廣西與云南兩地香茅草含量測定及清除自由基能力的研究

梁 芳，葉繪晟，龔志強*，楊力龍，蒙田秀

(廣西中醫(yī)藥大學(xué) a.賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，中國 南寧 530222；b.第一附屬醫(yī)院，中國 南寧 530023)

香茅草為禾本科香茅屬植物香茅[Cymbopogoncitratus(DC.) Stapf]的全草，又名檸檬草、檸檬香茅等，其味甘、辛、性溫，具有祛風(fēng)通絡(luò)、溫中止痛等功效[1]，主治風(fēng)寒感冒、脘腹冷痛和胃通氣[2]。主要分布于熱帶亞熱帶地區(qū)，在印度、菲律賓、馬來西亞等東南亞國家有悠久的栽培歷史，我國主產(chǎn)于廣東、臺灣、廣西、貴州、云南等省區(qū)，是非常重要的草本香料[3，4]。

目前，對香茅草的文獻研究主要集中在揮發(fā)油化學(xué)成分分析[5-9]，含量測定也以揮發(fā)油為主[10-12]，鮮有對香茅全草的含量測定報道[13]。香茅草揮發(fā)油主要含有檸檬醛、月桂烯和香葉醇等。現(xiàn)代藥理研究表明香茅草具有抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤抑制、鎮(zhèn)痛抗炎等[14-18]多種藥理活性。本文采用HPLC法對香茅草主要成分檸檬醛、香葉醇進行含量測定，并采用DPPH·法測定廣西、云南兩地香茅草清除自由基的能力，為香茅草的資源開發(fā)利用及質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 儀器和試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀和DAD檢測器(美國安捷倫科技有限公司)；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；XS105DU電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；LG16-W臺式高速離心機(北京京立離心機有限公司)；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋 (金壇市醫(yī)療儀器廠)； AFZ-1001U艾科浦超純水系統(tǒng)(重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)；乙腈(批號：13025006，色譜純，美國天地試劑公司)；甲醇(批號：13026008，色譜純，美國天地試劑公司)，娃哈哈純凈水，其他試劑為分析純；檸檬醛對照品由Heidrich博士提供，含量為99.0%(批號：90921)，香葉醇對照品(批號：1354702，Sigma公司，含量測定用)，香茅草藥材采自不同地區(qū)(見表1)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院謝麗莎主任藥師鑒定為禾本科植物香茅Cymbopogoncitratus(DC.) Stapf的全草。

表1 香茅草藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 檸檬醛、香葉醇的HPLC含量測定

2.1.1 色譜條件 Xtimate C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)；流動相：0.5%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫(0→13 min，B：10%→35%)，流速0.8 mL·min-1，柱溫：30 ℃；檢測波長：226 nm；進樣量：10 μL。對照品及樣品色譜圖見圖1，理論塔板數(shù)按檸檬醛峰計算不低于4 000，分離度大于1.5。

圖1 對照品(A)與供試品(B)溶液的HPLC色譜圖

2.1.2 對照品溶液制備 分別精密稱取檸檬醛、香葉醇對照品5.38及2.06 mg，置于25 mL容量瓶中，用適量甲醇溶解并稀釋至刻度，制成檸檬醛、香葉醇質(zhì)量濃度分別為0.215 2及0.082 4 g·L-1的混合對照品儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取香茅草藥材粉末約2 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，靜置30 min，超聲提取30 min，過濾，濾液60 ℃水浴蒸干，用適量的甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，高速離心機(10 000 r·min-1)離心10 min，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對照品溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得系列對照品溶液。以進樣質(zhì)量濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進行回歸計算，結(jié)果檸檬醛、香葉醇的回歸方程分別為Y=24.637X-434.46(R=0.999 1)和Y=6.273 3X+26.926(R=0.999 0)，表明檸檬醛、香葉醇進樣質(zhì)量濃度分別在21.52～215.2及8.24～82.4 mg·L-1范圍呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗 精密量取檸檬醛、香葉醇混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，分別測定峰面積，結(jié)果檸檬醛、香葉醇峰面積RSD值分別為1.73%及1.03%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同一供試品溶液(S2號廣西邕寧)，室溫下放置，分別于0，2，4，6，8，12 h測定，結(jié)果檸檬醛、香葉醇峰面積的RSD值分別為1.91%及1.21%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗 取同一批次(S2號廣西邕寧)香茅草藥材6份，每份約2 g，精密稱定，按“2.1.3”供試品溶液制備項下方法操作，分別測定，計算檸檬醛、香葉醇平均含量分別為1.335及0.202 mg·g-1，其RSD值分別為1.32%及0.98%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 回收率試驗 取已知含量的香茅草藥材(S2號廣西邕寧)9份，每份約2 g，精密稱定，分別加入檸檬醛、香葉醇對照品溶液適量，按照“2.1.3”供試品溶液制備項下方法操作，分別測定，計算檸檬醛、香葉醇加樣回收率分別為99.34%及98.56%，RSD值分別為0.48%及0.69%，結(jié)果見表2，表明該方法的回收率良好。

表2 加樣回收率實驗結(jié)果(n=9)

2.1.9 樣品測定 分別取10批不同產(chǎn)地的香茅草樣品約2 g，精密稱定，按“2.1.3”供試品溶液制備項下方法操作，在上述色譜條件下進行分析。測定結(jié)果見表3，對照品及樣品色譜圖見圖1。

