高效液相色譜法定量分析奧曲肽

向童欣，黃永鵬，唐慧，鐘輝，陳博

(軍事科學(xué)院防化研究院，北京 102205)

奧曲肽(Octreotide，OCT)是由八個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀多肽化合物，化學(xué)名稱為D-苯丙胺酰-L-半胱氨酰-L-苯丙胺酰-D-色氨酰-L-賴氨酰-L-蘇氨酰-L-半胱氨酰-L-蘇氨醇(2 →7)環(huán)二硫化物，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。OCT 是首例獲批上市的人工合成生長(zhǎng)抑素類藥物，與天然生長(zhǎng)抑素(Somatostatin, SST)相比，具有更強(qiáng)的作用效果與更長(zhǎng)的半衰期［1］，對(duì)腺體分泌(生長(zhǎng)激素、促甲狀腺激素、胰島素、胰高血糖素、降鈣素等)、內(nèi)臟血流、平滑肌收縮、細(xì)胞增殖、腫瘤增長(zhǎng)等具有抑制作用，是目前臨床上治療肢端肥大癥的首選藥物［2］，同時(shí)在治療急慢性胰腺炎［3–4］、上消化道出血［5–6］、消化道內(nèi)分泌／非內(nèi)分泌性腫瘤［7］、肺癌［8］等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。近年來，OCT 原料藥合成、新劑型開發(fā)、藥理學(xué)等研究備受關(guān)注，而上述研究均需要以O(shè)CT 的定量分析作為依據(jù)。

圖1 奧曲肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

目前OCT 定量分析方法主要有高效液相色譜(HPLC)法［9–14］、高效液相色譜–質(zhì)譜(HPLC–MS)法［15–16］、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法［17］、放射性免疫分析(RIA)法［18］、共振瑞利散射(RRS)法［19］等。其中，HPLC 法設(shè)備費(fèi)用相對(duì)較低，操作較簡(jiǎn)單，在OCT 原料藥及其制劑純度與雜質(zhì)分析、載藥量、穩(wěn)定性、質(zhì)量一致性、體外溶出度等評(píng)價(jià)中應(yīng)用最為廣泛。目前文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于奧曲肽的HPLC定量分析方法主要是參照《中國(guó)藥典》中醋酸奧曲肽(Octreotide Acetate，OA)測(cè)定含量的方法［20］，即采用不同濃度的四甲基氫氧化銨水溶液和不同體積的乙腈分別作為流動(dòng)相A 和流動(dòng)相B，然后進(jìn)行梯度洗脫。該方法存在流動(dòng)相配制繁瑣、分析時(shí)間長(zhǎng)(大于30 min)、壓力不穩(wěn)定、基線噪聲和漂移大影響分析精密度和穩(wěn)定性、色譜柱需要再生處理、磷酸鹽容易析出損壞色譜柱與柱塞泵等不足。筆者采用乙腈–固定濃度的高氯酸水溶液體系等度洗脫，分別考察了流動(dòng)相pH 值和配比對(duì)OCT 色譜行為的影響，優(yōu)化相關(guān)色譜條件，建立了新的HPLC 定量分析OCT 的方法，該方法操作簡(jiǎn)便，測(cè)定快速，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于OCT 原料藥與制劑的分析評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260 型，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

電子分析天平：XP105DR 型，上海梅特勒–托利多儀器有限公司；

酸度計(jì)：Sevenmulti 型，上海梅特勒–托利多儀器有限公司；

奧曲肽標(biāo)準(zhǔn)品：純度為99.1%，批號(hào)為2018053003–1，浙江湃肽生物有限公司；

奧曲肽原料藥樣品：實(shí)驗(yàn)室自制；

乙腈：色譜純，美國(guó)默克公司；

高氯酸：分析純，北京百靈威公司；

實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：Eclipse plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；流動(dòng)相：乙腈–0.25%高氯酸水溶液(體積比為30∶70)；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流量：1 mL／min；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.3 溶液配制

OCT 儲(chǔ)備溶液：219.0 μg／mL，精確稱取21.9 mg 奧曲肽標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL 容量瓶中，加入適量純水溶解并定容至標(biāo)線，搖勻。

系列OCT 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精密移取0.2，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，10.0 mL 的OCT 儲(chǔ) 備 溶 液 至10 mL 容量瓶中，加入純水稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻，配制成奧曲肽的質(zhì)量濃度分別為4.38，10.95，21.90，43.80，87.60，131.40，219.00 μg／mL 的 系 列OCT 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品處理

精確稱取20 mg 奧曲肽原料藥樣品，置于250 mL 容量瓶中，加入適量純水溶解，超聲5 min，冷卻后用純水定容至標(biāo)線，搖勻，靜置后用0.45 μm 微孔濾膜過濾，濾液即為待測(cè)樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相pH 值確定

在乙腈–高氯酸水溶液體積比為30∶70 條件下，通過改變高氯酸水溶液中高氯酸含量，配制pH 0.6 至pH 6.4 的系列流動(dòng)相體系，考察流動(dòng)相pH 值對(duì)OCT 色譜行為的影響，結(jié)果見表1。

