電針對血管性癡呆大鼠腦白質(zhì)纖維和學(xué)習(xí)記憶功能的效果

張冰雪，楊敏光，李建鴻，陶靜,,3，梁勝祥，柳維林，陳立典,,3

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建福州市 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)療技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建福州市 350122；3.福建省康復(fù)技術(shù)協(xié)同中心，福建福州市 350122

血管性癡呆(vascular dementia,VD)又稱血管性認(rèn)知功能障礙，是指由腦血管病變引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙等一系列癥狀。我國65 歲以上人群中，1.1%～3.0%被診斷為癡呆，其中VD 占0.9%[1-2]。VD已成為僅次于阿爾茨海默病的第二大老年性癡呆疾病[3]，給家庭和社會(huì)帶來巨大的影響和負(fù)擔(dān)。

腦血管病變包括腦白質(zhì)損傷、腔隙性梗死和微出血，其中腦白質(zhì)損傷是造成VD 的重要原因[4]。磁共振彌散張量成像(diffusion tensor imaging,DTI)是在體研究白質(zhì)的有效工具，主要通過彌散各向異性分?jǐn)?shù)(fractional anisotrophy,FA)等指標(biāo)，量化觀察白質(zhì)纖維束的完整性[5]，實(shí)現(xiàn)可視化研究VD 腦白質(zhì)損傷[6]。VD患者認(rèn)知功能障礙與腦白質(zhì)改變相關(guān)[7]，腦白質(zhì)彌漫性病變甚至早于臨床癥狀出現(xiàn)[8-9]。

針刺在VD治療中應(yīng)用廣泛。電針可有效增強(qiáng)VD患者的學(xué)習(xí)和記憶能力[10-11]；針刺可明顯改善VD模型大鼠總體認(rèn)知功能[12-13]。皮質(zhì)下VD患者腦缺血側(cè)白質(zhì)纖維FA 降低[14]；VD 患者全腦平均FA 較正常人低[15]。電針干預(yù)后，模型大鼠腦缺血灶中心和邊緣FA 增加[16]。本課題組前期研究證實(shí)，電針百會(huì)、神庭能影響癡呆大鼠腦結(jié)構(gòu)，治療認(rèn)知功能障礙[17-19]。本研究利用DTI 觀察電針百會(huì)、神庭前后白質(zhì)纖維情況，以探討電針治療VD可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Sprague-Dawley 大鼠，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2014-0002，體質(zhì)量(280±30) g。于福建中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心分籠喂養(yǎng)，許可證號SYXK(閩)2014-001。全部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理均通過動(dòng)物管理委員會(huì)審批，并嚴(yán)格遵從國際動(dòng)物保護(hù)法規(guī)施行。

1.2 儀器和試劑

戊巴比妥鈉(CQ6125000)：SIGMA 公司。動(dòng)物用青霉素鈉：山東魯抗。異氟烷(R510-22)：RWD 公司。小動(dòng)物磁共振成像儀(MiniMR-60 MRI system 7.0 T)：德國BRUKER 公司。SDZ-V 型電針儀、華佗牌毫針(直徑0.25 mm、長13 mm)：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。

1.3 模型與分組

將大鼠分為造模組和假手術(shù)組(n=8)。造模組參照Huang 等[20]的方法造模。大鼠術(shù)前禁食24 h，隨后稱重。大鼠用2%戊巴比妥鈉2 ml/kg 腹腔注射麻醉，仰臥置于專用手術(shù)保溫墊上，四肢用醫(yī)用膠帶粘附固定，不可粘貼過緊，以免出現(xiàn)四肢末端缺血損傷。75%酒精于鎖骨上緣至頜下約5×3.5 cm 區(qū)域消毒，剔毛備皮。鑷子夾起頸部皮膚，沿正中線切開，從左側(cè)胸骨舌骨肌、胸鎖乳突肌和肩胛舌骨肌交叉點(diǎn)向下分離，找到左頸總動(dòng)脈，顯微鑷小心分離頸總動(dòng)脈與迷走神經(jīng)，在頸總動(dòng)脈與迷走神經(jīng)間穿一條不可吸收的外科縫合線，結(jié)扎左頸動(dòng)脈。5 min 后同法分離并結(jié)扎右頸總動(dòng)脈。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不進(jìn)行結(jié)扎。清潔創(chuàng)口，縫合皮膚。腹腔注射動(dòng)物用青霉素鈉溶液0.5 ml/kg。大鼠置于盛有木屑的托盤內(nèi)，26 ℃左右室溫，自然蘇醒，回籠飼養(yǎng)。

