人凍融卵巢組織異種異位移植血管生成的研究

龍惠東，周燦權(quán)，鄧偉芬，李宇彬

(1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510080；2.深圳愛維艾夫婦科醫(yī)院，廣東 深圳 518116)

女性生育力保存的途徑包括胚胎冷凍、卵子冷凍及卵巢組織冷凍，前兩者目前已是發(fā)展比較成熟的技術(shù)，卵巢組織冷凍保存與移植技術(shù)尚處于臨床積累經(jīng)驗階段，該技術(shù)能凍存大量的原始卵泡，用于保存女性生殖功能有著不可比擬的優(yōu)勢，目前利用凍融卵巢組織進(jìn)行自體移植技術(shù)出生的嬰兒已超過90名[1-2]。卵巢組織的移植是非血管吻合移植，目前卵巢移植中常出現(xiàn)的問題是在血管建立前，因無法及時對卵巢組織進(jìn)行供血，從而對該組織造成不可逆的損傷，而卵巢移植后組織血供的建立對卵巢功能的恢復(fù)及維持有著至關(guān)重要的作用，因此若能在卵巢移植和凍融過程中避免供血不足對其造成的損傷，這將在卵巢組織移植技術(shù)的發(fā)展中具有極其重大的意義。本研究探討了人凍融卵巢組織異種異位移植血管生成的過程，旨在為凍融卵巢組織移植后功能再建提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料的收集

1.1.1人卵巢組織的收集

經(jīng)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意后，收集2005至2007年在該院行卵巢切除手術(shù)的6例腫瘤患者部分外觀正常的卵巢組織，患者年齡為24～38歲，平均年齡為(31.8±5.7)歲，無化放療史。人卵巢組織經(jīng)慢速程序化凍融后，將其移植在雄性NOD-SCID小鼠背部皮下。

1.1.2實驗動物的收集及處理

購于中山大學(xué)動物實驗中心SPF級飼養(yǎng)的非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠，雄性，年齡為6～8周，重20～25g，實驗前于常規(guī)條件進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。

1.1.3標(biāo)本采集及處理

患者行全身麻醉下開腹手術(shù)，無菌條件下手術(shù)剪活檢取得外觀正常的人卵巢組織，在30min內(nèi)于冰上運送回實驗室處理。在L-15培養(yǎng)液中沖洗2～3次后，置于含L-15培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿，用手術(shù)器械摘除卵巢組織上的卵泡、黃體及髓質(zhì)，然后將卵巢皮質(zhì)切成大小約(5×2×1)mm3的組織塊進(jìn)行慢速程序化冷凍，保存于液氮中。

1.2方法

1.2.1人卵巢組織的冷凍

參照Donnez等[3]的配方自行配制冷凍、解凍液。室溫條件下將人卵巢組織依次在基礎(chǔ)冷凍液和冷凍液Ⅰ中分別平衡5min，然后移至冷凍管(含冷凍液Ⅱ，4℃，30min)，將其裝入程序冷凍儀(英國，Planer KRYO10 Series Ⅱ)，從4℃開始以-2℃/min進(jìn)行降溫，直至溫度降到-7℃，平衡10min后，在冷凍管中植冰，繼續(xù)平衡10min，然后先以-0.3℃/min降溫至-40℃，再以-10℃/min的速度將溫度快速降至-150℃，取出冷凍管迅速置于液氮中保存。

1.2.2人卵巢組織的解凍

將冷凍管從液氮取出后于室溫輕輕晃動1min，放入37℃恒溫水浴箱輕輕振動至完全融解，然后將人卵巢組織片移至解凍液中，依次于室溫條件下置于解凍液Ⅰ、解凍液Ⅱ中分別平衡5min，然后移入解凍液Ⅲ中，放在37℃的6%的CO2培養(yǎng)箱中30min。

1.2.3人卵巢組織的異種異位移植

將小鼠麻醉后背部朝上固定在手術(shù)板上，消毒背部皮膚并鋪上無菌孔巾；用手術(shù)剪剪開背部兩側(cè)皮膚，創(chuàng)口長度約2～3mm，提起皮膚，然后將人卵巢組織片置于背部皮下，縫合后消毒，人卵巢組織移植量為每只小鼠6塊。術(shù)后注射慶大霉素防止感染。

