石斛合劑對(duì)高脂高糖糖尿病大鼠心肌細(xì)胞Ca2+代謝的影響

王海生，謝永財(cái)，李長(zhǎng)征，林 鑫，陳佳林

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州350122）

糖尿病心肌?。╠iabetic eardiomyopathy，DCM）早期以心肌舒張功能障礙為主，晚期則以心肌收縮功能障礙為主，最終引起各種心律失常、心力衰竭、心源性休克，甚至猝死，其發(fā)病原因可能是心肌細(xì)胞的代謝紊亂、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、冠狀動(dòng)脈的微血管病變、心肌間質(zhì)纖維化以及心臟自主神經(jīng)病變。Ca2+作為心肌啟動(dòng)興奮-收縮和復(fù)極-舒張兩個(gè)偶聯(lián)的樞紐，在正常心肌細(xì)胞內(nèi)存在相對(duì)穩(wěn)定的鈣平衡系統(tǒng)，即鈣穩(wěn)態(tài)。鈣穩(wěn)態(tài)失衡，Ca2+信號(hào)失常，可導(dǎo)致心肌收縮、舒張功能受損。石斛合劑以滋陰、益氣、活血立法，具有良好的降糖、降脂作用，可有效預(yù)防2 型糖尿病的并發(fā)癥［1］。 本研究以糖尿病心肌病大鼠模型為研究對(duì)象，以肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP 酶（sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase 2a，SERCA2a）、L 型鈣通道αlC亞單位蛋白（calciumchannel，voltage-dependent，L type，alpha lC subunit，CACNA1C）為指標(biāo)，探討石斛合劑對(duì)糖尿病心肌病Ca2+代謝的影響，為石斛合劑治療DCM 提供佐證。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar 大鼠，SPF 級(jí)，體質(zhì)量（150±10）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002，合格證編號(hào)：2015000 532211。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 石斛合劑藥物組成：石斛12 g，黃芪20 g，太子參15 g，丹參20 g，葛根20 g，五味子15 g。 購(gòu)自福建省第三人民醫(yī)院，自煎，濃縮至生藥含量2.0 g／mL，滅菌分裝后保存?zhèn)溆谩?鹽酸二甲雙胍腸溶片，每片250 mg，購(gòu)自貴州天安藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20160769。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 高脂飼料（閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易有限公司）；鏈脲佐菌素（上海源葉生物科技有限公司，CAS 號(hào)：18883-66-4）；SERCA2a 一抗（美國(guó)Abcam 公司）；CACNA1C 一抗（Bioss 公司）；HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗、β-actin、GAPDH（美國(guó)Proteintech公司）；Trizol 試劑盒、cDNA 一鏈合成試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 NanoDrop 2000 分光光度儀（美國(guó)Thermo 公司）；9700 基因擴(kuò)增儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）；水平電泳儀、GelDoc XR 凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；Rt2100c 酶標(biāo)檢測(cè)儀（美國(guó)Rayto公司）；DYCZ-24DN 雙垂直電泳儀、DYCZ-40D 轉(zhuǎn)印電泳儀（北京六一儀器廠(chǎng)）；V300 掃描儀（日本EPSON 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及造模 選取Wistar 大鼠24 只，于福建中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心分籠飼養(yǎng)，每籠5 只。 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)取5 只作為正常組，予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)7 周后，腹腔注射2 mL 檸檬酸緩沖液，1 周內(nèi)注射2 次。 余19 只大鼠采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病心肌病模型［2-3］，以高脂飼料喂養(yǎng)7 周后，腹腔注射鏈脲佐菌素15 mg／kg，1 周內(nèi)注射2 次。 注射鏈脲佐菌素1 周后，測(cè)空腹血糖，血糖值11.1 mmol／L 以上確定為糖尿病模型。 成模大鼠隨機(jī)分成3 組，即模型組、二甲雙胍組、石斛合劑組，繼續(xù)予高脂飼料喂養(yǎng)。 成模8 周后，二甲雙胍組按80 mg／（kg·d）予二甲雙胍溶液灌胃；石斛合劑組按6.9 g／（kg·d）予石斛合劑煎液灌胃；正常組、模型組予相同體積生理鹽水灌胃。 每周灌胃5 次，4 周后，用10%水合氯醛，以0.4 mL／kg 的劑量腹腔注射麻醉，剪取左心室，冷凍備用檢測(cè)。