術(shù)后12 d 對大鼠行新物體識別試驗(yàn)[23]。與假手術(shù)組相比，造模組中新物體偏愛系數(shù)降低的大鼠視為造模成功。納入模型大鼠24只，隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組(n=8)、非穴組(n=8)和電針組(n=8)。

1.4 干預(yù)方法

術(shù)后14 d，電針組參照方劍喬等[21]的定位方法取百會(huì)、神庭行電針干預(yù)，疏密波，頻率1/20 Hz，刺激強(qiáng)度1 mA。每天固定時(shí)間干預(yù)1次，持續(xù)30 min。

非穴組取雙側(cè)腋下非經(jīng)非穴點(diǎn)[22]，同法電針干預(yù)。

模型組和假手術(shù)組同等條件抓取。

1.5 新物體識別試驗(yàn)

造模后12 d (干預(yù)前)和40 d (干預(yù)前)，于上午9:00～12:00 對大鼠進(jìn)行測試。在特殊材料制成的80×80×60 cm 無頂敞箱內(nèi)，放置不易被大鼠推倒的罐子作為識別物體，分為A、B 兩組。A 組為兩個(gè)完全相同物體(A、a)，B 組是一個(gè)與A 物體大小相似的物體(B)，且大鼠在生活環(huán)境中從未見過。敞箱上方固定光源和攝像機(jī)，使用Super Maze動(dòng)物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)追蹤大鼠的活動(dòng)軌跡，記錄其在敞箱內(nèi)活動(dòng)和與物體接觸的情況。實(shí)驗(yàn)過程中保持敞箱和光源的位置不變，實(shí)驗(yàn)過程中保持安靜。實(shí)驗(yàn)為適應(yīng)、學(xué)習(xí)、測試3個(gè)階段，持續(xù)3 d。

適應(yīng)階段：將實(shí)驗(yàn)大鼠放于沒有任何物體的敞箱中自由探索10 min。學(xué)習(xí)階段：適應(yīng)24 h 后，在箱內(nèi)同側(cè)兩個(gè)角落分別放置物體A 和a，將大鼠背朝物體放入敞箱，自由探索10 min。測試階段：學(xué)習(xí)后1 h和24 h，將大鼠熟悉的物體a 換成新物體B，大鼠背對物體放入敞箱，自由探索5 min。

每只大鼠測試前，將敞箱和物體用75%酒精擦拭，以祛除上一只大鼠的氣味殘留。

判別標(biāo)準(zhǔn)：大鼠用鼻子、胡須、前肢觸碰探索物體，或鼻子、胡須與識別物體間的間隔≤2 cm 記為識別行為；趴在物體上向四周探索或在物體旁轉(zhuǎn)身、下蹲均記為識別行為。大鼠在測試階段探索物體A、B的時(shí)間記為T1、T2，偏愛系數(shù)β=T2/(T1+T2)×100%。學(xué)習(xí)后1 h和24 h的偏愛系數(shù)記為β1和β2。

1.6 DTI

干預(yù)前后，大鼠行DTI 掃描。大鼠3%異氟烷誘導(dǎo)麻醉5 min，100 μg/ml 鹽酸美托嘧啶0.5 ml/kg 下肢肌肉注射深度麻醉，俯臥位置于磁共振掃描床上，頭部戴專用表面線圈，牙桿和雙側(cè)耳桿固定。水循環(huán)加熱系統(tǒng)維持大鼠體溫相對恒定，SurgiVet V3395TPR生理檢測儀(美國SMITHS MEDICAL 公司)實(shí)時(shí)監(jiān)測大鼠體溫、呼吸和心率。掃描參數(shù)：TE 32.25 ms，TR 12000 ms，F(xiàn)OV 32×32 mm，Segment 4，Averages 1，Image Size 128×128，Slices 48，b01000 s/mm2，Slice Thickness 0.56 mm，no slice gap。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)用()表示，經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布且方差齊，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。顯著性水平α=0.05。

采用FSL(http://fmrib.ox.ac.uk/fsl)和spmratIHEP[24]軟件分析DTI 數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)行渦流矯正；手動(dòng)顱骨剝離得到全腦掩膜圖像，計(jì)算各動(dòng)物b0像和全腦FA 像；將b0像配準(zhǔn)到大鼠標(biāo)準(zhǔn)腦模板，保留變換函數(shù)，實(shí)現(xiàn)FA 像向大鼠標(biāo)準(zhǔn)腦膜版的空間標(biāo)準(zhǔn)化[25]；采用3 倍體素平滑核平滑；基于一般線性模型，采用方差分析，對平滑后數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.005、團(tuán)簇＞10為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 新物體識別試驗(yàn)

干預(yù)前，與假手術(shù)組相比，模型組、電針組和非穴組β1和β2均下降(P＜0.05)，后三組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

