布魯氏菌及其疫苗的相關(guān)研究

韓文東，瞿 滌,2*

(1.上海復(fù)旦大學(xué)三級生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 2.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部/衛(wèi)健委醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032)

布魯氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)是嚴(yán)重影響人類健康的細(xì)菌性人畜共患傳染病[1]，世界范圍內(nèi)每年新發(fā)人感染布病病例超過50萬[2]。我國自2000年以來，布病感染范圍從北方畜牧地區(qū)迅速擴(kuò)展至沿海及東南部地區(qū)[3]，且呈持續(xù)上升趨勢。實(shí)驗(yàn)室獲得性布魯氏菌感染也常見報道[4]。人感染布病最常見的途徑是食入未經(jīng)消毒的牛奶、奶制品或直接接觸感染動物的分泌物、流產(chǎn)物等[5]，而人與之間的傳播則相對罕見?；颊吒腥静剪斒暇蠹s90%病例出現(xiàn)急性發(fā)作的波狀熱，并伴隨頭疼、關(guān)節(jié)痛、盜汗、疲勞與厭食癥，易誤診為感冒癥狀。如不及時治療，病程可長達(dá)數(shù)年，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、附睪-睪丸炎、神經(jīng)脊柱炎、肝脾膿腫以及心內(nèi)膜炎，嚴(yán)重者可能死亡。牧民、屠宰工人及醫(yī)院檢驗(yàn)相關(guān)的醫(yī)護(hù)人員因職業(yè)因素，發(fā)病率高于普通人群[6]。此外，布魯氏菌還可通過氣溶膠途徑擴(kuò)散傳播，成為生物武器和生物恐怖主義青睞的潛在工具[7]。

人感染布病的主要途徑是接觸感染動物[8]，對畜群進(jìn)行疫苗接種被證實(shí)是控制人感染布病的有效策略，蒙古在WHO協(xié)助下連續(xù)進(jìn)行了11年的羊群的疫苗接種，人類布病的發(fā)病率從1974年4.8/10萬下降到1981年的0.23/10萬[9]。雖然疫苗接種對控制布病流行具有重要作用，但目前布病疫苗存在保護(hù)時間短、血清學(xué)檢測無法區(qū)分免疫/感染以及毒力回復(fù)等問題[10]。布病研究雖然取得了不少階段性成果，但在許多國家布病仍然持續(xù)或再現(xiàn)[11]。因而，對布魯氏菌病原學(xué)、流行病學(xué)、疫苗學(xué)等各方面的研究尚有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

1 布魯氏菌生物種及感染宿主范圍

歷史資料顯示，布病起源于地中海地區(qū)[12]。羊布魯氏菌(Brucellamelitensis,B.melitensis)導(dǎo)致的布病又名馬耳他熱，其致病原首先由英國軍醫(yī)David Bruce于1887年分離出而命名為布魯氏菌(Brucella)。丹麥獸醫(yī)學(xué)家Bang[13]于1897年從患病牛體內(nèi)分離出可導(dǎo)致流產(chǎn)的牛布魯氏菌(B.abortus)。經(jīng)過一個多世紀(jì)的研究，布魯氏菌屬菌株不斷被發(fā)現(xiàn)。1914年Mohler等人[14]從感染豬的肝脾分離出豬布魯氏菌(B.suis)。1952年從新西蘭公羊附睪中分離出天然R型(Rough，粗糙型)綿羊附睪型布魯氏菌(B.ovis)[15]。1957年從美國西部地區(qū)野生沙林鼠中分離到沙林鼠布魯氏菌(B.neotomae)[16]。1966年從美國一家犬養(yǎng)殖場的流產(chǎn)胎犬組織中分離到犬布魯氏菌(B.canis)[17]。1994年至1998年間，從海洋生物中分離到B.pinnipidialis(海豚和鯨魚)和B.ceti(海豹)[18]。2007年從田鼠和紅狐分離到田鼠布魯氏菌B.microti[19]。2008年從奧地利紅狐分離出慢生長布魯氏菌B.vulpis[20]。2010年Scholz等人[21]從發(fā)生感染的乳房植入物分離到B.inopinata，其自然宿主尚不清楚，后來從蛙類標(biāo)本中亦分離到同種菌株。2014年從狒狒的宮頸拭子中分離到B.papionis，但是否感染狒狒及對其他動物的致病性也尚無進(jìn)一步研究[22]。

