排酸護腎湯防治尿酸性腎病MAPK通路與尿酸相關靶點的研究

易純 吳雨潔 謝城鋒 吳林燕 徐笑容 鐘穎 逯晶

慢性尿酸性腎病主要由于機體內嘌呤代謝紊亂且血尿酸水平升高引起的炎癥反應導致。目前西醫(yī)治療從減少尿酸生成和增加尿酸排泄兩方面入手，確實在降低血尿酸水平方面起了重要作用，但在治療的同時所產生的副作用又在一定程度上加重了患者腎功能損害程度[1]。而在中醫(yī)，根據其病因病機及臨床癥狀，高尿酸腎病應歸屬于中醫(yī)“痹證、歷節(jié)、淋證、腰痛、虛勞”等范疇。其病因復雜，其病機特點是本虛標實、虛實夾雜，脾腎虧虛為本，濕熱瘀血內阻為標。因此，清熱祛濕，化瘀泄?jié)峤舛臼侵委煾吣蛩崮I病的重要治療方法，可助腎臟排出代謝產物，對腎功能的改善及延緩腎臟疾病的進展具有良好的療效。劉勁松[2]等總結的排酸護腎湯，已證實對尿酸性腎病的恢復治療有非常顯著的臨床療效。本研究擬從蛋白分子層面揭示排酸護腎湯的對尿酸性腎病的防治機制，探討其藥物對于尿酸轉運及排泄影響的特性，探索其延緩腎臟纖維化的機理，為尿酸性腎病中西醫(yī)結合的臨床治療策略制定提供有力的科學依據。

1 材料

1.1 動物

80只8周齡SPF等級SD健康雄性大鼠，體質量（250±20）g，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0002。保持大鼠飼養(yǎng)環(huán)境通風、恒溫、安靜，定期更換墊料，消毒籠具。對其進行12h燈光照射管制。每只大鼠均給予嚴格的卡片登記管理。

1.2 藥物及試劑

1.2.1 主要藥物 排酸護腎湯主要由海金砂15 g，金錢草15 g，土茯苓15 g，豬苓15 g，川芎15 g，丹參15 g，熟地15 g，女貞子15 g組成。煎藥方法：水煎。煎藥前需浸泡藥材，水量約為藥材的5倍。頭煎時，武火煮沸后文火慢煮30分鐘，將藥汁倒出后原藥渣，加適量溫水以上法進行二煎。將兩煎液混合均勻，用4層紗布過濾3遍，將濾液置于水浴恒溫器上濃縮至濃度相當于含生藥1 g/mL。

1.2.2 主要試劑 尿酸（UA）含量檢測試劑盒，大鼠尿酸鹽轉運蛋白1（URAT1）聯免疫分析試劑盒，Real-time PCR試劑盒（全式金，貨號AQ131-01），兔抗山羊-HRP（中山金橋，貨號ZB-2306），肌酐（CRE）、尿素氮（BUN）測定試劑盒（南京建成，貨號C011-2、C013-2），黃嘌呤氧化酶（XOD）活性檢測試劑盒（Solarbio，貨號BC1090）。

2 方法

2.1 分組和給藥

取雄性SD大鼠80只，進行完全隨機分組，并命名為正常組、模型組、排酸護腎湯組、別嘌呤醇組和聯合用藥組共五組。建造大鼠動物模型，6天后，即第7天，通過灌胃的方式對每組大鼠進行給藥（每天3：00 pm），別嘌呤醇組大鼠別嘌醇50mg/（kg d）灌胃，排酸護腎組120 g（0.018 5/kg）別嘌呤灌胃，正常組使用等體積的蒸餾水，模型組與正常組處理相同，聯合用藥組均給予，總給藥時長為14天，但給藥6天后，停止腺嘌呤損害因素。

2.2 尿酸性腎病大鼠模型的制備

正常對照組：普通飼料飼養(yǎng)；模型組：高酵母顆粒性飼料飼養(yǎng)（酵母的每日攝入量10 g/kg），并腺嘌呤100 mg/（kg·d）灌胃。別嘌醇治療組，聯合用藥治療組同模型組一致，灌胃及腹腔注射量均為0.5 mL/100g。各組大鼠自由飲水，稱重一周兩次。適用性飼養(yǎng)3天后開始造模，每日9：00 am正常組生理鹽水灌胃10 mg/（kg·d），持續(xù)14天。

2.3 一般情況、體重

對大鼠的攝食、排泄、活動、皮毛變化、刺激反射等一般情況進行觀察記錄；并于造模前，及造模后7、14、21天稱重。

2.4 UA、Cr、BUN和XOD表達水平

在生理鹽水（冷）中漂洗組織塊（0.2～1.0 g），量取生理鹽水或勻漿介質（冷），容量約組織塊重量9倍。再次量取，所取量占其總量的2/3，后剪碎組織塊，進行超聲粉碎，頻率為400 A，5 s/次，一定時間間隔（10 s）內反復3～5次。使用普通離心機或低溫低速離心機按照2 000 r/min的轉速離心制備好的10%勻漿，定時10～15 min。檢測上清液UA、Cr、BUN、XOD的表達水平。

