轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)及其在豬肉質(zhì)遺傳研究中的應(yīng)用

甘麥鄰，沈林園，楊東麗，王定國(guó)，張順華，朱 礪*

（1．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130；3.瀘州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 瀘州 646000；4．成都市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，大量物種的基因組被解析，大大地加快了相關(guān)研究的速度和進(jìn)展[1]。伴隨著相關(guān)研究技術(shù)和方法的成熟，近年來(lái)隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等組學(xué)研究的相繼出現(xiàn)，開啟了生命科學(xué)研究的后基因組時(shí)代[2-3]。轉(zhuǎn)錄本身是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)和可變的過(guò)程，而轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是目前研究最廣泛、最重要的調(diào)控方式。轉(zhuǎn)錄組反映特定物種的組織、器官或細(xì)胞在特定生理環(huán)境和發(fā)育狀態(tài)下的RNA表達(dá)情況。轉(zhuǎn)錄組同相對(duì)穩(wěn)定的基因組比較，在不同的生理狀態(tài)和環(huán)境的影響下呈現(xiàn)高度的動(dòng)態(tài)變化，能直觀反映個(gè)體或細(xì)胞對(duì)環(huán)境的應(yīng)答[4]。

豬不僅可以為人類提供重要的肉產(chǎn)品，而且作為良好的動(dòng)物模型在人類疾病研究中發(fā)揮著重要的作用。2009年由美、英、法等多國(guó)科學(xué)家組成的研究小組首次繪制出了杜洛克豬的基因組草圖，隨后又不斷進(jìn)行了完善[5-6]。相關(guān)研究結(jié)果對(duì)提高豬肉產(chǎn)量、增強(qiáng)豬只免疫力，提升種豬繁殖性能的研究具有重要的參考意義。此外，由于豬在解剖結(jié)構(gòu)、生理指標(biāo)、行為模式和營(yíng)養(yǎng)需求等方面與人類具有很多相似之處；同時(shí)豬也具有對(duì)流感易感的特性，基于此科學(xué)家們可以以豬為相關(guān)人類疾病模型研究人類疾病，獸醫(yī)專家也可以洞悉豬的疾病；有助于豬流感疫苗、器官移植等涉及人類健康技術(shù)的研發(fā)。同時(shí)為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序提供了可靠的參考基因組。

1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

在自然界中生物許多性狀，尤其是大量的經(jīng)濟(jì)性狀通常是由許多基因共同調(diào)控的。相較于針對(duì)單一基因的研究，對(duì)多個(gè)基因或整體水平同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)地研究，有時(shí)能夠更為準(zhǔn)確地反映生物學(xué)問(wèn)題。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是解讀基因組功能元件和揭示細(xì)胞及組織分子機(jī)制的基礎(chǔ)，在生物表觀性狀和基因表達(dá)研究中占據(jù)了重要地位。

狹義的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特指編碼蛋白的RNA——信使RNA（mRNA）[7]，而廣義的轉(zhuǎn)錄組學(xué)則包含編碼和非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA），如核糖體RNA（rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）、小RNA（miRNA）、小干擾RNA（siRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）、環(huán)狀RNA（circRNA）、piRNA（與PIWI蛋白家族成員相結(jié)合的小RNA）、tRFs（由特定的核酸酶在tRNA的環(huán)上剪切，產(chǎn)生的特定大小的小RNA）等[8-9]。隨著對(duì)各種非編碼RNA研究的不斷深入，使得轉(zhuǎn)錄組研究范圍不斷深化。相較于研究起步最早也最為成熟的編碼RNA，非編碼RNA的研究正如火如荼，尤其以lncRNA和circRNA最甚[10-11]。由于非編碼RNA占了轉(zhuǎn)錄本的大多數(shù)，因此解析非編碼RNA的作用機(jī)制及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，對(duì)進(jìn)一步解析相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展和認(rèn)識(shí)生命的奧秘具有重要意義[12]。

2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)

當(dāng)前，針對(duì)轉(zhuǎn)錄組，相關(guān)科研團(tuán)隊(duì)開發(fā)了許多方法。從技術(shù)方法分類來(lái)看：較為常用的有基因芯片（Gene chip）[13]、表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）[14]、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNASeq）[15]等，其中轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是當(dāng)前應(yīng)用最多的技術(shù)手段。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序從研究對(duì)象來(lái)分又可分為：針對(duì)mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA及全轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序及分析技術(shù)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（transcriptme sequencing），也即RNA sequencing （RNA-Seq）又稱新一代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是一種非常有用的遺傳信息搜尋工具，同時(shí)也能夠?qū)D(zhuǎn)錄組進(jìn)行綜合分析，還可以用來(lái)鑒別、定位以及定量分析轉(zhuǎn)錄組信息[16]。因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)具備的眾多優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用在轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)研究中。

