血瘀證乳腺癌分子分型與EGFR、CK5／6 表達(dá)的相關(guān)性研究

陳桂芬

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州350004）

表皮生長因子受體 （epithelial growth factor re ceptor，EGFR）是原癌基因c-erbB-1 的表達(dá)產(chǎn)物，對維持細(xì)胞生長及增殖起關(guān)鍵作用。 EGFR 過度激活會促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、血管生成，促使其轉(zhuǎn)移、抑制其凋亡［1］。 細(xì)胞角蛋白5／6（cytokeratin 5／6，CK5／6）是一種高分子量的細(xì)胞角蛋白，它主要在上皮細(xì)胞基底層中表達(dá)，其過度表達(dá)與部分惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后緊密相關(guān)，且被證實(shí)可以作為基底細(xì)胞樣型乳腺癌的特征性標(biāo)志物［2］。血瘀證是乳腺癌常見的中醫(yī)辨證分型，現(xiàn)中醫(yī)“辨病-辨證”診療模式越來越受到重視，為此本研究從EGFR、CK5／6 表達(dá)的角度出發(fā)來討論其與分子分型的相關(guān)性及血瘀證乳腺癌的預(yù)后。

1 臨床資料

1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《乳腺癌》［3］中乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 參照中國中西醫(yī)結(jié)合研究會活血化瘀專業(yè)委員會制定的 《血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)》［4］，由2 位資深的中醫(yī)師分別進(jìn)行辨證分型討論，并達(dá)成一致后記錄。 血瘀證主要證候：①舌紫、黯，或有瘀斑、瘀點(diǎn)；②脈多呈細(xì)澀；③唇及（或）指端多呈紫紺，面部、眼周及（或）唇、齒齦紫黑；④黑便、皮膚瘀斑等；⑤肌膚甲錯(cuò)、皮膚瘀斑等；⑥疼痛（刺痛、久痛、定痛）；⑦經(jīng)期腹痛，血黑、暗，有血塊。 具備其中任意2 項(xiàng)即可診斷為血瘀證，余為非血瘀證者。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ①均經(jīng)穿刺或手術(shù)病理確診的原發(fā)性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌；②預(yù)計(jì)生存期大于6 個(gè)月；③卡氏評分［5］超過70 分；④入院前1 個(gè)月未服用過活血化瘀等影響中醫(yī)辨證的中藥及中成藥。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并有肝臟、腎臟、造血系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)等重大原發(fā)性疾病者；②合并有智力障礙，或其他嚴(yán)重精神病不能配合證型評估者。

1.5 一般資料 收集本院2017 年7 月—2019 年3月浸潤性乳腺癌患者80 例，于初診時(shí)采集中醫(yī)望、聞、問、切四診資料并記錄，根據(jù)辨證標(biāo)準(zhǔn)分為血瘀證組和非血瘀證組各40 例。血瘀證組年齡（50.25±7.97）歲；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18 例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移1 例。非血瘀證組年齡（52.65±8.28）歲；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17 例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移1 例。 2 組年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2 方 法

2 組均進(jìn)行穿刺或手術(shù)取得人體乳腺癌組織病理。采用免疫組化EnVision 二步法測定人體乳腺組織雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterong receptor，PR）、人類表皮因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）、增殖細(xì)胞核抗原（Ki-67）、EGFR、CK5／6 的陰性和陽性表達(dá)情況，根據(jù)ER、PR、HER-2、Ki-67 表達(dá)情況進(jìn)行乳腺癌分子分型。 留取部分新鮮的乳腺癌組織標(biāo)本置于-80 ℃冰箱保存， 采用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）檢測EGFR、CK5／6 的基因表達(dá)。

2.1 免疫組化EnVision 二步法測定蛋白表達(dá) 采用免疫組化EnVision 二步法測定ER、PR、HER-2、Ki-67、EGFR、CK5／6 的表達(dá)。用PBS 緩沖液將脫蠟至水后的組織切片沖洗，熱抗原修復(fù)后在室溫下自然冷卻取出，加3%過氧化氫溶液，避光孵育，滴加一抗，放置4 ℃冰箱中過夜，第二天取出在室溫下復(fù)溫30 min，滴加顯色劑，顯微鏡下控制顯色，顯色完全后，用水沖洗終止顯色，脫水，封片。 以上石蠟切片由我院病理科資深的技術(shù)人員制片，使用統(tǒng)一試劑和抗體，并由我院病理科資深醫(yī)師讀片。