綜上，世界范圍內(nèi)目前發(fā)現(xiàn)的布魯氏菌基于細(xì)菌學(xué)、宿主偏好與致病性，結(jié)合分子分型與全基因組測序共確定了12個生物種，包括“經(jīng)典”的布魯氏菌6種，B.melitensis、B.abortus、B.suis、B.canis、B.ovis和B.neotomae；以及“新現(xiàn)”布魯氏菌6種，B.microti、B.pinnipidialis、B.ceti、B.inopinata、B.papionis和B.vulpis。

布魯氏菌對于宿主的偏好與其命名的生物種并非一一對應(yīng)，某一布魯氏菌在實(shí)驗(yàn)研究或自然條件下可感染除其主要宿主的其他動物，如牛布魯氏菌的自然宿主是牛，但同時可感染羊群、野豬和駱駝(表1)。此外，“新現(xiàn)”布魯氏菌擴(kuò)展了人類對其宿主種類與地理分布范圍的認(rèn)識，不同布魯氏菌之間可能存在基因的水平轉(zhuǎn)移，這對布病的防控提出了更嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

2 布魯氏菌胞內(nèi)存活機(jī)制

布魯氏菌是兼性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，其致病性與細(xì)菌在胞內(nèi)的存活密切相關(guān)，在此過程中其細(xì)胞壁發(fā)揮了主要作用。布魯氏菌細(xì)胞壁主要由外膜和肽聚糖組成，其外膜包括脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)、外膜蛋白(脂蛋白、通道蛋白)和磷脂[23]。LPS由脂質(zhì)A、核心單糖(core oligosaccharide)與O-多糖(O-polysaccharide，O-PS)組成，是布魯氏菌主要的表面抗原，具有親水性[24-26]。S型(Smooth，光滑型)菌株有完整的脂多糖(S-LPS)結(jié)構(gòu)，而R型菌落則為不完整的LPS，缺乏O-多糖，主要通過基因組wbk基因簇中perosamine合成相關(guān)基因突變或缺失所致。布魯氏菌的LPS與大腸桿菌相比，具有低內(nèi)毒素活性、高度抵抗巨噬細(xì)胞降解以及介導(dǎo)細(xì)菌對宿主免疫應(yīng)答的保護(hù)，從而利于細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)存活和增殖，從而在動物體內(nèi)呈持續(xù)感染狀態(tài)(persistence)。而缺乏O-PS的R型菌株則無法在巨噬細(xì)胞及感染動物中長期存活[24]。布魯氏菌S-LPS的O-PS含有誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的主要抗原決定簇，而R型菌落的免疫原主要是核心單糖和外膜蛋白。研究結(jié)果顯示，針對O-PS的多克隆/單克隆抗體均可有效保護(hù)小鼠抵抗S型菌株的感染，而針對R-LPS表位設(shè)計的特異性單克隆抗體對小鼠抵抗S型菌株(B.abortus)感染的保護(hù)作用不大，但對抵抗天然R型菌株(B.ovis)的感染則具有很強(qiáng)的保護(hù)作用[25]。

表1 布魯氏菌及其自然感染宿主

注：*基因組信息：Gene Bank 參考基因組登錄號。

Note.*Genome, Gene Bank Ref Seq accession number.

布魯氏菌S型菌株感染主要依賴于宿主的細(xì)胞骨架進(jìn)行內(nèi)化[26]。細(xì)菌O-PS與宿主細(xì)胞膜富含膽固醇的脂筏相互作用，促進(jìn)與宿主細(xì)胞的接觸并介導(dǎo)其內(nèi)化入巨噬細(xì)胞[27]。脂筏含有鞘糖脂、膽固醇以及糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，從而促進(jìn)膜相關(guān)事件的發(fā)生，如多亞基膜復(fù)合物的形成、跨膜信號傳導(dǎo)以及膜融合[28]，同時布魯氏菌具有防止補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)菌裂解和宿主細(xì)胞凋亡的能力。巨噬細(xì)胞表面IgG和補(bǔ)體(C3b和4b)受體對布魯氏菌產(chǎn)生調(diào)理作用[29]，從而幫助與脂筏結(jié)合的細(xì)菌轉(zhuǎn)移并靶向進(jìn)入吞噬溶酶體。R型菌株由于缺乏O-PS從而不能維持與脂筏的相互作用，更易被巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體4(TLR4)或甘露糖受體識別而促進(jìn)了R型布魯氏菌的內(nèi)吞[30]。粗糙型菌株表現(xiàn)更高的侵襲性，可能是由于被O-PS保護(hù)的外膜蛋白暴露，從而增加了粘附巨噬細(xì)胞的能力。R型布魯氏菌雖然更有效率地被宿主巨噬細(xì)胞吞噬，并迅速定位到吞噬溶酶體中，通常卻無法復(fù)制，而被細(xì)胞內(nèi)吞后存活的S型菌株則能夠在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制(圖1)。