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序流程

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的主要流程為：1）細(xì)胞或組織總RNA的獲得，通常使用Trizo法提取總RNA，或相應(yīng)改進(jìn)試劑盒提取目的RNA，目前已有針對(duì)miRNA、piRNA等的專門化提取試劑盒；2）對(duì)RNA樣品進(jìn)行預(yù)處理（如富集處理等）；3）RNA樣品的片段化處理；4）RNA樣品反轉(zhuǎn)錄，制成cDNA；5）在反轉(zhuǎn)錄好的cDNA兩端連接接頭；6）進(jìn)行高通量測(cè)序；7）對(duì)測(cè)序片段進(jìn)行拼裝分析獲得轉(zhuǎn)錄組的序列信息和遺傳信息[17]。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的分析。對(duì)于無(wú)參考基因組的物種還需要構(gòu)建參考基因組或使用相近物種的參考基因組[18]，針對(duì)已有參考基因組的物種，其轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析則主要包含以下步驟（見(jiàn)圖1）。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在解析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能等方面發(fā)揮著重要作用，如發(fā)現(xiàn)可變剪切、融合基因以及非編碼的轉(zhuǎn)錄本等。由于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果分析，包括了轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平、對(duì)可變剪切的鑒定以及鏈方向特異性等，因此轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析遠(yuǎn)比基因組復(fù)雜，通常適用于基因組的組裝算法不能夠直接用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)分析。隨著信息技術(shù)的發(fā)展，生物信息學(xué)家又開發(fā)了一些新的專門用于轉(zhuǎn)錄組組裝的軟件，這些軟件主要有基于參考基因組的組裝方法和Denovo組裝等方法[19]，解決了部分轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的困難，為進(jìn)一步地廣泛使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

3 豬肉質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可分析豬某一組織、器官在不同生理狀態(tài)、發(fā)育階段以及不同處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的類別、結(jié)構(gòu)變異及其表達(dá)水平的變化，可篩選差異表達(dá)基因，進(jìn)而將基因和性狀和環(huán)境聯(lián)系起來(lái)，為進(jìn)一步治療豬病或搜尋豬遺傳育種相關(guān)靶點(diǎn)提供了參考[20]。同時(shí)還可以進(jìn)行基于轉(zhuǎn)錄水平的分子標(biāo)記物篩選，加快選育進(jìn)程，提升選育準(zhǔn)確度，為生豬養(yǎng)殖過(guò)程提供相應(yīng)的技術(shù)支撐。

通常研究人員通過(guò)轉(zhuǎn)錄測(cè)序用以發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因，進(jìn)一步研究分析差異基因的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。對(duì)于世界養(yǎng)豬業(yè)，DLY（杜洛克豬×長(zhǎng)白豬×大白豬）配套組合已經(jīng)成為經(jīng)典，并成為使用最為廣泛的商品豬養(yǎng)殖生產(chǎn)模式，極大地推動(dòng)了世界養(yǎng)豬生產(chǎn)的發(fā)展。但由于前期選育主要集中在豬只生長(zhǎng)速度和飼料轉(zhuǎn)化率上，一定程度上忽視了對(duì)肉質(zhì)性狀的選育。同時(shí)隨著人們對(duì)動(dòng)物遺傳資源和物種多樣性的進(jìn)一步理解，地方品種種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)利用也已經(jīng)成為了養(yǎng)豬生產(chǎn)的一個(gè)重要發(fā)展方向。因此對(duì)于豬肉質(zhì)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組研究，一方面集中在骨骼肌不同發(fā)育階段、生理狀態(tài)或差異生產(chǎn)性能下轉(zhuǎn)錄組差異研究；另一方面通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較地方豬種與主流豬種（杜洛克、長(zhǎng)白、大白、巴克夏、漢普夏等）轉(zhuǎn)錄差異，為保種及特殊遺傳資源開發(fā)提供參考。

