同時(shí)脫除吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒農(nóng)殘的虛擬模板表面分子印跡的制備和應(yīng)用

陳靜鈺，黃鑫，王力，王洪新*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(國(guó)家功能食品工程技術(shù)研究中心(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)

茶多酚是茶葉中多羥基酚類(lèi)化合物的統(tǒng)稱(chēng)，作為茶葉中具有保健功能的主要化學(xué)成分[1-2]，是茶葉深加工的主要產(chǎn)物[3]。隨著歐盟、美國(guó)和日本等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)食品及農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)口的農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)的要求日趨嚴(yán)格[4]，茶多酚中的農(nóng)藥殘留也成為了茶葉深加工過(guò)程中面臨的主要問(wèn)題之一，不僅會(huì)影響茶多酚產(chǎn)品的質(zhì)量、損害消費(fèi)者健康[5]，而且會(huì)損害廠(chǎng)家的品牌聲譽(yù)，影響我國(guó)茶葉深加工產(chǎn)品的出口。

吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒是茶葉種植過(guò)程中常用的高效氯煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑[6]，在水和有機(jī)溶劑中具有良好的溶解性，因此在茶多酚產(chǎn)品中容易殘留。目前，農(nóng)藥殘留的去除方法主要有物理法、化學(xué)法[7-8]和生物法[9]。其中，化學(xué)法和生物法由于安全性的問(wèn)題[10-11]，并不適用于茶多酚中農(nóng)藥的去除。在物理方法中，NEZAMADDIN等[12]研究了顆粒狀活性炭對(duì)吡蟲(chóng)啉的吸附性能，發(fā)現(xiàn)吸附行為符合Freundlich等溫吸附模型。ZHAO等[13]將花生殼生物炭用于吸附吡蟲(chóng)啉，吸附量達(dá)到6 mg/g，且等溫吸附數(shù)據(jù)與Langmuir和Freundlich模型高度相關(guān)。然而，他們?nèi)コr(nóng)殘的作用并不是特異性的。為了達(dá)到最大限度地脫除農(nóng)殘并最大限度的保留產(chǎn)品的活性成分，探索一種對(duì)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒具有高選擇性的材料十分必要。

分子印跡技術(shù)(molecularly imprinted technique, MIT)是一種結(jié)合高分子化學(xué)、生物化學(xué)等學(xué)科發(fā)展起來(lái)的，具備特異性識(shí)別功能的新興技術(shù)[14-15]。通過(guò)MIT人工合成的具有高穩(wěn)定性、高選擇性等特點(diǎn)的功能性識(shí)別材料被稱(chēng)為分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer, MIP)。迄今為止，MIP已在許多研究中被用于去除有害物質(zhì)。例如，SNCHEZ-POLO[16]成功地合成了能夠從水中脫除四環(huán)素的MIP。同樣地，一種用于吸附釷(Th，IV)的分子印跡固相萃取材料也被研究出來(lái)[17]。在吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的分子印跡研究方面，F(xiàn)AROOQ等[18]合成了用于檢測(cè)蘋(píng)果汁中吡蟲(chóng)啉的磁性表面分子印跡材料，材料對(duì)樣品的回收率為77.66%～96.57%，顯示了良好的分析性能。KUMAR等[19]將合成的磁性分子印跡材料應(yīng)用于分離蜂蜜和蔬菜樣品中的吡蟲(chóng)啉，在茄子和蜂蜜樣品中對(duì)吡蟲(chóng)啉的回收率達(dá)到(87.1±5.0)%和(90.6±5.6)%。對(duì)于啶蟲(chóng)脒的分子印跡材料則多見(jiàn)應(yīng)用于電化學(xué)傳感器[20]。然而，這些研究都以檢測(cè)為目的進(jìn)行材料的制備和性能研究；其次，目前還沒(méi)有應(yīng)用MIP同時(shí)吸附吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的研究。虛擬模板分子印跡是一種能夠有效避免模板泄漏的技術(shù)[21-22]，在實(shí)際樣品應(yīng)用中，模板泄漏會(huì)在分離過(guò)程中造成嚴(yán)重的污染。煙酰胺是吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，具有抗炎作用，常作為食品添加劑、化妝品以及藥物使用，被廣泛認(rèn)為安全性較高[23]。選擇煙酰胺作為虛擬模板，不僅可以同時(shí)對(duì)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒進(jìn)行脫除，還能避免模板泄漏造成的農(nóng)藥污染，提高材料的安全性。本研究以低毒的煙酰胺作為虛擬模板分子，采用分子印跡技術(shù)制備了基于硅膠的虛擬模板表面分子印跡聚合物(dummy template surface molecularly imprinted polymers, DMIP)，并對(duì)材料進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)吸附實(shí)驗(yàn)考察了其吸附能力，最終成功地應(yīng)用于去除茶多酚溶液中的吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒，為茶提取物中農(nóng)藥殘留的脫除提供了一種新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒、煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，阿拉丁試劑公司；茶多酚，遵義陸圣康源科技有限公司；乙腈(色譜純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)，上海泰坦科技股份有限公司；甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈(分析純)，阿拉丁試劑公司；冰醋酸、甲苯、無(wú)水Na2SO4、福林酚、Na2CO3、沒(méi)食子酸(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Su1510型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；UV-2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀、Waters Quattro Premier XE質(zhì)譜儀，美國(guó)沃特世公司；YQ型超聲波清洗機(jī)，上海易凈超聲波儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯攪拌水浴鍋，常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 改性硅膠的合成