通過脂筏進(jìn)入宿主巨噬細(xì)胞的S型布魯氏菌快速通過早期內(nèi)體形成名為“布氏小體”的含有布魯氏菌液泡(brucella-containing vacuole, BCV)，繼而通過類似于自噬體生發(fā)的方式獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分形成修飾吞噬體。布魯氏菌最初定位于酸化的吞噬體內(nèi)，酸化環(huán)境定向誘導(dǎo)VirB操縱子(virB1-10)的表達(dá)，調(diào)控Ⅳ型分泌系統(tǒng)(type Ⅳ secretion system, T4SS)相關(guān)基因的表達(dá)[31]。VirB操縱子與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)交互，以中和吞噬體的pH值。布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)存活的另一種機(jī)制涉及修飾吞噬體膜的脂質(zhì)含量，細(xì)菌通過表達(dá)和分泌環(huán)狀葡聚糖合酶(CGS)，可以破壞細(xì)菌周圍細(xì)胞內(nèi)膜內(nèi)的脂筏微結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，脂筏分布的改變抑制吞噬體成熟，防止與溶酶體融合，從而保證了細(xì)菌自身的存活，這種機(jī)制是獨(dú)立于virB操縱子而發(fā)揮作用[32]。

此外氧化殺傷是宿主吞噬細(xì)胞用于控制細(xì)胞內(nèi)病原體復(fù)制的主要機(jī)制，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)布魯氏菌具有多種對抗自由基的機(jī)制。布魯氏菌表達(dá)2種超氧化物歧化酶SODA和SODC來分解自由基的產(chǎn)生，其中SODC發(fā)揮抵抗巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的超氧陰離子的作用[33]。布魯氏菌AHPC(烷基氫過氧化物還原酶C)還原過氧化物發(fā)揮阻止氧化殺傷功能，同時O-PS也具有抵抗宿主細(xì)胞陽離子肽和氧代謝物的作用[34-35]。綜上，布魯氏菌通過精確調(diào)節(jié)不同階段酶及分泌蛋白阻止被外界氧化殺傷從而移行至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及高爾基體進(jìn)行復(fù)制。

3 布病疫苗的研究

動物疫苗接種是控制布病擴(kuò)散與流行的有效措施。減毒活疫苗是目前被廣泛使用的，對布病(流產(chǎn)和/或感染的后代)的流行控制非常有效。20世紀(jì)60年代早期，B.abortusS19、B.melitensisRev1以及滅活的B.abortus45/20疫苗被廣泛使用[36]。美國在1996年批準(zhǔn)使用B.abortusRB51[37]，我國使用的疫苗株為B.suisS2、B.melitensisM5，有效控制了我國布病的蔓延[38]，但減毒活疫苗存在保護(hù)時間短、導(dǎo)致懷孕母畜流產(chǎn)等毒力恢復(fù)的現(xiàn)象，另外目前血清學(xué)檢測手段尚不能區(qū)分疫苗接種與野菌株的感染[39]，這對疫苗的有效接種提出了挑戰(zhàn)。

迄今除我國批準(zhǔn)皮上劃痕人用布魯氏菌104 M活疫苗外[40]，世界范圍內(nèi)無其他可用于人類預(yù)防布病的疫苗株，因此需要更加重視布病新型疫苗的研發(fā)。目前，不斷有新型候選疫苗提出，但其效力與安全性研究大多在小鼠模型進(jìn)行驗(yàn)證，缺乏疫苗對羊、牛、馬、豬大型動物及靈長類感染的保護(hù)驗(yàn)證。此外，體內(nèi)抗原表達(dá)、佐劑和遞送方法的技術(shù)進(jìn)步對于開發(fā)具有同等或更高保護(hù)效力的非活性布病疫苗提供了技術(shù)基礎(chǔ)。最近研究顯示，應(yīng)用流感、沙門菌、志賀菌等作為載體開發(fā)布病亞單位疫苗具有良好的前景(表2)。

