基于線粒體COI基因的馬鲅科魚類DNA條形碼研究

王業(yè)磷，章 群，鄧春興，徐 示，裴麗梅，黃志基，羅 純

（暨南大學(xué)生態(tài)系，廣州 510632）

馬鲅科（Polynemidae）隸屬于硬骨魚綱（Osteichthyes）輻鰭亞綱 （Subclass Neopterygii）鱸形目（Perciformes），廣泛分布于溫帶、亞熱帶和熱帶近岸海域以及淡水河流的入?？?。馬鲅科魚類如六絲多指馬鲅（Polydactylussexfilis），肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高；還有一些種類如長(zhǎng)指馬鲅（Polynemusparadiseus），形態(tài)優(yōu)美、有較強(qiáng)的觀賞性，是珍稀名貴的經(jīng)濟(jì)魚類［1-2］。全世界已知馬鲅科魚類共有8屬43種，其中中國(guó)有3屬7種［3-5］，分別為四指馬鲅屬（Eleutheronema）的四指馬鲅（E.tetradactylus）和多鱗四指馬鲅（E.rhadinum），多指馬鲅屬（Polydactylus）的五指多指馬鲅（P.plebejus）、黑斑多指馬鲅（P.sextarius）、六絲多指馬鲅和小口多指馬鲅（P.microstomus），以及絲指馬鲅屬（Filimanus）的西氏絲指馬鲅（F.sealei）。在過度捕撈和海洋環(huán)境日益惡化的大背景下，馬鲅科魚類的漁業(yè)資源在不斷減少，特別是市場(chǎng)需求大、價(jià)格昂貴的四指馬鲅等具高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的馬鲅科魚類，對(duì)于該科魚類的多樣性保護(hù)十分不利，亟需開展馬鲅科魚類種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)利用研究［2］。

準(zhǔn)確的物種鑒定是種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)利用的前提。目前，MOTOMURA［1］對(duì)馬鲅科魚類基于形態(tài)學(xué)的再描述是該科魚類分類的主要依據(jù)；葉振江等［6］對(duì)四指馬鲅、五指多指馬鲅和六絲多指馬鲅以及常有民等［7］對(duì)多鱗四指馬鲅的耳石形態(tài)特征的觀察，也為該科魚類的分類提供了部分依據(jù)。但由于馬鲅科一些種類外部形態(tài)相似度高、分類特征不顯著，極易混淆；另外顏色褪變或保存不完整以及不同發(fā)育階段的形態(tài)變化，也給鑒定帶來較大困難。四指馬鲅屬魚類雖是名貴的海產(chǎn)魚類，但早期的研究資料認(rèn)為中國(guó)沿海分布只有四指馬鲅一種，中國(guó)沒有多鱗四指馬鲅的記錄［3-4］。在多鱗四指馬鲅作為一個(gè)獨(dú)立有效種確立后，有研究［8-9］認(rèn)為原先在中國(guó)分布的四指馬鲅全部為多鱗四指馬鲅，而四指馬鲅在中國(guó)并無(wú)分布。四指馬鲅與多鱗四指馬鲅形態(tài)區(qū)分主要是胸鰭顏色的不同，但由于顏色差異并不穩(wěn)定以及存在著連續(xù)變化的可能，常常被誤認(rèn)為同一個(gè)種。DNA條形碼技術(shù)［10-11］只需極少量的樣品，通過一段標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列的比較分析就可以對(duì)物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，從而避免了表型性狀鑒定物種存在的不足。已有研究表明，線粒體COI基因5′端一段長(zhǎng)度約652 bp的序列作為物種鑒定 的 DNA 條 形 碼 在 魚 類［12］、鳥 類［13］和 昆蟲［14-15］等動(dòng)物上都表現(xiàn)出了高可靠性和便利性，且在解決同種異名、異種同名和發(fā)現(xiàn)隱存種等方面有著突出優(yōu)勢(shì)，已成為了動(dòng)物界首選DNA條形碼標(biāo)記［16］。

目前，中國(guó)馬鲅科魚類DNA條形碼的研究?jī)H見有嚴(yán)安琪等［17］對(duì)浙江海域四指馬鲅和黑斑多指馬鲅以及鄧春興［18］對(duì)中國(guó)近海四指馬鲅屬等少數(shù)物種局部地區(qū)的研究。本研究測(cè)定了在中國(guó)黃海、東海和南海7省10個(gè)地點(diǎn)采集的3屬5種33條標(biāo)本的線粒體COI序列，結(jié)合GenBank中下載的5屬16種的COI序列，進(jìn)行中國(guó)馬鲅科魚類DNA條形碼研究，旨在明確該科魚類的分類地位，為中國(guó)馬鲅科魚類種質(zhì)資源的保護(hù)和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與分子實(shí)驗(yàn)