2.2 觀(guān)察指標(biāo)及方法

2.2.1 大鼠血糖檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，禁食不禁水12 h，麻醉后，腹主動(dòng)脈采血，檢測(cè)血糖水平。

2.2.2 大鼠心肌病理學(xué)觀(guān)察 取左心室組織經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明，浸蠟，包埋制成蠟塊，切成厚度為5 μm 的切片，HE 染色光鏡觀(guān)察。

2.2.3 大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度測(cè)定 參照BEUCKELMANN 等［4］方法進(jìn)行改良，采用熒光分光光度計(jì)法測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣（calcium in cardiomyocyte，MyoCa2+）。 取100 mg 心室肌組織，熒光分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)胞懸液熒光F（激發(fā)波長(zhǎng)340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)500 nm），加入0.1%Triton X100 和2.5 mmol／L 乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA），測(cè)定最大熒光值（Fmax）和最小熒光值（Fmin），計(jì)算MyoCa2+濃度。

2.2.4 RT-PCR 法測(cè)定SERCA2a mRNA 水平 取左心室游離壁組織100 mg，提取總RNA，用紫外分光光度儀檢測(cè)RNA 濃度， 確定RNA 的純度及濃度，A260／A280應(yīng)在1.8～2.0 之間。 cDNA 合成及PCR擴(kuò)增按南京諾唯贊生物科技有限公司的cDNA 一鏈合成試劑盒和PCR Mix 說(shuō)明書(shū)操作。引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成，SERCA2a（rat）上游引物：5’CTATGACTGGTGATGGTGTGAAC-3’，下游引物：5’GGAGATGAGGTAGCGGATGA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度203 bp；GAPDH（rat）上游引物：5’ACGGCA AGTTCAACGGCACAG-3’，下游引物：5’GAAGACG CCAGTAGACTCCACGAC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度110 bp。使用美國(guó)Applied Biosystems 9700 PCR System，按預(yù)變性（94℃，5 min）、變性（94℃，30 s）、退火（58 ℃，30 s）、延伸（72 ℃，20 s；2→4，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min）程序，進(jìn)行擴(kuò)增。 取4 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)0.9%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀檢測(cè)條帶灰度值。

2.2.5 Western blot 檢測(cè)SERCA2a 和CACNA1C 蛋白表達(dá) 取左心室游離壁組織100 mg，冷PBS 洗滌置于勻漿管中，加入蛋白酶抑制劑，進(jìn)行勻漿、離心，收集上清液。 采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性后，通過(guò)SDS-PAGE 電泳及轉(zhuǎn)膜，TBST 配制的5%的脫脂牛奶封閉1 h。加入SERCA2a 一抗（1∶1 000）和CACNA1C 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，PVDF膜用TBST 洗滌3 次，加入二抗（1∶10 000），室溫下?lián)u床上孵育1 h。 以ECL 試劑盒顯色，在顯影儀中觀(guān)察相應(yīng)蛋白表達(dá)量，Image-J 軟件分析目標(biāo)帶的光密度值。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x±s）表示，符合正態(tài)分布用方差分析，非正態(tài)分布用秩和檢驗(yàn)中獨(dú)立樣本比較。

3 結(jié) 果

3.1 4 組大鼠血糖比較 見(jiàn)圖1。

圖1 4 組大鼠血糖比較

3.2 大鼠心肌HE 染色結(jié)果 正常組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，心肌纖維排列整齊；模型組心肌纖維排列紊亂，纖維增粗、斷裂明顯；二甲雙胍組心肌纖維增粗，排列尚整齊，纖維斷裂較多；石斛合劑組心肌纖維排列較整齊，增粗不明顯，纖維斷裂較少。 見(jiàn)圖2。

圖2 4 組大鼠心肌HE 染色光鏡圖（×400）

3.3 4 組大鼠心肌細(xì)胞MyoCa2+含量比較 見(jiàn)圖3。

圖3 4 組大鼠心肌細(xì)胞MyoCa2+含量比較

3.4 4 組大鼠心肌SERCA2a mRNA 表達(dá)比較 見(jiàn)圖4。

圖4 4 組大鼠心肌SERCA2a mRNA 表達(dá)比較

3.5 4 組大鼠心肌SERCA2a 蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)圖5。

3.6 4 組大鼠心肌CACNA1C 蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)圖6。

4 討 論

臨床研究認(rèn)為，糖尿病的病機(jī)始于痰濕阻滯、痰瘀熱積，繼而傷陰（夾瘀），引發(fā)糖耐量異常和2 型糖尿病，日久傷陰耗氣致氣陰兩虛和陰陽(yáng)兩虛，而且多夾雜瘀血［5］。 根據(jù)此特點(diǎn)，按照滋陰、益氣、活血的治療原則，創(chuàng)立了由石斛、黃芪、太子參、丹參、葛根、五味子組成的石斛合劑，獲得了良好的臨床效果［1］。