1.2.4移植物的回收

分別于移植后第1、3、7、14、28、56和85天時間點隨機(jī)選擇小鼠，處死后剪開其背部皮膚回收卵巢組織片移植物。

1.3相關(guān)檢測

1.3.1卵巢組織移植物中人血管的切片制作

根據(jù)石蠟切片常規(guī)制作流程包埋移植物并進(jìn)行切片及二甲苯脫蠟和依次經(jīng)高濃度到底濃度乙醇復(fù)水操作后，加入檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(pH=6.0，10min)；然后加3%的H2O2滅活10min；蒸餾水沖洗3次，在PBS中浸泡5min；加入CD34抗體(一抗，鼠抗人，即用型，DAKO；陰性對照中用PBS代替)30～50μL，置于37℃水浴箱中孵育30min，PBS浸泡5min，共3次；加入二抗(DAKO invision試劑盒)；置于37℃水浴箱中孵育30min，PBS浸泡5min，共3次；加DAB顯色，蘇木素染液復(fù)染，無水乙醇沖洗浮色，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.2卵巢組織移植物中小鼠新生血管的切片制作

將卵巢組織移植物用冰凍膠包埋，冰凍切片機(jī)進(jìn)行切片，厚度為6μm，將貼附卵巢組織移植物切片的玻片在丙酮中固定15min，加入CD31抗體(一抗，rat-anti-mouse CD31，1∶20，BD；陰性對照中用PBS代替)30～50μL，置于37℃水浴箱中孵育30min；PBS中浸洗5min，加入二抗(goat-anti-rat IgG:HRP，1∶50，Serotec)30～50μL，置于37℃水浴箱中孵育30min；PBS中浸洗5min，加DAB顯色，蘇木素染液復(fù)染，無水乙醇沖洗浮色，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.3卵巢組織移植物中血管內(nèi)皮生長因子的切片制作

根據(jù)石蠟切片常規(guī)制作流程包埋移植物并進(jìn)行切片及二甲苯脫蠟和依次經(jīng)高濃度到底濃度乙醇復(fù)水操作后，加入檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(pH=6.0，10min)；然后加3%的H2O2滅活10min；蒸餾水沖洗3次，在PBS中浸泡5min；加入血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體(一抗，鼠抗人，即用型，上海長島；陰性對照中用PBS代替)30～50μL，置于37℃水浴箱中孵育30min，PBS浸泡5min，共3次；加入二抗(Supervision HRP試劑盒，上海長島)；置于37℃水浴箱中孵育30min，PBS浸泡5min，共3次；加DAB顯色，蘇木素染液復(fù)染，無水乙醇沖洗浮色，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4免疫組化的相關(guān)計算

微血管密度(MVD)的計算：通過觀察免疫組化檢測中CD34和CD31抗體對血管的標(biāo)記結(jié)果圖對MVD進(jìn)行計算，在100×倍鏡下選取圖像中血管密集的部分，然后轉(zhuǎn)換為400×倍鏡，觀察間質(zhì)中染成棕褐色的單個細(xì)胞或一圈內(nèi)皮細(xì)胞，計數(shù)MVD值。每切片在邊緣和中央部分各選取5個密度較高的視野進(jìn)行計數(shù)。

VEGF的陽性染色評分計算：參考Kutlu等[4]的計算方法，用Histochemical Score(HS)作半定量評價，計算公式為HS=[陽性面積%×(i+1)]/100，其中i為VEGF表達(dá)強(qiáng)度的分級，強(qiáng)陽性記為3、中等陽性記為2、弱陽性記為1。每個切片隨機(jī)選取3個視野進(jìn)行評分。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1卵巢組織移植物中人血管的檢測情況

移植前，人卵巢組織中微血管分布較為密集，主要分布位置在間質(zhì)和卵泡周圍；而移植后第3天，卵巢組織移植物中人微血管密集程度顯著下降，移植后第85天卵巢組織移植物中人微血管僅剩小部分殘留，見圖1～圖3。免疫組化圖中MVD計算結(jié)果表明：各移植時間點的抗人CD34標(biāo)記的MVD比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.871，P=0.024)，說明隨著移植時間的延長，卵巢組織移植物中人MVD顯著降低，見表1。

圖1 移植前人卵巢組織的血管豐富,棕褐色為抗人CD34抗體陽性部位(×400)圖2 移植后第3天人卵巢組織中MVD,棕褐色為抗人CD34抗體陽性部位(×400)圖3 移植后第85天人卵巢組織中MVD,棕褐色為抗人CD34抗體陽性部位(×400)Fig.1-3 Detection of human blood vessel in human ovarian tissues before and after heterotopic transplantation in NOD-SICD mice: brown color shows positive site of anti-human CD-34 antibody