干預(yù)后，與模型組相比，電針組β1和β2均升高(P＜0.05)。見表2。

表1 干預(yù)前各組新物體偏愛系數(shù)的比較(%)

表2 干預(yù)后各組新物體偏愛系數(shù)比較(%)

2.2 DTI

干預(yù)前，與假手術(shù)組相比，模型組胼胝體、扣帶回、海馬、外囊白質(zhì)纖維FA 降低(圖1)。干預(yù)后，與模型組相比，非穴組海馬白質(zhì)纖維FA增加(圖2)，電針組海馬、扣帶回、胼胝體、外囊白質(zhì)纖維FA增加(圖3)；與非穴組相比，電針組海馬、胼胝體、外囊白質(zhì)纖維FA 增加(圖4)。

3 討論

VD 屬中醫(yī)“呆病”，基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，病位在腦但涉及臟腑。多因氣血虧虛，加之內(nèi)傷勞倦，引起陰陽失調(diào)；髓海不足，陽氣衰虛；痰濁瘀阻，神機(jī)失用，遂為癡呆[26-27]。督脈陽氣虛衰所致臟腑功能低下是癡呆病主要原因之一[28]。百會(huì)、神庭為督脈要穴，百脈之會(huì)，神志所在，是上行之氣聚集處。針刺百會(huì)、神庭可通行氣血、升陽舉陷、開竅醒腦，治療癡呆等神志病變。

針刺療法能有效治療VD 所致的認(rèn)知功能障礙[29-30]。馬莉等[31]綜述近10 年針刺治療VD 的相關(guān)報(bào)道，顯示針刺法療效優(yōu)于一般藥物組或常規(guī)治療組。邵瑛等[32]電針百會(huì)等穴，明顯改善VD 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。江一靜等[33]針刺百會(huì)、神庭，提高非癡呆型血管性認(rèn)知障礙患者的認(rèn)知能力。本研究顯示，電針百會(huì)、神庭能增加認(rèn)知相關(guān)腦區(qū)白質(zhì)纖維FA，有效改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

圖1 模型組與假手術(shù)組FA差異圖

圖2 非穴組與模型組FA差異圖

圖3 電針組與模型組FA差異圖

圖4 電針組與非穴組FA差異圖

新物體識別試驗(yàn)可檢測大鼠的總體認(rèn)知功能。先讓動(dòng)物熟知兩個(gè)物體，隨后將其中一個(gè)換成新物體，動(dòng)物本能將探尋新物體，較少探尋熟知物體。通過比較對新物體的探尋時(shí)間占整個(gè)探尋時(shí)間的比例判斷大鼠的記憶能力。若大鼠對新舊物體的探尋指數(shù)無差異，表明大鼠存在記憶障礙。VD 模型小鼠新物體識別試驗(yàn)顯示顯著的學(xué)習(xí)和記憶障礙，治療后新物體辨別指數(shù)和辨別系數(shù)提高[34]。本研究顯示，電針百會(huì)、神庭能提高VD大鼠的記憶能力。

白質(zhì)主要由有髓纖維和膠質(zhì)細(xì)胞組成，連接各皮質(zhì)，負(fù)責(zé)神經(jīng)元間信號傳遞，對學(xué)習(xí)、記憶有重要影響[35]，腦白質(zhì)損傷可引起不同程度認(rèn)知功能下降[35]。VD 患者的認(rèn)知功能障礙與腦白質(zhì)損傷相關(guān)[36]。特定位置白質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性與特定認(rèn)知障礙有關(guān)，癡呆患者前額葉、海馬等腦區(qū)白質(zhì)纖維受損，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[37]。

FA 能量化評價(jià)腦白質(zhì)纖維損傷。VD 患者腦缺血側(cè)白質(zhì)纖維FA 降低，主要集中于雙側(cè)前額葉、扣帶回、海馬和下額枕束區(qū)[8,14]。電針后白質(zhì)纖維見不同程度重構(gòu)[38]。本研究顯示，VD 模型大鼠電針干預(yù)后，白質(zhì)纖維改變主要存在于胼胝體、扣帶回、外囊等腦區(qū)，集中在前額葉皮質(zhì)、海馬等重要部位，提示電針能夠修復(fù)認(rèn)知功能相關(guān)腦區(qū)白質(zhì)纖維損傷。

綜上所述，電針百會(huì)、神庭可修復(fù)VD 大鼠白質(zhì)纖維束損傷，特別是與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的前額葉、海馬等腦區(qū)，白質(zhì)的恢復(fù)與認(rèn)知功能恢復(fù)相關(guān)。電針非穴和特定穴位對不同腦區(qū)白質(zhì)纖維及認(rèn)知障礙的影響仍需進(jìn)一步研究。