3 種淫羊藿苷次生產(chǎn)物的制備及HPLC 測定

楊軼舜張 彤?丁 越陳嘉雯周奕嘉趙日吉吳華燕宋澤家

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心，上海201203； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海201203）

淫羊藿，又名仙靈脾，其主要功效為補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨［1］。淫羊藿苷為淫羊藿主要有效成分。近年來，關(guān)于中藥有效成分體內(nèi)代謝研究表明，中藥有效成分除了以原型化合物發(fā)揮作用外，還有一部分需經(jīng)過腸內(nèi)菌群的作用，轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物后才能發(fā)揮藥效作用［2］。寶藿苷Ⅰ（淫羊藿次苷Ⅱ）和脫水淫羊藿素（淫羊藿苷元）是淫羊藿苷的次生苷和苷元，也是其主要代謝產(chǎn)物，即淫羊藿苷脫去一分子葡萄糖后生成寶藿苷Ⅰ，再脫去一分子鼠李糖生成脫水淫羊藿素（淫羊藿苷元）。王婷等［3］對6 種淫羊藿中的黃酮類成分進(jìn)行了抗腫瘤活性的研究，結(jié)果表明淫羊藿苷、木犀草素、朝藿素和寶藿苷Ⅰ對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和人肝癌細(xì)胞HepG2 的增殖有抑制作用，且寶藿苷Ⅰ對MCF-7細(xì)胞的抑制效果強(qiáng)于淫羊藿苷。寶藿苷Ⅰ有較好的抗肺癌藥效作用，其藥效優(yōu)于淫羊藿中其他黃酮類多糖苷［4］。藥理研究表明，脫水淫羊藿素有廣譜的抗腫瘤作用，其對人肝臟、血液淋巴系統(tǒng)、乳腺、結(jié)腸、胰腺、肺、前列腺、宮頸等腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用［5］。此外，淫羊藿次苷Ⅰ是淫羊藿苷脫去一分子鼠李糖生成的次生苷，其抗骨質(zhì)疏松活性優(yōu)于淫羊藿苷［6］。

目前，淫羊藿苷次生苷和苷元的制備方法主要有酸水解法、酶水解法和酸解-酶解兩步法［5］。酸水解法采用鹽酸、硫酸或硫酸與醋酸混合的方法水解淫羊藿苷［7］，但酸水解反應(yīng)條件劇烈，易生成副產(chǎn)物。而酶水解反應(yīng)具有特異性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高、分離純化簡單、對環(huán)境沒有污染等優(yōu)點［8］。常用于水解淫羊藿苷的酶為β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、柚皮苷酶和蝸牛酶。由于淫羊藿苷含有2 個糖基，因此不同酶水解生成的產(chǎn)物不同。研究表明，β-葡萄糖苷酶［9］、纖維素酶［10］及柚皮苷酶均能水解淫羊藿苷生成寶藿苷Ⅰ，且β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)化率顯著高于其他2 種酶［4］。另一方面，柚皮苷酶和蝸牛酶能水解淫羊藿苷生成寶藿苷Ⅰ和脫水淫羊藿素［5］。但鮮有淫羊藿次苷Ⅰ制備方法的報道，尤其是酶解法往往無法制備淫羊藿次苷Ⅰ，能夠水解α-鼠李糖苷鍵的酶如柚皮苷酶和蝸牛酶會同時水解β-葡萄糖苷鍵，在此類酶的作用下往往生成寶藿苷Ⅰ和脫水淫羊藿素，無法生成淫羊藿次苷Ⅰ。易鵬等［11］研究表明，淫羊藿苷的葡萄糖苷鍵容易被β-葡萄糖苷酶水解，而其鼠李糖苷鍵易被稀硫酸水解，所以可以采用酸解和酶解2 種方法相結(jié)合來制備脫水淫羊藿素。

本研究采用酸解法制備淫羊藿次苷Ⅰ、酶解法制備寶藿苷Ⅰ，以及酸解和酶解結(jié)合法制備脫水淫羊藿素，并建立HPLC 法同時測定3 種淫羊藿苷次生產(chǎn)物的含有量。