Table 1 Comparison of changes in human MVD in the grafts

移植時間MVD移植前137.20±38.60第1天142.80±22.00第3天91.00±30.00第7天58.70±15.80第14天76.50±18.50第28天68.00±14.80第56天71.50±27.60第85天55.50±13.80*F2.871P0.024

注：*移植第85天與第7天比較，F(xiàn)=5.582，P=0.020；n=56代表檢測移植物的數(shù)量。

2.2卵巢組織移植物中小鼠新生血管的檢測情況

解凍的人卵巢組織移植后，卵巢組織移植物的新生血管早期主要分布在外周，即與小鼠組織相接部分，移植中后期在移植物內(nèi)部也可觀察到血管的生成，見圖4～圖7。免疫組化圖中MVD計算結(jié)果表明：各移植時間點的抗小鼠CD31標(biāo)記的MVD比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=155.710，P<0.001)，說明隨著移植時間的延長，卵巢組織移植物中小鼠MVD顯著增加，且從第3天開始增加顯著(F=75.543，P<0.001)，見表2。

表2 小鼠MVD隨移植時間變化的比較結(jié)果Table 2 Comparison of changes in murine MVD with transplantation times

注：*移植第3天與第1天比較，F(xiàn)=75.543，P<0.001；n=40代表檢測移植物的數(shù)量。

圖4 移植后第1天卵巢組織中小鼠血管生成,棕褐色為抗鼠CD31抗體陽性部位 (×400);圖5 移植后第3天卵巢組織中血管生成,棕褐色為抗鼠CD31抗體陽性部位(×400)圖6 移植后第7天人卵巢組織中血管生成,棕褐色為抗鼠CD31抗體陽性部位(×400)圖7 移植后第14天人卵巢組織中血管生成,棕褐色為抗鼠CD31抗體陽性部位,可見有肌層的大血管生成(×400)Fig.4-7 Revascularization in frozen-thawed human ovarian tissues after heterotopic transplantation intoNOD-SICD mice: brown color indicates the positive site of anti-mouse CD-31 antibody

2.3卵巢組織移植物中血管內(nèi)皮生長因子的檢測情況

人卵巢組織移植物中VEGF的表達(dá)主要集中分布在外周，即與小鼠組織相接部分，主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞及其周圍的間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，見圖8～圖10。VEGF表達(dá)的HS值計算結(jié)果表明：移植后人卵巢組織中VEGF表達(dá)變化趨勢為先上升后下降，其中在移植后第3天VEGF的表達(dá)顯著上升(F=11.072，P=0.001)，第14天后開始明顯下降(F=18.564，P=0.001)，各時間點VEGF的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=45.981，P<0.05)，見表3。

圖8 移植前卵巢組織中VEGF的表達(dá)較少,棕褐色為VEGF抗體陽性部位(×200)圖9 移植后第1天卵巢組織中VEGF的表達(dá),棕褐色為VEGF抗體陽性部位(×200)圖10 移植后第3天卵巢組織中VEGF表達(dá),棕褐色為VEGF抗體陽性部位(×200)Fig.8-10 VEGF expression in human ovarian tissue before and after heterotopic transplantation in NOD-SICD mice:brown color indicates the positive site of VEGF antibody

表3 VEGF隨移植時間變化的比較結(jié)果Table 3 Comparison of changes in VEGF expression with transplantation times

注：*移植第3天與第1天比較，F(xiàn)=11.072，P=0.001；**移植第14天與第3天比較，F(xiàn)=18.564，P=0.001；n=56代表檢測移植物的數(shù)量。