3.1 mRNA轉(zhuǎn)錄組研究與應(yīng)用

信使RNA作為編碼蛋白的RNA，基于mRNA的測(cè)序通常能夠?qū)⒒蚪M和蛋白組緊密關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)具有重要遺傳效應(yīng)的基因，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序手段大量的研究發(fā)現(xiàn)了對(duì)豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的基因并驗(yàn)證了部分基因組測(cè)序數(shù)據(jù)?；谵D(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法Puig等分析了同一豬種不同脂肪沉積亞群背最長(zhǎng)肌轉(zhuǎn)錄組差異，發(fā)現(xiàn)在高脂亞群和低脂亞群鑒定出的131個(gè)差異表達(dá)基因顯著富集到了脂質(zhì)代謝通路中。同時(shí)該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)其中18個(gè)基因位于GWAS鑒定到的肌內(nèi)脂肪組成相關(guān)的基因組區(qū)域[21]。對(duì)背最長(zhǎng)肌含有不同IIB型肌纖維的大白豬進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，研究人員鑒定到355個(gè)差異表達(dá)基因，經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)主要與糖酵解代謝通路和肌細(xì)胞收縮過(guò)程相關(guān)[22]。Sodhi等人對(duì)成年濟(jì)州豬（JNP豬）和巴克夏豬的背最長(zhǎng)肌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，通過(guò)與巴克夏豬比較在JNP豬背最長(zhǎng)肌鑒定到了39個(gè)基因的表達(dá)，主要富集在代謝、蛋白結(jié)合等通路[23]。對(duì)25日齡沙子嶺豬和約克夏豬的背最長(zhǎng)肌做了轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析，研究人員鑒定得到488個(gè)差異表達(dá)基因和23個(gè)差異蛋白，對(duì)其進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要涉及到代謝、蛋白結(jié)合以及骨骼肌發(fā)育的通路[24]。對(duì)5月齡皖南花豬與大約克夏豬的背最長(zhǎng)肌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，差異表達(dá)基因主要參與糖酵解代謝、肌肉發(fā)育的生物學(xué)過(guò)程以及與脂肪酸代謝、生長(zhǎng)和胴體性狀相關(guān)的通路[25]。通過(guò)以上數(shù)據(jù)我們可以發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的肌肉轉(zhuǎn)錄差異主要集中在肌肉發(fā)育、脂質(zhì)代謝和糖酵解代謝等通路。

通過(guò)對(duì)骨骼肌不同發(fā)育階段、生理狀態(tài)或差異生產(chǎn)性能下轉(zhuǎn)錄組差異研究，以及不同特性豬種的轉(zhuǎn)錄組研究，進(jìn)一步豐富了基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為我們解析基因與環(huán)境間的互作和種質(zhì)資源保護(hù)提供了參考。

3.2 miRNA轉(zhuǎn)錄組研究與應(yīng)用

miRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種非編碼RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)其靶基因發(fā)揮調(diào)控作用。大量的研究也證實(shí)一些與肌肉相關(guān)的miRNA，如miR-1、miR-133、miR-206和miR-27等參與豬骨骼肌發(fā)育或肉質(zhì)相關(guān)[26-27]。與mRNA相比miRNA物種間保守性更強(qiáng)，預(yù)計(jì)miRNA的數(shù)量大約1 000個(gè)左右，但調(diào)控著大約60%的基因表達(dá)[28]。miRNA的轉(zhuǎn)錄測(cè)序是發(fā)現(xiàn)新的miRNA和研究已知miRNA差異表達(dá)的重要手段。

2012年南京農(nóng)業(yè)大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)對(duì)豬18個(gè)發(fā)育階段的背最長(zhǎng)肌進(jìn)行miRNA測(cè)序，通過(guò)與已有的miRNA進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)已知197個(gè)miRNA，新發(fā)現(xiàn)78個(gè)miRNA[29]。2015年四川農(nóng)業(yè)大學(xué)豬研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)5個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段豬的背最長(zhǎng)肌進(jìn)行測(cè)序，鑒定了404個(gè)已知的豬miRNA，18個(gè)新的miRNA和101個(gè)在其他哺乳動(dòng)物中保守的miRNA[30]。2017年重慶市畜牧科學(xué)院通過(guò)測(cè)定豬4個(gè)不同發(fā)育階段的肌肉和脂肪，鑒定得到329個(gè)已知的miRNA和157個(gè)新的miRNA[31]。

中山大學(xué)陳瑤生團(tuán)隊(duì)對(duì)長(zhǎng)白豬和藍(lán)塘豬骨骼肌發(fā)育8個(gè)不同階段miRNA進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，篩選到差異表達(dá)的258個(gè)miRNA在所有生長(zhǎng)階段的背最長(zhǎng)肌中均有表達(dá)[32]。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院相關(guān)團(tuán)隊(duì)基于長(zhǎng)白豬、桐城豬、五指山豬胚胎骨骼肌33、65和90 d的miRNA表達(dá)譜分析，分別鑒定得到33、18和67個(gè)差異表達(dá)miRNA，差異表達(dá)miRNA的靶基因主要涉及肌肉收縮和肌肉發(fā)育等過(guò)程[33]。