2.5 qRT-PCR法測定URAT1基因的表達水平 稱取50 mg腎組織加入1 mL Trizol，震蕩后置于冰上孵育30 min。加入200μL三氯甲烷搖勻至乳化，12 000g離心15 min 后取上清液，加入等體積異丙醇，置于溫度約25℃環(huán)境下10 min。將所得混合液在4℃下離心10 min，棄其上清液后加入1 mL70%濃度乙醇溶液，后于4℃下離心5 min。棄去乙醇并在25℃環(huán)境下將沉淀產物干燥2～5 min，后加入RNA溶解液適量（如20 μL）使其溶解，攪拌使其溶解完全，加入反轉錄引物，經過簡單的離心、充分振蕩混勻后放入水浴鍋中，溫度設置為70℃，預變性時間為5 min，然后置于冰上2min。最后的PCR擴增階段需設置反轉錄程序，引物信息見表1。

表1 引物信息

表 2 排酸護腎湯對UA， Cr， BUN，XOD的濃度的影響 （

表 2 排酸護腎湯對UA， Cr， BUN，XOD的濃度的影響 （

images/BZ_144_213_650_2299_698.png正常組 44.96±14.21 139.11±15.12 7.15±0.32 1.28±0.15模型組 79.23±7.87 529.20±19.27 15.68±0.33 16.95±0.95排酸護腎組 57.36±7.11 423.39±14.46 11.52±0.14 11.72±0.28別嘌醇組 57.29±10.81 393.32±7.24 10.94±0.21 10.88±0.65聯合用藥組 31.01±2.68 277.84±9.43 8.83±0.24 5.60±0.23

2.6 腎臟p-p38MAPK的蛋白質表達水平

制備腎臟組織勻漿，檢測蛋白含量。電泳后電轉至PVDF膜上，加入相應一抗密閉孵育4 h，洗滌緩沖液（TBST）洗膜，加入二抗孵育2 h后TBST洗膜，曝光、定影。蛋白質相對表達量用QuantityOne 1.1.1軟件進行光密度分析。

3 統計學分析

采用SPSS 21.0統計軟件。對計量資料進行組件比較，若數據服從正態(tài)分布且各組間方差齊時，則采用LSD法，若數據服從正態(tài)分布但各組間方差不齊時，則采用Games-Howell法；若數據不服從正態(tài)分布，則采用Kruskal-Walls法。若P＜0.05，則差異有統計學意義。

3 結果

3.1 一般狀況觀察

隨著造模藥物排酸護腎湯的使用，各組大鼠發(fā)生不同程度體質量增長減緩，精神萎靡不振，飲水量減少，拱背畏寒，毛發(fā)干枯、發(fā)黃、暗淡無光澤，以及出現逆毛現象。隨著治療藥物的應用，排酸護腎組、別嘌呤醇組和聯合用藥組的大鼠體質量增長，飲水量減少、精神萎靡不振、拱背畏寒、逆毛現象有所好轉，動作靈敏，其中以聯合用藥組效果最好（見圖1）。

3.2 排酸護腎湯對UA、Cr、BUN以及XOD的濃度的影響

造模第21天取出大鼠的雙側腎組織，將其制作成腎勻漿，并取上清液測量尿酸濃度。模型組大鼠的尿酸濃度明顯高于正常組（t=4.482，P=0.001）；排酸護腎組、別嘌呤醇組和聯合用藥組的尿酸濃度均低于模型組 （t排-模=-2.860，P排-模=0.017；t別-模=-2.870，P別-模=0.017；t聯-模=-6.307，P聯-模=0.000），且聯合用藥組效果優(yōu)于排酸護腎組和別嘌呤醇組，（t聯-排=-3.447，P聯-排=0.006；t聯-別=-3.437，P聯-別=0.006）。造模第21天檢測Cr、BUN、XOD濃度，模型組內三者濃度均明顯高于正常組，（Cr：t模-正=49.010，P=0.000；BUN：t模-正=57.162；P=0.000；XOD：t模-正=40.008，P=0.000）；同模型組相比，治療組Cr、BUN、XOD濃度明顯下降低于模型組，（Cr：t排-模=-13.294，P排-模=0.000；t別-模=-17.072，P別-模=0.000；t聯-模=-31.580，P聯-模=0.000；BUN：t排-模=-27.878，P排-模=0.000；t別-模=-31.774，P別-模=0.000；t聯-模=-45.864，P聯-模=0.000；XOD：t排-模=-12.962，P排-模=0.000；t別-模=-12.962，P別-模=0.000；t聯-模=-28.471，P聯-模=0.000）。治療組Cr濃度下降效果依次為聯合用藥組＞別嘌醇組＞排酸護腎組（t聯-別=-14.508，P=0.000；t聯-排=-18.286，P=0.000；t別-排=-3.778，P=0.001）；治療組BUN濃度下降效果依次為聯合用藥組＞別嘌醇組＞排酸護腎組（t聯-別= -14.090，P=0.000；t聯-排=-17.986，P=0.000；t別-排=-3.896，P=0.001）；治療組XOD濃度下降效果，聯合用藥組效果優(yōu)于排酸護腎組和聯合用藥組（t聯-別= -18.841，P=0.000；t聯-排= -40.796，P=0.000），結果見表2。

