高效液相色譜法與液質(zhì)聯(lián)用儀法同時測定15批次化妝品中5種限用防腐劑的比較研究

漆愛明毛麗秋，肖樹雄，余 燕

(1.廣東省藥品檢驗所，中國 廣州 510300；2.湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，中國 長沙 410081)

隨著人們生活水平的不斷提高，化妝品已成為日常生活中必不可少的消費品。在化妝品的生產(chǎn)、使用和保存過程中，為免受致病性和非致病性微生物污染，化妝品生產(chǎn)企業(yè)會添加各類防腐劑，這不僅可以延長保質(zhì)期和貨架期，還能確保產(chǎn)品的安全性。但研究表明，長期使用含高濃度防腐劑的化妝品會引起過敏性和接觸性皮炎等一系列副作用[1，2]，甚至致癌[3-5]。

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)中對我國允許使用的 51 項防腐劑進行了限量規(guī)定，收載了11個檢測方法，涵蓋19類24種化合物的測定[6]。用于化妝品中防腐劑的檢測方法有分光光度法、氣相色譜法[7-9]、液相色譜法[10-12]、氣相色譜-質(zhì)譜法[13,14]、液相色譜-質(zhì)譜法等。同時測定氯己定、芐氯酚、氯二甲酚、o-苯基苯酚和p-氯-m-甲酚5種限用防腐劑的方法未見報道。從近年化妝品檢驗的結(jié)果來看，我國化妝品中防腐劑的檢出率高，為加強對化妝品的衛(wèi)生監(jiān)督和日常管理，有必要研究化妝品中防腐劑含量的快速檢測方法。本文擬采用高效液相色譜法和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀法建立對化妝品中5 種防腐劑的快速測定方法，并分別用于檢測非蠟質(zhì)和蠟質(zhì)類兩類化妝品。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜：Agilent 1200高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器； 液質(zhì)聯(lián)用儀：Agilent Technologies 6430 Triple QUAD LC/MS； Mettler Toledo XS205 和 Sartorius CPA224S電子天平；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器； PB-10 pH計；LG10-2.4 A離心機；渦流振蕩器(美國IFA 公司)。芐氯酚(東京化成工業(yè)株式會社，C0161)，p-氯-m-甲酚(Acros Organics,BE,109480050)，氯己定(Dr. Ehrenstorfer GmbH，C 11310000)，o-苯基苯酚(Dr. Ehrenstorfer GmbH，C 16070000)，氯二甲酚(東京化成工業(yè)株式會社，C0161)標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于96%)；甲醇和四氫呋喃(色譜純，德國Merck 公司)，甲酸(色譜純)，乙酸銨(色譜純)，乙腈(色譜純)，實驗用水為一級水。

1.2 液相色譜和液質(zhì)測定條件

液相色譜測定條件：色譜柱: Kromasil 100-5 C18柱，250 mm×4.6 mm×5 μm；流動相：甲醇(C相)和0.025 mol/L磷酸二氫鈉水溶液(D相，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.8)，采用梯度洗脫，洗脫程序：0～10 min，55%～65%(C)，45%～35%(D)；10～15 min，65%～80%(C)，35%～20%(D)；15～20 min，80%～90%(C)，20%～10%(D)；20～22 min，90%～55%(C)，10%～45%(D)；22～26 min，55～55%(C)，45～45%(D)。流速1.0 mL/min; 柱溫: 25 ℃; 檢測器掃描范圍210～400 nm; 進樣量10 μL; 采用外標(biāo)法定量。

氯己定液質(zhì)測定條件：色譜柱：資生堂SPOLAR C18，250 mm×4.6 mm×5 μm；流動相：0.1%甲酸甲醇，0.1%甲酸水溶液(體積比80∶20)，等度洗脫，流速：0.2 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：1 μL；離子化模式：電噴霧正離子化(ESI+)；霧化氣：氮氣，241 379.3 Pa(35 psi)；干燥氣：氮氣，流速10 L/mim，溫度350 ℃；噴霧電壓：4 kV；碰撞氣：氮氣；檢測模式：MRM模式，檢測條件見表1。

