基于ANXA1／VEGF 通路研究片仔癀對(duì)肝癌腹水小鼠的保護(hù)作用

林 雅，賴文芳，李聰翀，劉毓東，林國(guó)清

（1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122；2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州350004）

肝癌是臨床常見惡性腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率及病死率逐步升高，全球發(fā)病的地區(qū)中以亞洲和南非為本病的高發(fā)區(qū)，尤其是在我國(guó)，每年新發(fā)肝細(xì)胞癌病例占全球50%以上，其病死率位居第3位，在某些農(nóng)村高發(fā)地區(qū)甚至為第1 位［1-2］。 福建名方片仔癀自明代起作為清熱解毒、消瘀散結(jié)的復(fù)方被廣泛應(yīng)用至今，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者在保肝退黃、控制腫瘤發(fā)展、提高生活質(zhì)量、緩解疼痛等方面有確切療效，同時(shí)可改善由化療藥物引起的肝功能異常［3-6］。 本課題以膜聯(lián)蛋白A-1（annexin-A1，ANXA1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）作為切入點(diǎn)，通過(guò)觀察片仔癀對(duì)H22 肝癌腹水小鼠的影響，探討片仔癀抑制保護(hù)肝功能的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供深入的理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 SPF 級(jí)ICR 小鼠，雄性，體質(zhì)量20～24 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2014-0002，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 條件的層流柜下。人肝癌細(xì)胞H22 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.2 藥物與試劑 片仔癀（漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：0908035）；環(huán)磷酰胺（美國(guó)Sigma公 司，批 號(hào)：WXBC4024V）；ALT、AST 試 劑 盒（貝爾曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，貨號(hào)：Z409226、Z507224）；ANXA1 抗體（英 國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)：ab97485）；VEGF 抗體、VEGFR 抗體、NF-κB p50 抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，貨號(hào)：#2463、#9698、#3035）；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：P0018）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Infinite M200 Pro 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)TECAN 公司）；Mini PROTEAN Tetra 小型垂直電泳槽、Mini Trans-Blot 小型轉(zhuǎn)印槽、ChemiDoc XRS＋凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備 依據(jù)文獻(xiàn)及本課題組前期造模方法［7-8］，將H22 肝癌細(xì)胞制備為1×107個(gè)／mL 的 活細(xì)胞懸液，按0.2 mL／只腹腔注射在瘤源鼠腹腔內(nèi)。接種7 d 后將瘤源鼠脫頸處死，抽取出癌性腹水，制成1×107個(gè)／mL 的活細(xì)胞懸液，按0.2 mL／只腹腔注射，建立肝癌腹水模型。

2.2 分組與給藥 將40 只雄性ICR 小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為正常組（n＝10）和造模組（n＝30），造模組建立肝癌腹水模型后再隨機(jī)分為模型組、片仔癀組和環(huán)磷酰胺組。 片仔癀組按0.2 g／（kg·d）予片仔癀藥液灌胃，環(huán)磷酰胺組按0.07 g／（kg·d）予環(huán)磷酰胺灌胃，正常組和模型組均予等容積蒸餾水灌胃。 造模24 h 后第1 次給藥，每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 藥效學(xué)指標(biāo)檢 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每日測(cè)量體質(zhì)量（g），給藥7 d 后脫頸椎處死小鼠，測(cè)量體質(zhì)量（g）及腹圍（cm）后，抽取腹水測(cè)量腹水量（mL）。

2.3.2 血清ALT、AST 含量檢測(cè) 小鼠末次給藥后24 h，摘眼眶取血，3 000 r／min 離心15 min，分離血清，使用酶速率法按檢測(cè)試劑盒操作方法和步驟檢測(cè)血清ALT、AST 含量。

2.3.3 肝組織病理學(xué)檢測(cè) 小鼠脫頸椎處死，迅速剖腹摘取同樣部位的部分肝臟，將一部分肝臟置于4%的多聚甲醛溶液中固定24 h 后， 按常規(guī)脫水包埋、切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅染色（HE 染色）。

2.3.4 Western blot 法檢測(cè) 提取細(xì)胞總蛋白，配膠電泳。 轉(zhuǎn)膜成功后TBS 洗1 遍，將PVDF 膜浸泡在封閉液中，置于搖床上室溫封閉2 h。TBS 洗滌10 min，加入ANXA1 一抗（1∶800）、VEGF 一抗（1∶800）、VEGFR 一抗（1∶800）、NF-κB p50 一抗（1∶600）、PCNA（1∶3 000）、β-actin（1∶3 000），4 ℃孵育過(guò)夜。 TBS洗滌后加入二抗，搖床室溫孵育2 h。 TBS 洗滌（10 min×3），顯影。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，若方差齊用LSD 方法，方差不齊采用Games-Howell 方法；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 小鼠一般情況 接種H22 肝癌細(xì)胞懸液造模后，模型小鼠體質(zhì)量從第4 天開始明顯高于正常小鼠，模型組、環(huán)磷酰胺組各死亡1 只，片仔癀組死亡2 只，總成模率約85%。