3.3 排酸護腎湯對腎組織URAT1表達水平的影響

造模第21天，測量各組大鼠腎組織的URAT1mRNA表達水平。模型組URAT1mRNA表達水平高于正常組（Hc=25.889，P=0.000）。別嘌醇組URAT1mRNA表達水平低于模型組（Hc=-31.111，P=0.000），且別嘌醇組效果優(yōu)于聯合用藥組。（Hc=-19.611，P=0.015）。

圖1 小鼠體質量隨時間變化折線圖

圖2 排酸護腎湯對MAPKAPK-2和p38MAPK的影響

3.4 排酸護腎湯對MAPK信號通路相關蛋白水平的影響

造模第21天，對腎組織MAPK信號通路的MAPKAPK-2、p38MAPK蛋白進行測定。結果顯示，模型組的MAPKAPK-2、p38MAPK蛋白含量較正常組明顯升高，這說明造模成功，排酸護腎組MAPKAPK-2、p38MAPK蛋白含量明顯低于模型組，但略高于別嘌呤醇組和聯合用藥組。這表明排酸護腎湯可以通過MAPK信號通路對尿酸性腎病進行治療。結果見圖2。

4 討論

排酸護腎湯由常用排石藥及護腎藥組成。海金沙、金錢草、土茯苓主要具備清利濕熱的功能，以達消石利尿之效，輔之以丹參、川芎以活血理氣，以活血通絡，減輕炎癥反應，熟地、女貞子補腎固本，以改善腎功能。本方除應用利水化濕藥物，可促進尿酸排泄外，少佐幾味活血化瘀藥，能夠擴張血管改善腎臟循環(huán)，又能預防腎間質纖維化，減少炎癥細胞對腎小管及腎間質的損傷。臨床數據也證實其治療痛風、尿酸性腎病有獨特的療效，數十年間已積累大量成功有效的案例。

慢性腎病患者常出現高尿酸血癥，并伴有血清Cr和BUN升高[3-4]。以往的其他研究報告表明，別嘌呤醇明顯阻斷高尿酸血癥大鼠的腎功能改變，并且降低患者的Cr和UA水平[5-6]。在本研究中，酵母和腺嘌呤誘導的尿酸性腎病大鼠模型可見Cr、BUN明顯上升。但在排酸護腎湯作用之后，這兩個指標顯著降低，預示造成腎臟損傷的物質得到控制，腎功能得到一定程度的改善。同時，聯合用藥比單獨使用排酸護腎湯或別嘌呤醇對Cr、BUN、XOD三組指標的作用更大，提示臨床可以通過聯合用藥起到改善療效的目的。

Richette P等[7]報告90%以上的尿酸性腎病是由尿酸排泄受損引起的。尿酸轉運體基因URAT 1對UA在人體內的再吸收起著重要作用。此外，它也是一種藥物靶點，可被尿酸類藥物如苯溴馬龍和丙磺舒所抑制[8]。在本研究中，成功誘導的尿酸性腎病小鼠體內URAT 1基因表達增強。經排酸護腎湯治療后，URAT 1 的mRNA表達明顯下降。這些結果表明，排酸護腎湯可能在減少尿酸鹽的再吸收中發(fā)揮作用，這一作用主要通過抑制URAT1基因的表達發(fā)揮作用。

MAPK通路包括ERK、JNK和p38這一類的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族[9-10]，MAPK的激活對應激誘導的細胞凋亡有一定的促進作用[11-12]，最終導致腎臟的纖維化。本研究結果表明，造模成功的小鼠體內可見p38磷酸化。排酸護腎湯也被觀察到抑制MAPK的激活，這表明排酸護腎湯通過MAPK信號通路減少氧化應激誘導的上皮細胞凋亡，從而有效緩解腎臟纖維化。

綜上所述，對于尿酸性腎病大鼠模型，排酸護腎湯可通過減少Cr，BUN，XOD的含量來改善腎功能，其作用于尿酸轉運蛋白URAT1減少尿酸的重吸收，并且通過抑制MAPK通路來抑制炎癥反應，減輕腎臟纖維化。