p-氯-m-甲酚、o-苯基苯酚、氯二甲酚、芐氯酚液質(zhì)聯(lián)用測定條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18，2.1×100 mm×1.8 μm；柱溫：25 ℃；進樣量：1 μL；流動相：乙腈(B相)和0.2%乙酸銨、0.2%乙酸混合液(D相)；梯度洗脫，流速：0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～4 min，60%～90%(B),40%～10%(D)；4～5 min，90%～90%(B)，10%～10%(D)；5～7 min，90%～60% (B)，10%～40%(D)。離子化模式：電噴霧負離子化(ESI-)；霧化氣：氮氣，241 379.3 Pa(35 psi)；干燥氣：氮氣，流速12 L/mim，溫度350 ℃；噴霧電壓：4 kV；檢測模式：MRM模式，檢測條件如表2。

表2 多反應(yīng)監(jiān)測模式下p-氯-m-甲酚、o-苯基苯酚、氯二甲酚、芐氯酚的質(zhì)譜分析參數(shù)

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制

用甲醇(色譜純)作溶劑，稱取適量的各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成5種防腐劑原混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，見表3。

表3 各物質(zhì)貯備溶液濃度及標(biāo)準(zhǔn)系列濃度 單位：mg·L-1

1.4 樣品來源及處理

在各大超市隨機購買15種化妝品樣品，按種類分為:非蠟質(zhì)(液體類、粉類、膏霜類)和蠟質(zhì)類，按不同類型分類統(tǒng)計分析。

1.4.1 不含蠟質(zhì)的化妝品如護膚類、香波、粉等 準(zhǔn)確稱取試樣約0.4 g(精確至1 mg)，置于10 mL具塞比色管中，加甲醇(色譜純)約5 mL，在漩渦混勻器上振蕩1 min，加入飽和氯化鈉溶液2 mL，用甲醇(色譜純)稀釋至10 mL，混勻，超聲提取15 min，再以8 000 r/min離心15 min，過0.45 μm濾膜(作為液相待測液)，取過濾液1 mL于10 mL比色管中，用甲醇定容至刻度，過0.22 μm濾膜作為液質(zhì)待測液。

1.4.2 含蠟質(zhì)的化妝品如唇膏、口紅等 準(zhǔn)確稱取試樣約0.4 g(精確至1 mg)，置10 mL具塞比色管中，加四氫呋喃(色譜純)1 mL，在漩渦混勻器上振蕩1 min，加飽和氯化鈉溶液1 mL，用甲醇(色譜純)稀釋至10 mL，混勻，超聲提取15 min，再以8 000 r/min離心15 min，過0.45 μm濾膜(作為液相待測液)，取過濾液1 mL于10 mL比色管中，用甲醇定容至刻度，過0.22 μm濾膜作為液質(zhì)聯(lián)用儀待測液。

若提取液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后濾液渾濁，則先將提取液用濾紙過濾后再經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用儀法線性范圍和回歸方程的比較

在1.2測定條件和1.4提取條件下，對該方法的線性范圍進行驗證，結(jié)果見表4。參考限度范圍要求，配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到目標(biāo)化合物的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)，5 種防腐劑在其各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，液相方法相關(guān)系數(shù)均大于 0. 999；液質(zhì)方法相關(guān)系數(shù)均大于 0. 990。

表4 5種防腐劑的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(R2)

2.2 液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用儀法檢出限及定量限的比較

在最優(yōu)測定條件和提取條件下，對檢出限(LOD)和定量限(LOQ)進行測定，結(jié)果見表5。采用樣品空白基質(zhì)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3倍信噪比和10倍信噪比確定兩種方法的檢出限和定量限。關(guān)于5種防腐劑的檢出限液相色譜檢測法和液質(zhì)聯(lián)用儀檢測法分別為 0.84～1.96 ng和0.004～0.010 ng；定量限分別為2.52～9.81 ng和0.01～0.03 ng，由表5可知，5種防腐劑的檢出限、定量限、檢出質(zhì)量分數(shù)、定量質(zhì)量分數(shù)，液相色譜法分別比液質(zhì)聯(lián)用儀法高。在測定氯己定、芐氯酚、氯二甲酚、o-苯基苯酚和p-氯-m-甲酚5種防腐劑的檢測過程中，液質(zhì)聯(lián)用儀法儀器的靈敏性優(yōu)勢凸顯，但從性價比和實驗儀器的普及性上考慮，液相色譜法的適用普及性優(yōu)于液質(zhì)聯(lián)用儀法。