表1 流動(dòng)相pH 值對(duì)奧曲肽色譜行為的影響

由表1 可知，當(dāng)流動(dòng)相pH ≥2.24 時(shí)，OCT 主峰與溶劑峰不能完全分離；當(dāng)流動(dòng)性pH 值≤1.94時(shí)，OCT 主峰與溶劑峰完全分離，隨流動(dòng)相pH 值的減小，OCT 的保留時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，色譜峰的對(duì)稱性和峰寬逐漸增加，峰高逐漸減小，峰面積無顯著差異。當(dāng)高氯酸含量為0.25%，即流動(dòng)相體系的pH值為1.7 時(shí)，pH 對(duì)OCT 色譜行為影響較小，OCT主峰保留時(shí)間小于9 min，且峰形尖銳、對(duì)稱性良好。綜合保留時(shí)間、峰形對(duì)稱性、峰高、峰寬等因素選擇在高氯酸水溶液中加入0.25%高氯酸，即流動(dòng)相pH值為1.7。

2.2 流動(dòng)相配比對(duì)選擇

分別以體積比為10∶90，20∶80，25∶75，30∶70，35∶65，40∶60 的乙腈–0.25%高氯酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)樣分析，考察不同流動(dòng)相配比對(duì)OCT 色譜行為的影響，上述流動(dòng)相體系的pH 值均在1.70±0.05之間，在此范圍內(nèi)pH 對(duì)OCT 色譜行為影響較小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示。

圖2 流動(dòng)相中乙腈體積分?jǐn)?shù)對(duì)奧曲肽保留時(shí)間的影響

由圖2 可以看出，隨著流動(dòng)相體系中乙腈體積分?jǐn)?shù)的增大，OCT 的保留時(shí)間隨之減小。當(dāng)乙腈與0.25%高氯酸水溶液體積比為10∶90 和20∶80 時(shí)，流動(dòng)相洗脫能力不夠，30 min 內(nèi)未出峰。當(dāng)二者的體 積 比 為25∶75，30∶70，35∶65 時(shí)，OCT 主 峰 與溶劑峰完全分離，保留時(shí)間分別為14.45，8.92，4.56 min，其中，當(dāng)二者的體積比為30∶70 時(shí)，色譜峰峰形尖銳，且對(duì)稱性最好。當(dāng)二者的體積比為40∶60時(shí)，OCT 主峰與溶劑峰不能完全分離。綜合考慮，選擇體積比為30∶70 的乙腈– 0.25%高氯酸水溶液作為流動(dòng)相，OCT 的保留時(shí)間為8.92 min，色譜圖如圖3 所示。

圖3 OCT 的色譜圖

2.3 線性方程與檢測(cè)限

將系列OCT 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用0.45 μm 微孔濾膜過濾，在1.2 色譜條件下分別進(jìn)行測(cè)定，每一濃度的OCT 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液重復(fù)進(jìn)樣2 次，以兩次測(cè)定值的平均值作為色譜峰面積的測(cè)定結(jié)果。以O(shè)CT 的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算得線性方程為Y=11.579X–31.461，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。表明OCT的質(zhì)量濃度在4.38～219 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

將質(zhì)量濃度為4.38 μg／mL 的OCT 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液逐步稀釋，在1.2 色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算相應(yīng)色譜峰高和平均基線噪音之比。以3 倍信噪比(S／N=3)時(shí)的濃度為最低檢測(cè)限濃度，以10 倍信噪比(S／N=10)時(shí)的濃度為最低定量限濃度，將檢測(cè)限濃度乘以進(jìn)樣體積5 μL，得最低定性與定量檢測(cè)限分別為1.10，2.19 ng。

2.4 精密度試驗(yàn)

按1.4 方法分別對(duì)5 份奧曲肽原料藥樣品進(jìn)行處理，得到5 組不同質(zhì)量濃度的OCT 樣品溶液，在1.2 色譜條件下分別連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5 次，結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，5 組不同質(zhì)量濃度的OCT 樣品測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.26%～0.46%，表明該方法精密度良好。

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

分別將含有180，300，600 μg 奧曲肽的溶液樣品添加到空白樣品基質(zhì)(純水)中，定容配制成低、中、高3 種加標(biāo)濃度的樣品，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后，在1.2 色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度樣品平行測(cè)定3 次，根據(jù)色譜峰面積及線性方程計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。由表3 可知，樣品加標(biāo)回收率為97.41%～100.26%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選取質(zhì)量濃度分別為10.95，43.80，219.00 μg／mL 的OCT 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.2 色譜條件下，分別通過在一天內(nèi)每隔2 h 測(cè)定一次、共計(jì)5 次和每天測(cè)定一次、連續(xù)測(cè)定5 天的方式，考察分析方法的日內(nèi)與日間穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。日內(nèi)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.32%～0.37%，日間測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.47%～1.31%.表明該方法具有較高的穩(wěn)定性。

表4 日內(nèi)與日間穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

按1.4 方法分別對(duì)實(shí)驗(yàn)室制備的5 個(gè)批次的奧曲肽原料藥樣品進(jìn)行處理，在1.2 色譜條件下，對(duì)每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取平均值作為測(cè)定結(jié)果，根據(jù)色譜峰面積及線性方程計(jì)算得5 個(gè)批次原料藥樣品中奧曲肽含量分別為98.3%，98.2%，98.0%，98.7%，98.2%。表明所制備的原料藥具有較高的純度與良好的批次穩(wěn)定性。

3 結(jié)語

建立了以乙腈–高氯酸水溶液為流動(dòng)相體系的奧曲肽等度洗脫HPLC 定量分析方法，著重考察了流動(dòng)相pH 值及配比對(duì)OCT 色譜行為的影響，與常規(guī)藥典方法相比，避免了含有磷酸的復(fù)雜流動(dòng)相體系以及梯度洗脫存在的不足。該方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于OCT 原料藥與制劑的分析評(píng)價(jià)，以促進(jìn)OCT 的藥學(xué)研究與臨床應(yīng)用。