1 儀器與試藥

Aglient 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；PH 計（美國Eutech 公司）；XS105 型微量分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DF-101S 型恒溫磁力攪拌器（上海鷹迪儀器設(shè)備有限公司）。淫羊藿次苷Ⅰ（批號YJ06285A14）、寶藿苷Ⅰ（批號HS0918XA13）、脫水淫羊藿素（淫羊藿苷元，批號YA0903S13）對照品和蝸牛酶均購自上海源葉生物科技有限公司；淫羊藿苷（武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司）；β-葡萄糖苷酶（實驗室自制，來源于里氏木霉QM9414）。乙腈和甲醇為色譜純（安徽時聯(lián)特種溶劑公司）；其他試劑均為分析純或生化純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 淫羊藿次苷Ⅰ制備 稱取淫羊藿苷50 mg，加入乙醇和5%稀硫酸溶液各3.75 mL，50 ℃攪拌反應(yīng)24 h。抽濾反應(yīng)液，收集沉淀。沉淀在40 ℃下真空干燥3 h，得淫羊藿次苷Ⅰ粗品，硅膠柱層析，得精制品。

2.2 寶藿苷Ⅰ制備 稱取淫羊藿苷和β-葡萄糖苷酶各50 mg，加入0.2 mol／L pH 4.0 的醋酸-醋酸鈉緩沖液10 mL，40 ℃攪拌反應(yīng)5 h。乙酸乙酯萃取（50 mL×3 次），收集有機(jī)相，用少量無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱靜置結(jié)晶。收集結(jié)晶，在40 ℃下真空干燥3 h，得寶藿苷Ⅰ粗品，將粗品用甲醇重結(jié)晶，得精制品。

2.3 淫羊藿苷元（脫水淫羊藿素）制備

2.3.1 蝸牛酶解法 稱取淫羊藿苷和蝸牛酶各20 mg 于20 mL磷酸緩沖液（0.2 mol／L，pH 6.0）中，37 ℃攪拌5 h，乙酸乙酯萃?。?0 mL×3 次），收集上層溶液，用少量無水硫酸鈉干燥，旋蒸濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱靜置結(jié)晶。結(jié)晶在40 ℃下真空干燥3 h，成品于4 ℃密封保存。

2.3.2 酸解-酶解法 稱取淫羊藿苷50 mg，依次加入乙醇和5%稀硫酸溶液各3.75 mL，在50 ℃水浴中攪拌24 h，抽濾，收集沉淀Ⅰ（淫羊藿次苷Ⅰ）。將50 mg β-葡萄糖苷酶溶于10 mL 0.2 mol／L pH 4.0 的醋酸緩沖液中，將得到的沉淀Ⅰ充分轉(zhuǎn)移至酶溶液中，置于40 ℃水浴中繼續(xù)攪拌8 h，抽濾反應(yīng)液，收集沉淀Ⅱ（脫水淫羊藿素），濾液用乙醚萃?。?5 mL×3 次），收集有機(jī)相，用少量無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱靜置結(jié)晶。將結(jié)晶和沉淀Ⅱ在40 ℃下真空干燥3 h，得脫水淫羊藿素粗品，硅膠柱層析，得精制品。

2.3.3 酶解-酸解法 稱取β-葡萄糖苷酶50 mg 于10 mL 0.2 mol／L pH 4.0 的醋酸緩沖液中，待酶溶解后，取50 mg淫羊藿苷置于酶溶液中，于40 ℃水浴中攪拌8 h，加入乙醇和5%稀硫酸溶液各3.75 mL，在50 ℃水浴中繼續(xù)攪拌24 h，抽濾，保留沉淀，再將濾液用乙醚萃取（15 mL×3次），保留上層溶液，用少量無水硫酸鈉干燥，旋蒸濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱靜置結(jié)晶。將結(jié)晶和沉淀在40 ℃下真空干燥3 h，成品于4 ℃密封保存。

2.3.4 混酸法 稱取28 mg 淫羊藿苷，加入0.6 mL 5 mol／L硫酸溶液和2 mL 80%冰醋酸，于80 ℃水浴中回流攪拌24 h，乙醚萃?。?0 mL×3 次），保留上層溶液，用少量無水硫酸鈉干燥，旋蒸濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱靜置結(jié)晶。結(jié)晶在40 ℃下真空干燥3 h，成品于4 ℃密封保存。