3.2 4 組小鼠體質(zhì)量、腹水、腹圍指標(biāo)比較 見表1。注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05。

表1 4 組小鼠體質(zhì)量、腹水、腹圍指標(biāo)比較（±s）

腹圍／cm 7.80±0.37 9.44±0.491）8.71±0.842）8.49±0.922）組別正 常 組模 型 組片仔癀組環(huán)磷酰胺組n 10 989體質(zhì)量／g 32.28±0.77 38.57±3.021）36.60±3.332）34.04±1.862）腹水／mL—8.37±0.76 7.59±0.622）7.04±1.202）

3.3 4 組小鼠血清ALT、AST 含量比較 見表2。

表2 4 組小鼠血清ALT、AST 含量比較（x±s）IU／L

3.4 4 組小鼠肝組織HE 染色結(jié)果 正常小鼠肝臟被膜無(wú)炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞未見明顯脂肪變性、壞死；模型組小鼠肝臟肝索排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細(xì)胞出現(xiàn)大小不等的脂肪空泡，脂肪性變明顯，部分肝細(xì)胞胞漿出現(xiàn)液化、退變甚至被吸收消失；片仔癀組肝索排列紊亂程度較模型組有所改善，肝小葉結(jié)構(gòu)較為清晰，脂肪空泡減少，肝細(xì)胞的液化、退變現(xiàn)象明顯比模型組減少；環(huán)磷酰胺組與模型組肝臟組織病理形態(tài)學(xué)并無(wú)出現(xiàn)任何加重或者減輕的趨勢(shì)。 見圖1。

圖1 4 組小鼠肝組織HE 染色圖（×200）

3.5 4 組小鼠肝組織ANXA1、VEGF、VEGFR 及NFκB p50 蛋白表達(dá)比較 見圖2。

4 討 論

肝癌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是近年來(lái)研究熱點(diǎn)，主要集中在肝癌細(xì)胞凋亡增殖、腫瘤血管增生等各個(gè)層次。ANXA1 是膜聯(lián)蛋白超家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員，近年研究表明ANXA1 參與炎癥過(guò)程，可以抑制炎癥介質(zhì)的合成及釋放，抑制磷脂酶A2 的表達(dá)，從而抑制中性粒細(xì)胞合成釋放炎癥介質(zhì)［9-11］，而ANXA1 的抗炎作用可能與NF-κB、絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（Akt）及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）有關(guān)，ANXA1 可以有效中斷小鼠NF-κB 信號(hào)通路。 從而抑制NF-κB 活性，降低促炎介質(zhì)的產(chǎn)生［9，12］。 VEGF既存在于癌旁組織中，也存在于血清中，不僅可以通過(guò)自分泌效應(yīng)直接刺激肝癌細(xì)胞增殖，還能分泌至血清中，間接促進(jìn)腫瘤血管增生［13］。 研究表明，VEGF 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到促進(jìn)新生血管生成的作用，同時(shí)為腫瘤細(xì)胞提供必需的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［14］。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，片仔癀可以通過(guò)促進(jìn)肝臟細(xì)胞ANXA1 蛋白的表達(dá)，下調(diào)其下游蛋白VEGF及其受體VEGFR 的表達(dá)，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子分泌作用；同時(shí)，其能夠抑制核蛋白NF-κB p50核轉(zhuǎn)錄水平，通過(guò)抑制腫瘤炎癥的作用，發(fā)揮其抗肝癌的治療效果。

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

本研究從肝功能切入，觀察片仔癀對(duì)肝癌腹水小鼠的肝臟保護(hù)作用，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以觀察到片仔癀可減少H22 肝癌小鼠的腹水量， 降低血清ALT、AST 含量，保護(hù)肝癌腹水小鼠的肝功能。 經(jīng)肝臟病理染色顯示，片仔癀組小鼠肝臟中肝索排列紊亂程度較模型組有所改善，肝小葉結(jié)構(gòu)較為清晰，脂肪空泡減少，肝細(xì)胞的液化、退變現(xiàn)象明顯比模型組減少，說(shuō)明片仔癀具有非常明顯的改善肝細(xì)胞、保護(hù)肝功能的作用［6］。

綜上所述，片仔癀具有良好的保護(hù)并改善肝細(xì)胞的作用，并且可以通過(guò)調(diào)控ANXA1／VEGF 通路，進(jìn)而抑制腫瘤炎癥作用，產(chǎn)生肝保護(hù)作用，具有潛在的抗癌作用，可為肝癌的藥物治療開辟新途徑。