依據(jù) MOTOMURA［1］工作和《南海魚類檢索》［19］等相關(guān)資料對(duì)本實(shí)驗(yàn)室多年保存的馬鲅科魚類進(jìn)行鑒定分類，提取保存于95%的乙醇中的中國(guó)馬鲅科魚類肌肉組織用于測(cè)定COI序列。本研究測(cè)序標(biāo)本及GenBank下載序列來源詳見表1。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增與測(cè)序

采用酚-氯仿抽提法［20］提取總 DNA后，于-20℃中保存。使用通用引物［12］FishF1：5′TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC3′，F(xiàn)ishR1：5′TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA3′對(duì)線粒體COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為30μL：15μL mix，1μL FishF1，1μL FishR1，12μL ddH2O，1μL DNA。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，54℃退火40 s，72℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；最后再72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

經(jīng)BioEdit v 7.0.9對(duì)原始序列峰圖人工校對(duì)，與從GenBank下載的COI序列聯(lián)并后進(jìn)行比對(duì)。用MEGA X計(jì)算堿基組成、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)換/顛換值；基于 K2P（Kimura2-parameter）模型，經(jīng)1 000次重復(fù)抽樣檢測(cè)置信度構(gòu)建鄰接（neighbor-joining）樹；分別計(jì)算種內(nèi)種間和分支內(nèi)分支間的遺傳距離。在 https：//bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abgd/abgdweb.html網(wǎng)站上利用 ABGD（automatic barcode gap discovery）法進(jìn)行假設(shè)種分析［21］。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鲅科魚類COI基因序列分析

在馬鲅科魚類6屬20種74個(gè)體平均長(zhǎng)度為648 bp（620 bp～652 bp）的COI基因序列中，沒有堿基插入或缺失，保守位點(diǎn)394個(gè)，變異位點(diǎn)258個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)251個(gè)。T、C、A、G平均含量分別為：28.9%、29.3%、22.3%、19.5%，A+T含量（51.2%）高于G+C含量（48.8%），有一定的偏倚性，與其他硬骨魚類COI序列堿基特征基本一致［12］。轉(zhuǎn)換與顛換比3.37，說明序列突變沒有達(dá)到飽和，適用于系統(tǒng)發(fā)育分析［22］。

2.2 種內(nèi)與種間遺傳距離

基于K2P模型計(jì)算出馬鲅科20種魚類的種內(nèi)遺傳距離為0～11.9%，平均遺傳距離為0.9%；種間遺傳距離為0.1%～27.4%，平均遺傳距離為19.6%；種間平均遺傳距離是種內(nèi)平均遺傳距離的22倍，符合HEBERT［10-11］提出的物種鑒別“十倍法則”，即種間遺傳距離遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離的10倍以上。在DNA條形碼研究中，除腔腸動(dòng)物門（Cnidaria）外，2%是絕大部分物種劃分的參考值［10-11］，即種內(nèi)遺傳距離一般小于2%，種間一般大于2%。六絲多指馬鲅種內(nèi)遺傳距離為11.9%，遠(yuǎn)大于2%；多鱗四指馬鲅種內(nèi)遺傳距離為2.3%；其余種類均遠(yuǎn)小于2%。黑斑多指馬鲅與馬達(dá)加斯加多指馬鲅（Polydactylusmalagasyensis）的種間遺傳距離為1.0%，馬倫氏多指馬鲅（Polydactylusmullani）與七絲指馬鲅（Filimanusheptadactylus）種間距離僅為0.1%，都小于2%；其他各種類間的種間遺傳距離均遠(yuǎn)大于2%。

表1 本研究中用于COI分析的馬鲅科魚類樣本的信息Tab.1 Specimen information of Polynemidae in the present study

2.3 馬鲅科魚類分子系統(tǒng)發(fā)育樹

在鄰接樹中（圖1），74條序列形成了19個(gè)分支；分支間的平均遺傳距離為20.4%（2.8%～27.6%）是分支內(nèi)平均遺傳距離0.1%（0.0%～0.2%）的204倍。20種魚類有14種形成了單系分支，支持其物種有效。多鱗四指馬鲅形成了2個(gè)自展數(shù)據(jù)支持率為99%的分支，部分福州個(gè)體、全部東興個(gè)體以及馬來西亞個(gè)體形成1支（Clade2）；廣泛分布于中國(guó)沿海的其余個(gè)體形成1支（Clade1）；分支間遺傳距離為4.8%。黑斑多指馬鲅、北部灣的六絲多指馬鲅和馬達(dá)加斯加多指馬鲅混雜于Clade16中，自展數(shù)據(jù)支持率為99%，分支內(nèi)遺傳距離為0.7%。馬倫氏多指馬鲅與七絲指馬鲅混雜于Clade14中，自展數(shù)據(jù)支持率為99%，分支內(nèi)遺傳距離僅為0.1%。四指馬鲅屬、馬鲅屬分別形成單系群。在ABGD分析中（圖3），當(dāng)種內(nèi)先驗(yàn)遺傳距離P為0.46%～2.15%時(shí)，馬鲅科被分為16個(gè)假設(shè)種。夏威夷的六絲多指馬鲅（Clade4）與五指多指馬鲅（Clade5）被歸為一個(gè)假設(shè)種；馬鲅屬的長(zhǎng)指馬鲅（Polynemusparadiseus）、黑手馬鲅（P.melanochir）和野馬鲅（P.dubius）（Clade6、Clade7、Clade8）也被歸為一個(gè)假設(shè)種，這與遺傳距離和鄰接樹的結(jié)果不一致；其他種的劃分與鄰接樹形成的分支相一致。