2.4 淫羊藿苷次生產(chǎn)物測定

2.4.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.1% 磷酸（70∶ 30）；體積流量1 mL／min；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長270 nm；柱溫30 ℃。色譜圖見圖1。

2.4.2 溶液制備

2.4.2.1 對照品溶液 分別精密稱取淫羊藿次苷Ⅰ、寶藿苷Ⅰ、脫水淫羊藿素對照品7.44、9.66、10.24 mg 于10 mL量瓶中，乙腈-0.1%磷酸（70∶30）溶解后定容，搖勻，配制成淫羊藿次苷Ⅰ、寶藿苷Ⅰ、脫水淫羊藿素質(zhì)量濃度分別為744、966、1 024 μg／mL 的溶液，即得。

2.4.2.2 供試品溶液 精密稱取按“2.1”“2.2”“2.3”項下方法制備的淫羊藿苷各水解產(chǎn)物5 mg，分別置于10 mL量瓶中，加入乙腈-0.1%磷酸（70∶30）溶解后，稀釋定容，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.4.3 線性關(guān)系考察 將“2.4.2.1”項下對照品溶液用乙腈-0.1%磷酸（70∶30）稀釋2、4、10、20、40、100倍，即得系列質(zhì)量濃度，在“2.4.1”項色譜條件下測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.4.4 精密度試驗 取“2.4.2.1”項下對照品溶液適量，在“2.4.1”項色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得淫羊藿次苷Ⅰ、寶藿苷Ⅰ、脫水淫羊藿素峰面積RSD 分別為0.16%、0.21%、0.25%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗 按“2.4.2.2”項下方法制備供試品溶液6 份，在“2.4.1”項色譜條件下進(jìn)樣，測得淫羊藿次苷Ⅰ、寶藿苷Ⅰ、脫水淫羊藿素峰面積RSD 分別為1.64%、1.47%、1.51%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 h 在“2.4.1”項色譜條件下進(jìn)樣，測得淫羊藿次苷Ⅰ、寶藿苷Ⅰ、脫水淫羊藿素峰面積RSD分別為1.92%、0.88%、0.49%，表明供試品在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.4.7 加樣回收率試驗 稱取淫羊藿苷50 mg，依次加入乙醇和5% 稀硫酸溶液各3.75 mL，在50 ℃水浴中攪拌10 h，抽濾，收集沉淀Ⅰ。將50 mg β-葡萄糖苷酶溶于10 mL 0.2 mol／L pH 4.0 醋酸緩沖液中，將得到的沉淀Ⅰ充分轉(zhuǎn)移至酶溶液中，置于40 ℃水浴中繼續(xù)攪拌3 h，抽濾反應(yīng)液，收集沉淀Ⅱ。沉淀Ⅱ在40 ℃下真空干燥3 h，得含有淫羊藿次苷Ⅰ、寶藿苷Ⅰ、脫水淫羊藿素的混合樣品，并按“2.4.2.2”項下方法制備供試品溶液6 份，在“2.4.1”項色譜條件下進(jìn)樣，測混合樣品中淫羊藿次苷Ⅰ、寶藿苷Ⅰ和脫水淫羊藿素的含有量。

取各成分已知的供試品溶液6 份，精密加入淫羊藿次苷Ⅰ、寶藿苷Ⅰ、脫水淫羊藿素對照品適量，在“2.4.1”項色譜條件下進(jìn)樣，測得淫羊藿次苷Ⅰ、寶藿苷Ⅰ、脫水淫羊藿素的平均加樣回收率分別為98.63%、99.64%、100.07%，RSD 分別為0.53%、0.30%、0.64%。

2.4.8 樣品含有量測定 按“2.1”項下方法酸水解得到淫羊藿次苷Ⅰ，其含有量為82.15%，產(chǎn)率為60.01%。按“2.2”項下方法通過酶水解淫羊藿苷得到的寶藿苷Ⅰ，其含有量為74.53%，產(chǎn)率為66.03%。

