)；凝血檢測試劑(美國Instrumentation Laboratory公司)；電解質(zhì)檢測試劑(梅州康利高科技有限公司)；尿液檢測試劑(長春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司)；激素檢測試劑(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

BX-3010全自動生化分析儀、XN-1000IV全自動模塊式血液體液分析儀(日本SYSMEX公司)；Klite8G多參數(shù)電解質(zhì)分析儀(梅州康利高科技有限公司)；ACL TOP300 CTS全自動凝血分析儀(西班牙沃芬公司)；H800干化學(xué)尿液分析儀(長春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司)；ASP300S全自動脫水儀、RM2235輪轉(zhuǎn)切片機(德國Leica公司)；Mb-Ⅱ全自動包埋儀(武漢賽爾思科技有限公司)；BX53生物顯微鏡(日本Olympus公司)；iMark酶標(biāo)儀(美國Bio-RAD公司)；UltraFocus小動物骨密度儀(美國Faxitron公司)；JLBehv-LAG-4自發(fā)活動分析系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司)；ZH-300B大鼠轉(zhuǎn)棒式疲勞儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；1056004大鼠避暗實驗視頻分析系統(tǒng)(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 離乳前大鼠單次給藥毒性實驗

亂作為的背后，往往是扭曲的政績觀在作祟。為了能迅速樹立自己的“能人形象”，充分展示自己的“治理能力”，少數(shù)干部特別熱衷上項目，搞工程。而進一步梳理中央“打虎”榜單，我們還不難發(fā)現(xiàn)，那些“政績項目”“形象工程”的背后，也往往隱藏著權(quán)錢交易的魅影。

圖1 以5只雄性胎仔為例交叉撫育設(shè)計舉例Figure 1 Examples of fostering design for 5 male juvenile rats

給藥期結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束，各劑量組血液學(xué)和凝血指標(biāo)與溶媒對照組比較均未見毒理學(xué)意義上的差異。

1.3.2 離乳前大鼠重復(fù)給藥毒性實驗

購入的36只孕鼠分娩后，其中20窩符合交叉撫育要求(每窩出生的幼鼠數(shù)至少4♀4♂)，將母鼠及其幼鼠進行交叉撫育分組，PND1-2仔鼠和母鼠按交叉撫育表分入各窩，各窩按照母鼠編號隨機分為復(fù)方一枝蒿顆粒低、中和高劑量組(17.6、44.0和70.4 g/kg)，為藥效學(xué)起效劑量的88、220、352倍)和溶媒對照組(0.5% CMC-Na)，每窩含幼鼠4♀4♂，每組幼鼠20♀20♂。幼鼠PND15開始給藥，每天灌胃1次，連續(xù)28 d，給藥體積20 mL/kg。每天觀察動物一般癥狀；給藥第1周隔天測1次體重，之后每周測2次；離乳后每周測2次攝食量；指定時間點進行行為學(xué)、陰道張開、動情周期、睪丸下降和龜頭包皮腺裂開檢測；解剖前進行眼科和尿液檢查；給藥結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束，分別剖殺2/3和1/3動物，進行血液學(xué)、凝血、血液生化、電解質(zhì)、睪丸精子頭計數(shù)、性激素、生長激素、骨骼系統(tǒng)、免疫指標(biāo)、臟器重量和臟器系數(shù)等指標(biāo)的檢測，并剖檢進行組織病理學(xué)檢查。

The ideality factor of the CuInGeSe4/n-Si heterojunction is actually extracted from the slope of the linear part of ln I against the V feature with the aid of the subsequent equation[25]:

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 離乳前大鼠單次給藥毒性實驗

2.2.13 臟器重量及系數(shù)