3 討論

馬鲅科20種魚類的種間平均遺傳距離（19.6%）是種內(nèi)平均遺傳距離（0.9%）的22倍；在鄰接樹上形成了14個(gè)單系分支，分支間平均遺傳距離（20.4%）是分支內(nèi)平均遺傳距離（0.1%）的204倍，表明存在明顯的DNA條形碼間隙，符合鑒別物種的“十倍法則”，說明COI基因適用于作為馬鲅科魚類鑒定的DNA條形碼。

多鱗四指馬鲅最早由JORDAN等［23］根據(jù)中國(guó)臺(tái)灣樣品提出，但在早期，多鱗四指馬鲅被認(rèn)為是四指馬鲅的年幼個(gè)體［24］。MOTOMURA等［25］于2002年根據(jù)側(cè)線鱗數(shù)（82～95vs71～80，前者為多鱗四指馬鲅，下同）和胸鰭顏色（黑色vs黃色）等形態(tài)特征將其與四指馬鲅分開，并確定為一個(gè)獨(dú)立的有效種被采用至今。在本研究中，多鱗四指馬鲅與四指馬鲅種間遺傳距離為16.0%，遠(yuǎn)大于2%種內(nèi)遺傳閾值，且是種內(nèi)平均遺傳距離1.2%的13倍，從分子水平上支持了該分類的有效性。但多鱗四指馬鲅種內(nèi)遺傳距離（2.3%）略大于2%的物種遺傳閾值，且在NJ樹上形成了2個(gè)明顯的分支，分支間遺傳距離（4.8%）是分支內(nèi)平均遺傳距離（0.1%）的48倍，符合“十倍法則”。楊喜書［26］發(fā)現(xiàn)南海印度鲬（Platycephalusindicus）種內(nèi)遺傳距離為4.8%，形成了2個(gè)支持率為99%的分支，且分支間的遺傳距離（10.4%）是分支內(nèi)平均遺傳距離（0.4%）的26倍，認(rèn)為印度鲬可能存在隱存種。陳璐等［27］發(fā)現(xiàn)三線鯻（Teraponputa）種內(nèi)遺傳距離（2.7%）大于2%，形成了2個(gè)分支，分支間遺傳距離為5.0%，但與分支內(nèi)的平均遺傳距離（0.85%）不滿足“十倍法則”，認(rèn)為其可能為兩個(gè)亞種或不同種。參照上述研究，推測(cè)中國(guó)沿海分布的多鱗四指馬鲅可能已分化成2個(gè)亞種乃至2個(gè)物種，其中東興個(gè)體和部分福州個(gè)體為一種或亞種，且在馬來西亞見有分布；另一種或亞種在中國(guó)黃海、東海以及南海都有分布。多鱗四指馬鲅是海水魚中的名貴品種，同時(shí)作為潛在的養(yǎng)殖新品種，具有廣闊的開發(fā)前景［28］；在今后種質(zhì)資源開發(fā)、利用和保護(hù)中，應(yīng)考慮將其歸為2個(gè)管理保護(hù)單位。

六絲多指馬鲅形成了2個(gè)距離較遠(yuǎn)的分支：1）夏威夷個(gè)體獨(dú)立成支；2）北部灣個(gè)體與黑斑多指馬鲅和馬達(dá)加斯加多指馬鲅混為一支。夏威夷的六絲多指馬鲅個(gè)體在BOLD網(wǎng)站上有照片記錄，經(jīng)仔細(xì)比對(duì)后確定鑒定無(wú)誤。黑斑多指馬鲅在中國(guó)沿海較常見［29-30］，六絲多指馬鲅較稀少，現(xiàn)有報(bào)道分布于中國(guó)南海南部及中國(guó)臺(tái)灣［5，19］，在北部灣尚未發(fā)現(xiàn)有其記錄；二者都具有6條游離胸絲，但前者側(cè)線起點(diǎn)附近具有一黑色大斑，后者無(wú)黑斑［1］。北部灣個(gè)體可能是因游離胸絲數(shù)相同而被誤鑒定成六絲多指馬鲅，實(shí)際應(yīng)為黑斑多指馬鲅。游離的胸絲數(shù)是馬鲅科魚類分類的重要特征之一，但由于有些馬鲅科魚類具有相同的胸絲數(shù)，且有時(shí)胸絲數(shù)還可能發(fā)生變異，如本實(shí)驗(yàn)室還獲得具5條胸絲的多鱗四指馬鲅；因此，不能以此作為其鑒定的唯一特征，需要結(jié)合多個(gè)不同特征來確定。