從以上研究的發(fā)表時(shí)間來(lái)看，在豬骨骼肌中越來(lái)越多的miRNA被鑒定，同時(shí)也仍在不斷發(fā)現(xiàn)新的miRNA。而針對(duì)差異miRNA的研究則以其靶基因?yàn)楹诵倪M(jìn)行生物功能分析，其靶基因調(diào)控通路和生物學(xué)過(guò)程與前述的mRNA的轉(zhuǎn)錄測(cè)序分析富集通路結(jié)果相似，從側(cè)面互相印證了miRNA及其靶基因所對(duì)應(yīng)的信號(hào)通路和生物學(xué)過(guò)程?；趍iRNA的研究進(jìn)一步豐富了豬肉質(zhì)相關(guān)信號(hào)的調(diào)控通路，也為遺傳改良和養(yǎng)豬生產(chǎn)提供了新見(jiàn)解和新思路。

3.3 lncRNA及circRNA等其他非編碼RNA轉(zhuǎn)錄組研究與應(yīng)用

lncRNA是一類長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的非編碼RNA，lncRNA占全部非編碼RNA的80%以上，與miRNA相比其數(shù)量龐大，序列保守性較低，曾一度被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄噪音[34]。circRNA即環(huán)狀RNA，是一種具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)且能穩(wěn)定存在于真核細(xì)胞中的特殊RNA，隨著研究的進(jìn)一步深入，lncRNA、circRNA等被證明具有豐富的生物學(xué)功能，即可調(diào)控表觀遺傳修飾也能影響RNA的可變剪接，對(duì)生物個(gè)體的正常生長(zhǎng)發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展均有重要作用。

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)豬研究團(tuán)隊(duì)利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)豬背最長(zhǎng)肌和腰大肌進(jìn)行測(cè)序分析，共鑒定出326個(gè)lncRNA和56個(gè)circRNA[35]。2017年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院以貴州小型豬的9種不同組織和3個(gè)發(fā)育階段的骨骼肌為材料鑒定得到5 934個(gè)circRNA，并系統(tǒng)分析了豬circRNA的時(shí)空表達(dá)差異和與其他物種的保守性，同時(shí)相關(guān)研究人員還構(gòu)建了農(nóng)業(yè)動(dòng)物首張circRNA的時(shí)空?qǐng)D譜和首個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（circRNA-miRNAmRNA多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)）[36]。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)以瘦肉型快速生長(zhǎng)的外種豬（長(zhǎng)白豬）和我國(guó)脂肪型地方豬種藍(lán)塘豬7 d肌肉為材料，鑒定得到4 360個(gè)circRNA，在藍(lán)塘豬中1 401個(gè)circRNA上調(diào)，2 959個(gè)下調(diào)[37]。此外，2018年7月中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院又以大白豬和萊蕪豬的脂肪為材料共鑒定得到29 763個(gè)脂肪組織中的circRNA，在脂肪型的萊蕪豬中70個(gè)circRNA上調(diào)，205個(gè)下調(diào)，相關(guān)研究結(jié)果進(jìn)一步為circRNA在豬肉質(zhì)改良研究提供了參考[38]。

除了lncRNA和circRNA還有小干擾RNA（siRNA）、piRNA、tRFs等非編碼RNA均被證明具有重要的生物學(xué)功能[39-40]，但由于相關(guān)技術(shù)手段還不夠成熟，研究成本較高，機(jī)制解析困難等因素，在豬肉質(zhì)研究中還鮮見(jiàn)報(bào)道，但隨著相關(guān)技術(shù)的升級(jí)，必將迎來(lái)其研究熱潮。

4 總結(jié)

隨著測(cè)序及相關(guān)分析技術(shù)的成熟，測(cè)序成本大幅下降，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的高通量?jī)?yōu)勢(shì)極大地促進(jìn)了相關(guān)研究的發(fā)展，在豬肉質(zhì)研究中也取得了一定的成果。但轉(zhuǎn)錄組的研究仍然存在一定的問(wèn)題，一方面測(cè)序所得的龐雜數(shù)據(jù)量通常需要大型分析儀器，而這些儀器的使用和維護(hù)往往非常專業(yè)和昂貴，通常實(shí)驗(yàn)人員需要同專業(yè)測(cè)序公司合作完成，由于專業(yè)背景差異的存在，在一定程度限制了實(shí)驗(yàn)方案的實(shí)施；另一方面研究人員面臨海量的測(cè)序結(jié)果如何進(jìn)行有效地處理和數(shù)據(jù)分析仍然是最大的挑戰(zhàn)。