2.2 離乳前大鼠重復(fù)給藥毒性實驗

2.2.1 一般癥狀觀察

例3：某高校重大事項未嚴(yán)格依法依規(guī)進行決策，涉及金額681.9萬元。某高校經(jīng)校長辦公會研究決定“同意啟動新校區(qū)一至六飯?zhí)煤团f校區(qū)飯?zhí)媒y(tǒng)一招標(biāo)工作”，收取承包費。3年合計收取承包管理費 （折舊費）681.9萬元。上述事項雖經(jīng)集體討論決定，但決策結(jié)果不符合教育部《關(guān)于進一步加強高等學(xué)校學(xué)生食堂工作的意見》第二點規(guī)定的高校內(nèi)食堂的建筑設(shè)施由該高校統(tǒng)一提供，對承包經(jīng)營都實行零租賃，免收管理費。

給藥期及恢復(fù)期所有大鼠外觀體征、行為活動、姿勢、飲水和被毛，對外界刺激反應(yīng)、腺體分泌物和呼吸狀態(tài)等均正常。

自然科學(xué)類、社會科學(xué)類說明文閱讀，是廣東語文高職高考的一項重要考查內(nèi)容，有9分的分值，以選擇題的形式出現(xiàn)?；谄吣陙韽V東省語文高職高考的真題，筆者認(rèn)為，只要掌握一定的閱讀和答題方法，拿到滿分并非難事，現(xiàn)總結(jié)出一些閱讀方法和答題技巧，以供參考。

2.2.2 體重

正因如此，GE Digital的“三步走”發(fā)展策略，即GE For GE、GE For Customers、GE For World是很務(wù)實的。在邏輯上，前兩步都正確，但第三步踩了“知識壁壘”的紅線，“For World”哪是那么容易？這中間恐怕省略了“For Other Industries”“For USA”等重要步驟，以及為了驗證和優(yōu)化這些重要步驟所必需的長期沉淀與反復(fù)打磨。GE Digital多跨出去的那一步，就是導(dǎo)致其業(yè)務(wù)停擺的短板——知識壁壘。

高劑量組雄鼠體重第3天至第27天均低于溶媒對照組，高劑量組雌鼠體重第3天至第20天均低于溶媒對照組，與溶媒對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，其他時間點與溶媒對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見圖2。

注：a：雄鼠體重；b：雌鼠體重；與溶媒對照組比較，**P <0.01。圖2 復(fù)方一枝蒿顆粒對大鼠體重的影響Note. a, Weight of male rats. b, Weight of female rats. Compared with solvent control group,**P <0.01.Figure 2 Effect of compound Yizhihao particles on body weight of rats

2.2.3 攝食量

2.2.4 生長激素

雌雄鼠各劑量組攝食量與對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

下次適應(yīng)算法NF(Next Fit)：最簡單也是最早研究的算法是NF算法。它的特點是至始至終保持一個當(dāng)前打開的箱子，在要將貨品裝入到箱子時，查看這個貨品能不能裝入到當(dāng)前打開的箱子，如果可以則裝入。如果沒有辦法裝進去，就新打開一個空的箱子作為當(dāng)前的箱子，將貨品裝入。這個算法裝箱的效率不高，原因是只有現(xiàn)在打開的箱子和空的箱可以作為選擇裝入貨品。

雌雄鼠各劑量組生長激素與對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

2.2.5 眼科檢查

給藥期結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束，對各組動物眼睛進行檢查，未發(fā)現(xiàn)眼瞼、結(jié)膜、角膜、瞳孔和虹膜等組織異常變化。

從表4可以看出不同入料壓力下大直徑旋流器的分級效果。入料壓力為0.09 MPa時，旋流器溢流中小于0.125 mm粒級含量為32.46%，底流中大于0.25 mm粒級含量為67.87%，小于0.125 mm粒級含量為10.74%；旋流器溢流中細(xì)粒級含量高，底流中細(xì)粒級含量低，說明分級效果良好。