改性硅膠的合成根據(jù)已有的文獻(xiàn)[24]進(jìn)行了一定的改進(jìn)。將4 g硅膠浸入100 mL的10 mol/L HCl溶液中攪拌24 h，過(guò)濾后用去離子水洗滌至中性并干燥。將干燥后的硅膠與50 mL甲苯混合，逐滴滴加6 mL APTS和適量吡啶，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌20 min。將反應(yīng)體系控制在373 K，回流24 h，然后用甲苯、丙酮、乙醚、甲醇對(duì)所得混合物進(jìn)行洗滌，最后在真空烘箱中干燥8 h，制備得到氨基改性硅膠。

將4 g氨基改性硅膠與50 mL甲苯混合，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入8 mL丙烯酰氯，磁力攪拌10 min后逐滴滴加適量的三乙胺，然后在室溫下攪拌24 h。所得化合物經(jīng)甲苯、丙酮、乙醚和甲醇過(guò)濾洗滌后，在真空烘箱中干燥8 h，制備得到酰基改性硅膠。

1.3.2 分子印跡的合成

稱(chēng)取123.4 mg(約1 mmoL)煙酰胺置于250 mL圓底燒瓶中，以 80 mL不同比例甲醇-水混合溶解。然后加入適量?；男怨枘z與0.34 mL MAA(4 mmol)并超聲30 min，待充分溶解分散后避光放置4 h，使模板分子與功能單體充分作用。將適量EGDMA和AIBN(40 mg)加入到該混合物中，通高純氮?dú)?0 min，使得瓶?jī)?nèi)保持惰性氛圍，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將燒瓶密封，在333 K水浴下熱引發(fā)聚合24 h。以V(甲醇)∶V(乙酸)=9∶1為溶劑，通過(guò)索氏提取法除去模板。所得材料以甲醇洗滌至中性，在323 K下真空干燥6 h，制備得到DMIP。作為對(duì)照，在相同條件下不添加模板分子制備了非印跡聚合物(DNIP)。

1.3.3 虛擬模板表面分子印跡制備條件的優(yōu)化

1.3.3.1 單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

考察交聯(lián)劑和功能單體用量的摩爾比、?；枘z的用量以及溶劑的配比3個(gè)因素對(duì)DMIP印跡效果的影響，得到單因素的最佳制備條件。

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg制備得到的DMIP和DNIP并分別置于25 mL錐形瓶中，然后分別加入8 mL質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的吡蟲(chóng)啉和0.2 mg/mL啶蟲(chóng)脒混合水溶液。在室溫下?lián)u晃20 h后，離心取上清液，并用去離子水稀釋至4 mL。采用HPLC-MS-MS法測(cè)定上清液中的吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的濃度，計(jì)算吸附容量Q(mg/g)和特異因子α，計(jì)算方法如公式(1)和公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：ρ0，初始質(zhì)量濃度，g/mL；ρt，平衡質(zhì)量濃度，g/mL；V，溶液體積，mL；m，材料質(zhì)量，mg。Qm，DMIP的吸附容量，mg/g；Qn，DNIP的吸附容量，mg/g。

最終的QDMIP為 DMIP對(duì)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒吸附容量的平均值。

1.3.3.2 分子印跡聚合物制備條件響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以交聯(lián)劑和功能單體用量的摩爾比(A)、?；枘z的用量(B)、溶劑的配比(C)為實(shí)驗(yàn)因素，以虛擬模板表面分子印跡的吸附容量QDMIP(mg/g)和特異因子α為響應(yīng)值，利用軟件Design-Expert對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.4 分子印跡的掃描電鏡表征

稱(chēng)取DMIP和DNIP粉末適量，粘于導(dǎo)電膠上并鍍金，用掃描電鏡觀察樣品形態(tài)。

1.3.5 分子印跡的吸附性能研究

準(zhǔn)確稱(chēng)取200 mg的DMIP和DNIP分別置于250 mL錐形瓶中，然后分別加入50 mL的0.2 mg/mL吡蟲(chóng)啉和0.2 mg/mL啶蟲(chóng)脒混合水溶液。在室溫下?lián)u動(dòng)5、30、90、150、210、270、330和390 min后，取0.15 mL混合溶液離心并取上清液，用去離子水稀釋至4 mL。采用HPLC-MS-MS法測(cè)定上清液中吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的濃度，計(jì)算吸附容量。