圖5 4 組大鼠心肌SERCA2a 蛋白表達(dá)比較

圖6 4 組大鼠心肌CACNA1C 蛋白表達(dá)比較

心肌細(xì)胞鈣循環(huán)主要包括鈣釋放、鈣回?cái)z和鈣儲(chǔ)存三個(gè)過(guò)程，任何一個(gè)環(huán)節(jié)的異常都將破壞心肌細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)，引起細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變減小或衰減減慢，是心力衰竭時(shí)心肌收縮力下降的主要原因。 心肌細(xì)胞去極化時(shí)，肌漿網(wǎng)內(nèi)少量Ca2+通過(guò)L 型鈣通道迅速進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)使得Ca2+濃度增加，Ca2+與肌漿網(wǎng)上的蘭尼堿受體2 結(jié)合使其開(kāi)放，導(dǎo)致大量的鈣離子從肌漿網(wǎng)中釋放出來(lái)，此過(guò)程即鈣誘導(dǎo)鈣釋放［6］。 糖尿病心肌病時(shí)，L 型鈣通道表達(dá)過(guò)量，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度過(guò)高，造成鈣超載，使興奮收縮偶聯(lián)加強(qiáng)，心肌收縮力增強(qiáng)，最終引起舒張功能障礙［7］。 本研究CACNA1C 蛋白定量結(jié)果顯示，石斛合劑組和二甲雙胍組比較，差異雖然無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但同模型組比較，石斛合劑組CACNA1C 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明石斛合劑可以抑制CACNA1C蛋白表達(dá)，具有一定抑制CICR 的作用。

心肌細(xì)胞收縮后，鈣離子的清除主要經(jīng)肌漿網(wǎng)鈣泵即SERCA2a［8］，將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+回?cái)z至肌漿網(wǎng)內(nèi)儲(chǔ)存，SERCA2a 在鈣回?cái)z中具有主導(dǎo)作用。 一般認(rèn)為，糖尿病時(shí)SERCA2a 活性降低，攝取Ca2+速率減慢［9］，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)Ca2+增多，造成鈣超載，心肌收縮時(shí)間延長(zhǎng)［10］。 本研究中SERCA2a mRNA 及蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，石斛合劑組與正常組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但同模型組與二甲雙胍組比較，均呈顯著性增高（P＜0.05），說(shuō)明石斛合劑可以增加SERCA2a mRNA 和蛋白表達(dá)，提升攝取Ca2+的速率，降低細(xì)胞質(zhì)Ca2+負(fù)荷，緩解鈣超載。 MyoCa2+測(cè)定也顯示，石斛合劑組心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣較模型組顯著性較低（P＜0.01），同二甲雙胍組比較明顯降低（P＜0.05）。心肌HE 染色光鏡觀(guān)察結(jié)果同樣顯示，石斛合劑組心肌纖維排列明顯較模型組、二甲雙胍組整齊，纖維斷裂也極少發(fā)生。

石斛合劑對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，除了糾正鈣穩(wěn)態(tài)失衡之外，是否降糖作用也是途徑之一？ 但血糖值對(duì)比顯示，石斛合劑組與模型組比較，有明顯降糖作用（P＜0.05），但不及二甲雙胍組（P＜0.05），說(shuō)明石斛合劑保護(hù)心肌細(xì)胞的作用不在于降糖作用。

綜上所述，石斛合劑對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)的途徑在于抑制CACNA1C 表達(dá)，減緩鈣誘導(dǎo)鈣釋放，防止肌漿網(wǎng)內(nèi)的Ca2+過(guò)多過(guò)快的進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；更重要的是通過(guò)促進(jìn)SERCA2a 表達(dá)，增加肌漿網(wǎng)鈣泵對(duì)鈣的回?cái)z，起到防止心肌細(xì)胞鈣超載，有效預(yù)防糖尿病心肌病的發(fā)生。