2.2.6 行為學(xué)測試

給藥中期、給藥期結(jié)束和恢復(fù)期結(jié)束前，分別進行平衡協(xié)調(diào)能力、自發(fā)活動和學(xué)習(xí)記憶能力測試，各劑量組行為學(xué)指標(biāo)與溶媒對照組比較均未見毒理學(xué)意義上的差異。

2.2.7 生殖功能

給藥期結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束，分別進行性激素水平(雌二醇、睪酮)檢測和雄鼠睪丸精子頭計數(shù)，各劑量組生殖功能指標(biāo)與溶媒對照組比較均未見毒理學(xué)意義上的差異。

給藥期結(jié)束，雄鼠高劑量組頂臀長和脛骨長小于溶媒對照組，與溶媒對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見表1。給藥期結(jié)束和恢復(fù)期結(jié)束，各劑量組骨密度和骨礦含量與溶媒對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

2.2.8 性發(fā)育標(biāo)志

廣汽新能源智能生態(tài)工廠于2017年9月正式開工建設(shè)，總投資47億元，占地面積703畝（約46.9萬平方米），是廣汽智聯(lián)新能源汽車產(chǎn)業(yè)園的首個項目，發(fā)揮著帶動產(chǎn)業(yè)集聚的龍頭作用。首期生產(chǎn)能力為20萬輛/年，計劃于2019年5月投產(chǎn)。

各劑量組雌鼠陰道張開時間、動情周期數(shù)和雄鼠睪丸下降時間、龜頭包皮腺裂開時間與溶媒對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

2.2.9 骨骼系統(tǒng)

社區(qū)管理者隊伍整體素質(zhì)的高低，直接關(guān)系到社區(qū)建設(shè)的質(zhì)量，關(guān)系到社區(qū)管理科學(xué)化水平。如果社區(qū)管理者能自覺做到以身作則，勤政廉潔，必將進一步強化服務(wù)意識，更好地承擔(dān)起黨和人民賦予的光榮使命，為廣大居（村）民服好務(wù)。

2.2.10 血液學(xué)和凝血

購入的7只孕鼠分娩后，其中5窩滿足交叉撫育要求(每窩出生的幼鼠數(shù)至少5♀5♂)，選擇其中3窩(每窩幼鼠體重平均值接近，且體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異，剩余2窩淘汰)，見圖1，按照母鼠的隨機號分為復(fù)方一枝蒿顆粒低、高劑量組(70.4、88.0 g/kg)和溶媒對照組(0.5% CMC-Na)，每窩含幼鼠5♀5♂，見圖1。幼鼠PND15開始給藥，24 h內(nèi)單次給藥，給藥體積為20 mL/kg。觀察第1、2、3、5、7、10和14天動物的體重、死亡情況及毒性反應(yīng)。實驗過程中出現(xiàn)死亡的動物及時進行大體解剖，其他動物在觀察期結(jié)束后進行大體解剖，當(dāng)肉眼觀察組織器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時，進行組織病理學(xué)檢查。

2.2.11 血液生化、電解質(zhì)和免疫

給藥期結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束，各劑量組血液生化、電解質(zhì)和免疫指標(biāo)與溶媒對照組比較均未見毒理學(xué)意義上的差異。

(4)分級機分級效率與磨礦細(xì)度之間關(guān)系。分級機的分級效率越高，磨機產(chǎn)量和效率也越高；反之，出現(xiàn)過磨現(xiàn)象，導(dǎo)致磨機產(chǎn)量和效率降低，對后續(xù)工藝流程影響也很大。

(5)病者困劇身體痛，則謂鬼持杖毆擊之，若見鬼[把]椎鎖繩立守其旁，病痛恐懼，妄見之也。(東漢《論衡》)

2.2.12 尿液

給藥期結(jié)束前進行尿液檢測，中、高劑量組尿膽紅素陽性比例高于溶媒對照組，與溶媒對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，見表2?；謴?fù)期結(jié)束，各劑量組各尿液指標(biāo)與溶媒對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