1.3.6 分子印跡應(yīng)用于脫除茶多酚中的吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒

將100 mg DMIP通過(guò)濕法裝柱填充到固相萃取柱中，加入10 mL甲醇進(jìn)行活化備用。將50 mL的20 mg/mL茶多酚溶液中添加10 μg/mL吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒，作為上樣液進(jìn)行固相萃取，樣液的流速控制在1.25 mL/min。之后，用10 mL去離子水洗去弱保留化合物，合并洗脫液，用HPLC-MS-MS測(cè)定洗脫液中茶多酚、吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 虛擬模板表面分子印跡制備條件的優(yōu)化

2.1.1 交聯(lián)劑和功能單體用量的摩爾比對(duì)分子印跡材料印跡效果的影響

交聯(lián)劑和功能單體用量的摩爾比能夠影響分子特異性吸附位點(diǎn)的數(shù)量，從而影響其吸附效果。將QDMIP和α作為指標(biāo)，對(duì)交聯(lián)劑和功能單體用量的摩爾比對(duì)分子印跡效果的影響進(jìn)行考察，結(jié)果如表1所示。

表1 交聯(lián)劑和功能單體用量的摩爾比對(duì)分子印跡效果的影響

由結(jié)果可知，若要QDMIP和α達(dá)到最優(yōu)的條件，交聯(lián)劑與功能單體用量的摩爾比為7∶1。這可能是因?yàn)樵诮宦?lián)劑的添加量較少時(shí)，分子印跡聚合物的交聯(lián)度較低，以至于不能夠充分固定功能單體和模板分子，難以形成足夠的排列有序的空間位點(diǎn)；而當(dāng)交聯(lián)劑的添加量太多時(shí)，分子印跡聚合物的交聯(lián)度較高，單位質(zhì)量的聚合物中產(chǎn)生的特異性識(shí)別孔穴較少，因此也會(huì)對(duì)材料的印跡效果造成影響。

2.1.2 ?；枘z的用量對(duì)分子印跡材料印跡效果的影響

改性硅膠的用量會(huì)對(duì)分子印跡聚合物的吸附效果產(chǎn)生很大的影響。若改性硅膠的用量過(guò)少，則會(huì)導(dǎo)致有一部分的模板分子和功能單體不能在改性硅膠的表面聚合，從而使得印跡層的厚度較大，影響特異性吸附效果；當(dāng)改性硅膠的用量過(guò)多時(shí)，不僅會(huì)導(dǎo)致硅膠顆粒發(fā)生團(tuán)聚，而且會(huì)使得硅膠表面的印跡層過(guò)薄，從而使得單位質(zhì)量聚合物中的有效印跡位點(diǎn)減少。將QDMIP和α作為指標(biāo)，對(duì)?；枘z的用量對(duì)分子印跡效果的影響進(jìn)行考察，結(jié)果如表2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酰基改性硅膠的最佳用量是0.9 g，此時(shí)QDMIP和α達(dá)到最優(yōu)。

表2 ?；枘z的用量對(duì)分子印跡效果的影響

2.1.3 溶劑的配比對(duì)分子印跡材料印跡效果的影響

含水體系的極性溶劑可以有效地增加分子印跡聚合物在水相中的識(shí)別性能。將QDMIP和α作為指標(biāo)，對(duì)溶劑中甲醇和水的配比對(duì)分子印跡效果的影響進(jìn)行考察，結(jié)果如表3所示。

表3 溶劑的配比對(duì)分子印跡效果的影響

結(jié)果顯示，當(dāng)溶劑中甲醇與水的配比為90∶10時(shí)，QDMIP和α達(dá)到最優(yōu)。這可能是因?yàn)樘砑舆m量的水可以增加MAA與模板分子靜電和疏水作用，從而增強(qiáng)其在水相中的特異性識(shí)別能力；然而當(dāng)溶劑中水的含量過(guò)多時(shí)，則會(huì)嚴(yán)重干擾模板分子和功能單體之間氫鍵的形成。

2.1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

虛擬模板表面分子印跡制備優(yōu)化的響應(yīng)面分析結(jié)果見(jiàn)表4。采用Design-Expert對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，方差分析的結(jié)果見(jiàn)表5及表6。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