圖1 基于線粒體COI基因序列的20種馬鲅科魚類鄰接樹Fig.1 Neighbor-joining tree based on mtDNA COI sequences of 20 Polynemid species

圖2 19個(gè)分支的分支內(nèi)（a）與分支間（b）的遺傳距離Fig.2 Histograms of genentic distances within（a）and among 19 clades（b）

圖3 馬鲅科魚類的ABGD分析圖Fig.3 Automatic barcode gap discovery analysis of Polynemidae

黑斑多指馬鲅與馬達(dá)加斯加多指馬鲅的種間遺傳距離為1.0%，在鄰接樹上混為一支。黑斑多指馬鲅分布廣泛，從印度西南部沿岸到巴布亞新幾內(nèi)亞再到日本宮崎；馬達(dá)加斯加多指馬鲅目前只見于馬達(dá)加斯加、莫桑比克以及南非沿岸［1］；兩者外部形態(tài)極為相似，都有6條游離胸絲和側(cè)線起點(diǎn)附近有一黑色大斑塊，曾被認(rèn)為同一個(gè)種［31］，但前者的鰓耙數(shù)（25～30）少于后者（29～35），鰾退化，且第二背鰭基部長(zhǎng)相對(duì)明顯短于后者，被確定為新種［32］。許多研究表明，某些種類在形態(tài)上雖有一定的差異，但在分子上可以表現(xiàn)出相近的關(guān)系，如唐楚林等［33］發(fā)現(xiàn)紅鰭笛鯛（Lutjanuserythopterus）與馬拉巴笛鯛（L.malabaricus）的種間遺傳距離僅為0.3%，但可以根據(jù)側(cè)線下鱗的排列方式進(jìn)行區(qū)分；宮亞運(yùn)等［34］發(fā)現(xiàn)中頜棱鳀（Thryssamystax）與黃吻棱鳀（T.vitrirostris）的種間遺傳距離只有0.6%，但可以通過背鰭數(shù)和鰓耙數(shù)進(jìn)行區(qū)分。黑斑多指馬鲅與馬達(dá)加斯加多指馬鲅的情況與之類似，可能為同一種的2個(gè)亞種；同時(shí)由于標(biāo)準(zhǔn)COI條形碼序列長(zhǎng)度較短且保守，對(duì)近期分化形成的物種往往難以區(qū)分［35］，也有可能為近期進(jìn)化形成的2個(gè)不同物種。

馬倫氏多指馬鲅與七絲指馬鲅也混為一支，種間遺傳距離為0.1%；它們都有7條游離胸絲，也曾被混淆［24］，但前者側(cè)線起點(diǎn)附近有一黑色大斑塊，后者沒有，可能仍屬于同一物種或?yàn)榻诜只纬傻牟煌N。馬倫氏多指馬鲅、七絲指馬鲅和馬達(dá)加斯加多指馬鲅的序列源自于GenBank，筆者無(wú)法對(duì)對(duì)應(yīng)的魚類進(jìn)行形態(tài)鑒定確認(rèn)；由于形態(tài)過于相似，也不排除形態(tài)鑒定出錯(cuò)的可能。

黑斑十指馬鲅（Galeoidesdecadactylus）主要分布于非洲西海岸［1］，該魚在中國(guó)尚未有記錄，本實(shí)驗(yàn)室樣品購(gòu)自廣州市場(chǎng)，但未知其明確產(chǎn)地。五指多指馬鲅較少見，本實(shí)驗(yàn)室也只獲得幾條，同時(shí)在中國(guó)大陸有記錄的六絲多指馬鲅以及在中國(guó)臺(tái)灣有報(bào)道的小口多指馬鲅和西氏絲指馬鲅都未能采集到，特別是多鱗四指馬鲅的分類還存在問題等，在今后的研究中，還需進(jìn)一步擴(kuò)大采樣的范圍，補(bǔ)充樣品的種類和數(shù)量，在詳細(xì)的形態(tài)測(cè)量基礎(chǔ)上結(jié)合多種分子標(biāo)記展開研究，以期進(jìn)一步明確中國(guó)馬鲅科魚類的分類地位。