動物死亡情況：給藥第2天(24 h)高劑量組3只動物(1♂2♀)死亡。雄鼠體重：給藥第2天至第14天低、高劑量組體重出現(xiàn)明顯下降，與溶媒對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。雌鼠體重：給藥第2天低、高劑量組體重出現(xiàn)明顯下降，與溶媒對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，其他時間點未見統(tǒng)計學(xué)差異。大體解剖：對給藥第2天死亡的動物進行大體解剖，均可見胃內(nèi)充滿棕褐色疑似藥物的液體，氣管、食管和肺未見異常；對觀察期結(jié)束的動物進行大體解剖，各組織臟器均未發(fā)現(xiàn)肉眼可見異常。在本實驗條件下，SD大鼠(PND15)單次灌胃給予復(fù)方一枝蒿顆粒干膏粉的最大耐受量(MTD)為70.4 g/kg。

高原反應(yīng)極可能造成兒童死亡，并且多為突發(fā)癥狀。急診治療和護理高原反應(yīng)要求護理人員專業(yè)，及時，且能夠根據(jù)患兒癥狀采取最佳的護理方案。降低反應(yīng)影響程度，確?；純航】?。對高原反應(yīng)急診就診患兒護理的具體要求如下。

給藥期結(jié)束，低、中和高劑量組肝臟體比及臟腦比均高于溶媒對照組，中、高劑量組肝臟體比高于溶媒對照組，高劑量組肝臟腦比高于溶媒對照組，與溶媒對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，見表3。恢復(fù)期結(jié)束，各劑量組各臟器重量及臟器系數(shù)與溶媒對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

2.2.14 組織病理學(xué)檢查

與溶媒對照組相比，高劑量組各臟器未見明顯與受試物相關(guān)的病理改變，恢復(fù)28 d后，亦未見明顯延遲性毒性病理改變。

表1 復(fù)方一枝蒿顆粒對雄鼠骨骼系統(tǒng)的影響

注：與溶媒對照組相比，*P<0.05,**P<0.05。

Note. Compared with the solvert control group,*P<0.05,**P<0.05.

表2 復(fù)方一枝蒿顆粒對大鼠尿液指標(biāo)的影響

注：與溶媒對照組相比，*P<0.05,**P<0.05。

Note. Compared with the solvert control group,*P<0.05,**P<0.05.

表3 復(fù)方一枝蒿顆粒對大鼠臟器重量及系數(shù)的影響

注：與溶媒對照組相比，*P<0.05,**P<0.05。

Note. Compared with the solvert control group,*P<0.05,**P<0.05.

3 討論

常規(guī)的非臨床毒理學(xué)研究通常采用嚙齒類動物(大鼠)和非嚙齒類動物(犬、小型豬等)。大鼠作為實驗?zāi)Ｐ途哂谐浞值慕?jīng)驗，擁有大量的背景數(shù)據(jù)，大鼠相應(yīng)的發(fā)育階段，可涵蓋中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、肺臟系統(tǒng)、腎臟系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等靶器官的所有出生后發(fā)育階段。同時，復(fù)方一枝蒿顆粒的藥效學(xué)資料表明對模型大鼠有效[7]，根據(jù)原國家食品藥品監(jiān)督管理總局制定的《藥物重復(fù)給藥毒性試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》(2014年)[8]和《兒科用藥非臨床安全性研究技術(shù)指導(dǎo)原則(征求意見稿)》(2017年)[3]對動物選擇的建議，本研究采用大鼠作為實驗動物。

幼齡動物非臨床安全性研究受多種因素的影響，最典型的是年齡，初始給藥時動物的發(fā)育年齡需與兒科用藥目標(biāo)人群的年齡相匹配[9-10]。復(fù)方一枝蒿顆粒臨床擬用人群為1歲以上幼兒，幼鼠PND15(離乳前)首次給藥，此時動物年齡與臨床擬用兒童年齡相當(dāng)[11]。