結(jié)合2個(gè)回歸模型方程，采用Design-Expert 8.0繪制了響應(yīng)面分析圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，交聯(lián)劑與功能單體用量比和?；枘z用量、改性硅膠用量和溶劑配比3個(gè)因素互相的交互作用都會(huì)對(duì)DMIP的吸附容量QDMIP以及選擇因子α產(chǎn)生明顯的影響。結(jié)合2個(gè)模型，通過(guò)軟件分析，最終得到DMIP的最佳制備條件為：交聯(lián)劑和功能單體用量的摩爾7.05∶1，改性硅膠用量0.919 mg, 溶劑中甲醇/水的體積比為90.13∶9.87。

表5 回歸模型各項(xiàng)方差分析(QDMIP為響應(yīng)值)

表6 回歸模型各項(xiàng)方差分析(α為響應(yīng)值)

2.2 分子印跡的掃描電鏡表征

圖2為DMIP和DNIP的掃描電鏡圖像。將圖2-a、圖2-b與圖2-c、圖2-d相比，可以明顯看出DMIP呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)狀的分支結(jié)構(gòu)，與DNIP相比更加的疏松多孔，且有明顯的結(jié)塊現(xiàn)象。這是由于DMIP在制備的過(guò)程中加入了煙酰胺作為虛擬模板分子，模板分子被洗脫之后留下了與對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的空間結(jié)構(gòu)，這些空間結(jié)構(gòu)使得DMIP看起來(lái)更加粗糙蓬松。在DNIP表面鑲嵌有硅膠顆粒，這也說(shuō)明材料的聚合過(guò)程是在硅膠的表面進(jìn)行的。

2.3 分子印跡的吸附性能研究

如圖3所示，DMIP和DNIP對(duì)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的吸附量皆隨著吸附時(shí)間的增加而增加。在前90 min，DMIP和DNIP對(duì)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的吸附速率較快，在210 min之后基本達(dá)到吸附平衡，說(shuō)明該表面印跡材料對(duì)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒具有較大的吸附動(dòng)力學(xué)。這是由于所制備的表面分子印跡的吸附位點(diǎn)基本位于材料表面，在吸附過(guò)程中能夠更加快速高效地和底物接觸。與此同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，雖然具有相似的吸附趨勢(shì)，但是DMIP吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的吸附量比DNIP大得多，這是由于虛擬模板分子在DMIP表面上產(chǎn)生了特異性吸附位點(diǎn)，使得吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒更容易進(jìn)入。

圖1 各因素的交互作用對(duì)QDMIP和α的響應(yīng)面分析圖

放大倍數(shù)(a，c)15 000，(b，d)5 000

a-吡蟲(chóng)啉;b-啶蟲(chóng)脒

2.4 分子印跡脫除茶多酚中的吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒

將所制備的DMIP材料用于從茶多酚中去除吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒。將50 mL上樣溶液經(jīng)過(guò)DMIP柱，再用10 mL去離子水過(guò)柱，合并流出液。采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-MS-MS)和紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-visible)分別測(cè)定了2種農(nóng)藥和茶多酚的含量。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)DMIP柱后，上樣液中吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的濃度均顯著下降。通過(guò)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)測(cè)定可知，該柱對(duì)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的去除率分別為96.2%和95.6%，而對(duì)茶多酚的吸附率僅為3.7%，遠(yuǎn)低于2種農(nóng)藥的吸附率。結(jié)果表明，DMIP材料對(duì)茶多酚溶液中的吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒具有選擇性吸附能力，有望應(yīng)用于在茶多酚生產(chǎn)工藝中去除殘留的吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以硅膠為基底、煙酰胺為虛擬模板分子，采用表面印跡法制備了能夠特異性吸附吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的表面分子印跡聚合物。選用無(wú)毒的煙酰胺作為虛擬模板，不僅避免模板滲漏和污染，而且可以為吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒提供吸附位點(diǎn)。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，采用響應(yīng)面分析法對(duì)DMIP的制備條件進(jìn)行優(yōu)化，得到DMIP的最佳制備條件為：交聯(lián)劑和功能單體用量的摩爾比為7.05∶1，改性硅膠用量0.919 mg, 溶劑中甲醇/水的體積比90.13∶9.87，并且對(duì)優(yōu)化后DMIP的吸附性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，優(yōu)化后的DMIP對(duì)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒具有良好的吸附性能和選擇性，對(duì)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的最大吸附量分別為41.73和21.95 mg/g，與其他種類(lèi)的分子印跡材料相比具有一定的優(yōu)勢(shì)[18-19]，適合作為吸附材料使用。此外，該聚合物還成功地作為柱填料同時(shí)去除茶多酚中的吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒，對(duì)吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的脫除率分別達(dá)到96.2%和95.6%，對(duì)茶多酚的吸附率僅為3.7%。因此，該材料有望用于茶提取物中吡蟲(chóng)啉和啶蟲(chóng)脒的脫除中，可以進(jìn)一步研究DMIP的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及重復(fù)利用性，以期更好地用于工業(yè)化生產(chǎn)。