4 布病疫苗效力評價的動物模型

布病研究常用的動物模型是近交系小鼠，特別是BALB/c和C57BL，是最常用作研究布病發(fā)病機(jī)理的實(shí)驗(yàn)室模型，其他動物模型包括豚鼠、兔子、大鼠、非人靈長類及反芻動物如牛、羊[41]等。感染途徑以皮下注射為主，其他常見途徑包括腹腔注射、氣溶膠感染和滴鼻感染。感染動物脾腫大指數(shù)及脾內(nèi)細(xì)菌計數(shù)是常用的檢測指標(biāo)。非人靈長類動物如獼猴等被證實(shí)可通過口服、皮下和氣溶膠途徑感染布魯氏菌[42]，感染后病理進(jìn)程如菌血癥可長達(dá)8周，同時伴隨發(fā)展形成局灶性肉芽腫性肝炎，脾炎，淋巴結(jié)炎、睪丸-附睪炎以及子宮內(nèi)膜炎的病變，這些癥狀與人布病發(fā)展進(jìn)程一致[43-44]，但由于實(shí)驗(yàn)成本、倫理學(xué)等因素，限制了該模型的大規(guī)模使用，此外，羊、牛等反芻動物也存在同樣的問題。其他實(shí)驗(yàn)動物如豚鼠，對布魯氏菌感染非常敏感，同樣被廣泛用于布魯氏菌的分離、抗生素治療的有效性評估以及布病疫苗效力的驗(yàn)證[45]。豚鼠感染后，肝、脾、肺和淋巴結(jié)中均可觀察到炎性病變，且豚鼠模型表現(xiàn)出“發(fā)熱”癥狀，這是人布病發(fā)生后的典型癥狀(表3)。因此，基于實(shí)驗(yàn)的可操作性與性價比，開展布病實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)優(yōu)先選擇豚鼠、小鼠模型。

表2 布病疫苗類型

表3 用于布病研究的實(shí)驗(yàn)動物模型

5 主要問題與建議

綜上所述，目前布病研究中存在問題如下：1) “新現(xiàn)”的布魯氏菌生物種提示布魯氏菌是一株古老而又現(xiàn)代的菌株，菌株的進(jìn)化伴隨著畜群的馴化、環(huán)境的變化以及畜牧業(yè)的擴(kuò)展范圍而變化，但各生物種之間的基因組進(jìn)化尚不清楚。2)布魯氏菌宿主分布廣泛，從陸地到海洋，從恒溫動物到變溫動物，同時細(xì)菌也伴隨野生動物的遷徙以及人類的活動而播散于全世界，生物種之間可能存在的基因水平轉(zhuǎn)移，從而對布病的防控帶來新的挑戰(zhàn)。3)實(shí)驗(yàn)室布病研究常用動物模型為小鼠，細(xì)菌感染后其發(fā)病具有自限性，不能有效模擬人類感染的發(fā)病進(jìn)程。雖然豚鼠感染表現(xiàn)優(yōu)于小鼠，但其規(guī)模化飼養(yǎng)及性價比都弱于小鼠模型，從而限制了布病的研究。4)布病疫苗研制難度大，新型疫苗包括亞單位疫苗、DNA疫苗、載體疫苗等的保護(hù)力無法達(dá)到減毒活疫苗水平，功能基因組研究的深入可能對該問題提供一定的幫助。

因此，針對以上問題應(yīng)該重點(diǎn)進(jìn)行如下研究：1)對于布魯氏菌菌株的多樣性加強(qiáng)研究，尋找其與α-變形菌綱內(nèi)其他細(xì)菌如巴爾通體、根瘤菌在進(jìn)化過程中存在的聯(lián)系，深入了解布魯氏菌屬細(xì)菌基因組的進(jìn)化。2)加強(qiáng)對布魯氏菌致病機(jī)制的研究，深入挖掘致病基因的功能及其與宿主之間的相互作用。3)優(yōu)化布病動物模型，從而有效復(fù)制人類感染進(jìn)程。4)進(jìn)行人布病疫苗的開發(fā)以及持續(xù)的動物疫苗和人體疫苗的接種計劃，對于控制布病缺一不可。