離乳前大鼠非臨床研究中窩的構(gòu)成(窩內(nèi)幼鼠的分配方法)有窩內(nèi)設(shè)計(within litter design)、窩間設(shè)計(between litter design)、1只幼仔/性別/窩(One pup per sex per litter design)和交叉撫育設(shè)計(fostering design)。其中，交叉撫育設(shè)計為幼仔出生后，立刻由新的母鼠撫養(yǎng)，每窩的構(gòu)成都是由其他窩的幼仔組成；新的撫育窩內(nèi)，無任何同性兄弟姐妹；所有幼仔接受同樣的給藥處理，該設(shè)計將窩效應(yīng)和遺傳傾向最小化[12]，故本研究采用交叉撫育設(shè)計方法。

離乳前大鼠單次給藥毒性實驗：①給藥第2天觀察到復(fù)方一枝蒿顆粒高劑量組(88.0 g/kg)出現(xiàn)3只幼齡動物死亡，大體解剖胃內(nèi)有藥液，但肺、食管、氣管未見異常，與灌胃操作失誤無關(guān)，與供試品的毒性相關(guān)；低劑量組(70.4 g/kg)和溶媒對照組無動物死亡。②給藥第2天低、高劑量組雌雄幼鼠體重出現(xiàn)明顯下降，認(rèn)為幼齡動物死亡和體重下降原因與大劑量給予受試物后的毒性相關(guān)。離乳前SD大鼠(PND15)單次灌胃給予復(fù)方一枝蒿顆粒的最大耐受量(MTD)為70.4 g/kg。

離乳前大鼠重復(fù)給藥毒性實驗：①雄鼠高劑量組第3天至第27天體重及雌鼠高劑量組第3天至第20天體重均低于溶媒對照組(P<0.01)，認(rèn)為大劑量灌胃給予復(fù)方一枝蒿顆粒28 d，可減緩雌雄幼齡大鼠的體重增長。②給藥期結(jié)束，雄鼠高劑量組頂臀長和脛骨長均小于溶媒對照組(P<0.05或P<0.01)，結(jié)合給藥期雄鼠體重明顯下降，認(rèn)為灌胃給予復(fù)方一枝蒿顆粒28 d，可導(dǎo)致雄鼠頂臀長和脛骨長降低。③給藥期結(jié)束，雌雄幼齡大鼠中、高劑量組BIL陽性率高于溶媒對照組，結(jié)合參考文獻[6]，同樣發(fā)現(xiàn)中、高劑量組動物尿液BIL陽性率偏高，但均未檢測到肝組織病理學(xué)以及相關(guān)血液學(xué)和血液生化指標(biāo)的異常變化。盡管BIL的變化考慮與受試物無關(guān)，但建議臨床大劑量長期給予受試物時注意監(jiān)測這些指標(biāo)的變化。④給藥期結(jié)束，雄鼠低、中和高劑量組肝臟體比及臟腦比與雌鼠中、高劑量組肝臟體比及雌鼠高劑量組肝臟腦比高于溶媒對照組(波動范圍9.2%～20.2%)，結(jié)合參考文獻[6]，同樣發(fā)現(xiàn)高劑量組動物肝臟體比及臟腦比偏高，本試驗血清ALT、AST等相關(guān)指標(biāo)無異常，肝組織病理學(xué)亦未見明顯異常，且恢復(fù)期結(jié)束肝重量和系數(shù)均可恢復(fù)，推測該變化為微粒體酶的誘導(dǎo)作用，即肝的適應(yīng)性反應(yīng)，而與受試物毒性無關(guān)。

綜上所述，在本試驗所設(shè)定的條件下，離乳前SD大鼠(PND15)單次灌胃給予復(fù)方一枝蒿顆粒的最大耐受量(MTD)為70.4 g/kg，重復(fù)灌胃給予復(fù)方一枝蒿顆粒28 d毒性實驗的最大無毒反應(yīng)劑量(NOAEL)為44.0 g/kg。