按“2.3”項下方法，制備脫水淫羊藿素。（1）酸解-酶解法，即先經(jīng)過硫酸水解淫羊藿苷生成淫羊藿次苷Ⅰ，再用β-葡萄糖苷酶水解淫羊藿次苷Ⅰ生成脫水淫羊藿素；（2）酶解-酸解法，即先用β-葡萄糖苷酶水解淫羊藿苷生成寶藿苷Ⅰ，再用硫酸水解寶藿苷Ⅰ生成脫水淫羊藿素。結(jié)果表明，蝸牛酶水解法、酸解-酶解法和酶解-酸解法水解淫羊藿苷的反應(yīng)產(chǎn)物中均有脫水淫羊藿素，但蝸牛酶水解法和酶解-酸解法產(chǎn)物中含有較多副產(chǎn)物、產(chǎn)率不高，分別為18.01%和21.84%，見表2；酸解-酶解法產(chǎn)物純度和產(chǎn)率均較高，其含有量為88.01%，產(chǎn)率為45.61%；而硫酸-醋酸混合法（混酸法）所得產(chǎn)物并非脫水淫羊藿素，而是極性比其小的另一產(chǎn)物。

表2 各淫羊藿苷水解產(chǎn)物的含有量和產(chǎn)率

淫羊藿次苷Ⅰ粗品經(jīng)硅膠柱層析后，含有量為99.78%，總得率為47.23%；寶藿苷Ⅰ粗品經(jīng)重結(jié)晶后，含有量為98.43%，總得率為44.70%；將酸解-酶解法所得產(chǎn)物—脫水淫羊藿素粗品經(jīng)硅膠柱層析后，含有量為99.38%，總得率為32.29%。

3 討論

由于淫羊藿苷含有2 個糖基——葡萄糖基和鼠李糖基，見圖2。因此，酸水解法常常會產(chǎn)生淫羊藿次苷Ⅰ、寶藿苷Ⅰ和脫水淫羊藿素等多種產(chǎn)物，難以獲得單一的產(chǎn)物。目前，文獻(xiàn)報道的酸水解法采用鹽酸、硫酸或硫酸與醋酸混合的方法水解淫羊藿苷［5］。本研究表明，鹽酸水解淫羊藿苷可以生成寶藿苷Ⅰ和脫水淫羊藿素，但有明顯的副產(chǎn)物生成。硫酸水解淫羊藿苷可獲得淫羊藿次苷Ⅰ，且其純度高，粗品含有量為82.15%，產(chǎn)率為60.01%；β-葡萄糖苷酶水解法可獲得寶藿苷Ⅰ，且純度較高，粗品含有量為74.53%，產(chǎn)率為66.03%。

圖2 淫羊藿苷次生產(chǎn)物制備路線圖

雖有報道稱硫酸與醋酸混合的方法水解淫羊藿苷可獲得脫水淫羊藿素［7］，但本研究表明，該方法無法獲得脫水淫羊藿素，而是極性較小的另一化合物。蝸牛酶水解和酶解-酸解法雖可獲得脫水淫羊藿素，但生成副產(chǎn)物較多導(dǎo)致產(chǎn)品純度不高，產(chǎn)率低，蝸牛酶水解淫羊藿苷產(chǎn)率僅為18.01%，酶解-酸解法產(chǎn)率為21.84%；酸解-酶解法產(chǎn)物純度和產(chǎn)率均較高，粗品含有量為88.01%，產(chǎn)率為45.61%，因此適用于脫水淫羊藿素的制備。

本實驗建立了淫羊藿苷次生苷和苷元的制備方法，即通過酸解法制備淫羊藿次苷Ⅰ、酶解法制備寶藿苷Ⅰ，以及酸解和酶解結(jié)合法制備脫水淫羊藿素（淫羊藿苷元），并通過重結(jié)晶純化獲得了純度大于98%的寶藿苷Ⅰ，通過硅膠柱層析純化獲得了純度大于98%的淫羊藿次苷Ⅰ和脫水淫羊藿素。該方法操作簡便、得率高，產(chǎn)物分離純化步驟較簡單，純化產(chǎn)物純度高，以期為開展淫羊藿苷次生產(chǎn)物藥理活性研究奠定基礎(chǔ)。