3討論

3.1卵巢組織異位移植的血管重建

在卵巢移植技術(shù)中，移植成功的關(guān)鍵因素在于卵巢微血管的重建。血管重建是一個較為復(fù)雜的過程，其中需多種生長因子的參與。本研究使用血管內(nèi)皮特異性標(biāo)記抗體CD34和CD31對其進(jìn)行標(biāo)記，以卵巢組織移植后通過兩種抗體在不同時間點的表達(dá)情況對人卵巢微血管和小鼠新生血管的變化情況進(jìn)行觀察和計算。MVD通常是反映血管新生標(biāo)志的指標(biāo)，其應(yīng)用較為廣泛。本研究中以其作為評價血管重建和退化的標(biāo)志。目前對卵巢組織異位移植后血管生成的研究中，通常認(rèn)為移植后48～72h內(nèi)出現(xiàn)新生血管重建現(xiàn)象，但出現(xiàn)該現(xiàn)象的具體時間點因所用動物種屬及檢測方法不同而異。國外文獻(xiàn)報道，大鼠卵巢組織頸部皮下自體移植相關(guān)研究結(jié)果表明，大鼠卵巢組織移植后48h內(nèi)，移植物中VEGF表達(dá)量顯著增加，并觀察到血管重建現(xiàn)象；小鼠卵巢組織自體移植結(jié)果表明移植后3天觀察到有新血管生成；而將大鼠卵巢組織移植到裸鼠的肌肉部位，移植后7天才發(fā)生血管重建現(xiàn)象[5-7]。以上結(jié)果說明：自體移植發(fā)生血管重建所需時長小于異體移植。對于人卵巢組織異體移植血管的相關(guān)研究結(jié)果表明：人卵巢組織異體移植通常在第2～3天開始有小鼠血管重建和侵入現(xiàn)象發(fā)生[8-11]。本研究結(jié)果中，各時間點卵巢組織移植物中小鼠血管MVD值和VEGF表達(dá)量比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，且從第3天開始增加量顯著(均P<0.05)，與上述相關(guān)研究結(jié)果較為接近。

血管重建通常是從周邊部分向內(nèi)部延伸。因此卵巢移植物中間位置較邊緣部位供血滯后，易發(fā)生缺血缺氧損傷。本研究顯示，在移植后第3天小鼠血管開始新生和重建，說明其是移植后血供逐步建立時間點，通常認(rèn)為這種現(xiàn)象的出現(xiàn)說明該時間是發(fā)生缺血再灌注損傷的關(guān)鍵時期[8-9]；本研究顯示，在移植后第14天觀察到肌層大血管形成，說明移植后該時間點移植物內(nèi)的血供體系已基本建立，并達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。在血管新生過程中伴隨著卵巢組織內(nèi)人源性血管的逐漸減少，并沒有迅速消失，提示在移植早期人源性血管還是可能會對移植物產(chǎn)生一定的影響[10-11]，但移植物的后期存活仍有賴于新生血供的快速建立。有學(xué)者認(rèn)為在胰島組織移植的動物模型中，移植物內(nèi)小鼠新生血管可能會遷移到退化的人血管在間質(zhì)中的位置[12]，提示不同來源血管的相互取代作用。

3.2血管內(nèi)皮生長因子在新生血管重建中的表達(dá)

血管的新生涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移和血管的重構(gòu)，以上過程均受到血管生成因子的調(diào)節(jié)。VEGF是血管生成強(qiáng)有力的促進(jìn)劑，由血管平滑肌細(xì)胞等產(chǎn)生，通過旁分泌機(jī)制特異性作用于存在VEGF受體的血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖和趨化作用，進(jìn)而誘導(dǎo)血管生成[13-14]。VEGF促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖主要由內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGF受體介導(dǎo)，VEGF受體與VEGF結(jié)合后引起自身及相關(guān)蛋白磷酸化，介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞和細(xì)胞內(nèi)信號傳遞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖[15]。本研究結(jié)果表明，卵巢組織移植后處于缺血缺氧狀態(tài)，該狀態(tài)可誘導(dǎo)血管組織中VEGF表達(dá)量的顯著增加，而在移植后第1～3天組織處于缺血缺氧和血管重建狀態(tài)，因此VEGF的表達(dá)較剛移植時顯著增加，其原因可能在于促進(jìn)血管的新生。移植14天后VEGF的表達(dá)量開始下降，表明卵巢組織移植物的缺血缺氧狀態(tài)得到了改善。以上說明VEGF在移植早期表達(dá)增加以促進(jìn)血管生成，在移植后期較多血管建立后，VEGF表達(dá)逐漸減低。

3.3結(jié)論

本實驗是利用種屬特異性血管標(biāo)志物對人凍融卵巢組織異位移植血管生成時程進(jìn)行研究，首次報道了移植后24h觀察到小鼠新生血管的生成，有利于更好地針對卵巢移植缺血期進(jìn)行保護(hù)治療。