表3 不同產(chǎn)地香茅草檸檬醛、香葉醇含量測定結(jié)果(n=3)

2.2 不同產(chǎn)地香茅草清除自由基作用的研究

2.2.1 供試品溶液制備 分別稱取香茅草藥材2 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，靜置30 min，超聲提取30 min，過濾，濾液高速離心機(10 000 r·min-1)離心10 min，取上清液，60 ℃水浴蒸干，用適量的甲醇定容至25 mL容量瓶中，制成供試品溶液(1 mL相當(dāng)于原藥材0.08 g)。

2.2.2 清除自由基作用的研究 采用(DPPH·自由基法)[19，20]，DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，乙醇溶液呈紫色，在515 nm處有一強吸收峰。在相同體積的反應(yīng)體系(5 mL 95%乙醇，5 mL 0.2 mmol·L-1DPPH·，pH=8.2)中加入不同濃度的香茅草供試液(0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 g·L-1)，藥液濃度為0時即為空白對照組，并以純水為比色時調(diào)零的參比，在25 ℃水浴反應(yīng)30 min后于515 nm處測定吸光度，平行樣3個，測定完求平均值，計算自由基清除率和IC50值。

自由基清除率=[1-A1/A0] ×100%。

式中A0為未加試樣的DPPH·在515 nm處的吸光度，A1為供試品溶液與DPPH·反應(yīng)后的515 nm處的吸光度。清除50%自由基時樣品濃度(IC50值)的計算，繪制DPPH·自由基清除率對供試品溶液濃度曲線，通過線性回歸分析可以得到回歸方程，根據(jù)回歸方程可計算出DPPH·自由基清除率為50%時所需的樣品濃度，即IC50值。

2.2.3 不同產(chǎn)地香茅草清除DPPH·自由基的能力 按“2.2.2”方法測定不同產(chǎn)地香茅草供試液對DPPH·自由基清除率如圖2，根據(jù)萃取組分對DPPH·自由基清除率擬合出回歸方程與所得IC50值，如表4所示。由圖2可以看出，各產(chǎn)地香茅草甲醇提取物對DPPH·均具有一定清除作用，在一定濃度范圍內(nèi)清除能力與濃度呈正相關(guān)，由表4可以得出，不同產(chǎn)地香茅草醇提物均有清除自由基活性，不同產(chǎn)地香茅草醇提物的IC50值(g·L-1)各有差異，但是差異不大，其中最小為廣西武鳴產(chǎn)香茅草，最大為云南文山產(chǎn)香茅草。

表4 不同產(chǎn)地香茅草對DPPH·的清除活性的回歸方程和IC50值(x±s)

圖2 不同產(chǎn)地香茅草醇提物對DPPH·的清除作用

3 結(jié)論

(1)香茅草含有大量的揮發(fā)性成分，國內(nèi)外文獻主要以研究香茅草揮發(fā)油成分為主，對香茅草的含量測定也以氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用較多，文獻表明檸檬醛、香葉醇均為香茅草揮發(fā)性成分中含量較高的成分，檸檬醛具有抗真菌、抗氧化、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等[21]多種藥理活性，香葉醇可用于平喘和抗過敏[22]，選擇檸檬醛和香葉醇作為香茅草質(zhì)量控制的指標(biāo)成分具有很好的代表性。

(2)HPLC含量測定結(jié)果表明，各產(chǎn)地香茅草中檸檬醛含量均較高，檸檬醛具有順反兩種異構(gòu)體，反式是香葉醛(α-檸檬醛)，順式為橙花醛(β-檸檬醛)，參考文獻[23，24]方法，優(yōu)化流動相梯度洗脫，香葉醛和橙花醛在 HPLC色譜圖譜中分離度良好，其中檸檬醛、香葉醇含量差異均不明顯，樣品采收的時間、存儲方式對檬醛、香葉醇含量均有影響。

(3)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)是一種氮原子橋上帶有不配對單電子的穩(wěn)定的自由基，在515 nm有最大吸收[25]，目前，DPPH·自由基法是國際上較為公認的抗氧化活性測定方法，可簡便、快捷地開展天然物質(zhì)的抗氧化活性評價[26]。本實驗以體外DPPH·法考察不同產(chǎn)地香茅草甲醇提取物清除自由基的活性。結(jié)果表明，各產(chǎn)地香茅草醇提物都具有清除DPPH·自由基的能力，且清除能力呈明顯的量效關(guān)系，與文獻[27，28]報道的香茅油及揮發(fā)性成分清除自由基活性一致。其中廣西5個產(chǎn)地香茅草醇提物相對云南2個產(chǎn)地的香茅草醇提物清除DPPH·自由基的能力較強，原因可能是云南2個產(chǎn)地的香茅草均為采購的干草，具體采收時間不確定，經(jīng)過一段時間的貯存對其揮發(fā)性成分和清除DPPH·自由基的能力都有一定影響，而廣西武鳴、邕寧、貴港、南寧四地的均為鮮品采收陰干處理，廣西靖西、田林兩地香茅草購買的是干品，對其清除DPPH·自由基的能力也有一定的影響。

(4)香茅草清除自由基能力主要為含有雙鍵的不飽和萜類揮發(fā)性成分，云、桂兩地香茅草中檸檬醛、香葉醇的含量與其清除DPPH·自由基的能力無明顯線性相關(guān)，表明香茅草的抗氧化能力還依賴其余多種萜類及萜烯類成分的協(xié)同作用。