表5 5種防腐劑的檢出限、定量限、檢出質(zhì)量分數(shù)、定量質(zhì)量分數(shù)

2.3 液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用儀法精密度的比較

液相色譜法分別平行測定高濃度(標(biāo)準(zhǔn)系列溶液2的濃度)6次作為本實驗的精密度；液質(zhì)聯(lián)用儀法分別平行測定中濃度(標(biāo)準(zhǔn)系列溶液3的濃度)6次作為本實驗的精密度，由表6可知，液相高濃度對應(yīng)的組分精密度的相對偏差為0.4%～1.1%，液質(zhì)聯(lián)用儀對應(yīng)組分精密度的相對偏差為1.0%～2.8%。液相色譜法的精密度的相對偏差比液質(zhì)聯(lián)用儀法的精密度的相對偏差小，實驗的隨機誤差液相色譜法比液質(zhì)聯(lián)用儀法小，實驗的再現(xiàn)性液相色譜法比液質(zhì)聯(lián)用儀法好。

2.4 液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用儀法加標(biāo)回收實驗和實驗的重復(fù)性比較

分別對2種基質(zhì)(非蠟質(zhì)類和蠟質(zhì)類)同一基質(zhì)樣品分別進行5種(p-氯-m-甲酚、芐氯酚、氯己定、o-苯基苯酚、氯二甲酚)成分高低2個濃度的加標(biāo)回收實驗,6份回收率測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差作為各不同化妝品基質(zhì)中含高、低濃度待測成分時的測定重復(fù)性(見表7)。液相色譜法：加入量為高濃度時，5種成分的回收率范圍為103.7%～113.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～2.5%；加入量為低濃度時，5種成分的回收率為108.7%～119.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～3.4%。液質(zhì)聯(lián)用儀法：加入量為高濃度時，5種成分的回收率為77.6%～117.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～4.7%；加入量為低濃度時，5種成分的回收率為71.2%～114.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～5.2%。液相色譜法的回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差比液質(zhì)聯(lián)用儀法的回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值低，由實驗數(shù)據(jù)可知，液相色譜法比液質(zhì)聯(lián)用儀法系統(tǒng)誤差小，重復(fù)性高，實驗的可靠性好。

表6 5種防腐劑的精密度 (n=6)

表7 2種基質(zhì)(非蠟狀和蠟質(zhì)類)的加標(biāo)回收率及重復(fù)性 (n=6)

續(xù)表

2.5 液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用儀法檢測樣品

應(yīng)用所建立液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用儀法，分別對實際樣品進行了分析，結(jié)果如表8所示。

表8 實際樣品中5種防腐劑的檢測結(jié)果

“—”5種組分均未檢出。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜法與液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀法分別對2種基質(zhì)類型15批次化妝品的5種限用防腐劑氯己定、芐氯酚、氯二甲酚、o-苯基苯酚和p-氯-m-甲酚的測定方法。兩種方法操作簡便，分離效果都好，實驗數(shù)據(jù)表明，高效液相色譜法比液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀法實驗的重現(xiàn)性和可靠性，但選擇性和靈敏度稍差。運用建立的兩種方法分別對實際樣品進行了分析檢測，兩種方法對實際樣品5#、6#、8#的氯二甲酚和o-苯基苯酚的檢測結(jié)果非常吻合，但對實際樣品7#的醋酸氯己定的測定，結(jié)果相差較大(測定結(jié)果見表8)，原因是液質(zhì)聯(lián)用儀法在加標(biāo)回收中醋酸氯己定回收偏低，實驗的重復(fù)性較差。比較兩種方法的實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果表明液質(zhì)聯(lián)用儀具有高的選擇性和靈敏度，更適合用于5種限用防腐劑的定性分析；而高效液相色譜法具有好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，更適合用于5種限用防腐劑的定量分析。