2.2 陰性和陽性表達(dá)判斷標(biāo)準(zhǔn) ①ER、PR：陽性細(xì)胞的數(shù)量≥1%為陽性（+），余為陰性（-）；②Ki-67：陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為陰性（-），余為陽性（+）；③HER-2：不著色為陰性（-），著色為陽性（+），必要時(shí)行FISH 檢測；④EGFR：細(xì)胞不著色為陰性（-），著色細(xì)胞數(shù)＜25%為弱陽性（+），25%～50%為陽性（++），50%以上為強(qiáng)陽性（+++），EGFR 陽性包括弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性；⑤CK5／6：細(xì)胞著色數(shù)量＜5%為陰性（-），5%～24%為弱陽性（+），25%～50%為陽性（++），50%以上為強(qiáng)陽性（+++），CK5／6 陽性包括弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性。

2.3 乳腺癌分子分型 參照《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南，2013 版》分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分子分型［6］。①Luminal A 型：ER（+）／PR（+），且PR 表達(dá)≥20%，HER-2（-），Ki-67≤14%；②Luminal B 型：ER（+）／PR（+），HER-2（-），且Ki-67＞14%或PR＜20%；ER（+）／PR（+），HER-2（+），任何狀態(tài)的Ki-67；③HER-2 過表達(dá)型：ER（-）和PR（-）且HER-2（+）；④基底細(xì)胞樣型：ER（-），PR（-）且HER-2（-）。

2.4 RT-PCR 法檢測乳腺癌組織EGFR、CK5／6 mRNA 表達(dá) 用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 合成cDNA 第一鏈，RT 反應(yīng)液在冰上配制，經(jīng)過42 ℃、30 min 的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，及85 ℃、5 min 的反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)，得到的cDNA 放置在-20 ℃冰箱中備用，或者立即用于PCR反應(yīng)。 用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的特異性引物，用Oligo 6.0 檢驗(yàn)其特異性。GAPDH：F 5'-TTGGTATCGTGGAAGGACTCA-3'（131 bp），R 5'-AGTAGAGGCAGGGATGATGTT-3'；EGFR：F 5'-GATGTTCAATAACTGTGAGGTGGTCC-3'（1 048 bp），R 5'-GGATGT TATGTTCAGGCTGACGACT-3'；CK5／6：F 5'-CTCAAGGATGCCAGGAACAAG-3'（248 bp），R 5'-CCACTGCCACTGCCATATC-3'。 反應(yīng)體系：2×EasyTaq PCR SuperMix 10 μL，上游引物0.8 μL，下游 引 物0.8 μL，cDNA 模 板1 μL，dd H2O 加 至20 μL。 經(jīng)94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，反應(yīng)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電脈PCR 檢測。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 進(jìn)行資料分析。計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)；非正態(tài)分布，采用秩和檢驗(yàn)（獨(dú)立樣本Mann-Whitney U 檢驗(yàn)）。

3 結(jié) 果

3.1 2 組EGFR、CK5／6 蛋白表達(dá)情況比較 血瘀證組乳腺組織EGFR 陽性例數(shù)明顯高于非血瘀證組（χ2＝6.146，P＝0.013）；血瘀證組乳腺組織CK5／6陽性例數(shù)與非血瘀證組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝3.660，P＝0.056），見表1。

表1 2 組EGFR、CK5／6 蛋白表達(dá)情況比較

3.2 分子分型與EGFR、CK5／6 表達(dá)的相關(guān)性EGFR 表達(dá)情況：Luminal A 型、Luminal B、HER-2過表達(dá)型、基底細(xì)胞樣型在陽性率上逐漸升高，可認(rèn)為EGFR 表達(dá)與分子分型之間呈正相關(guān)（r＝1.00，P＝0.000）；CK5／6 表達(dá)情況：CK5／6 表達(dá)與分子分型無相關(guān)（r＝0.800，P＝0.200）。CK5／6 在基底細(xì)胞樣型乳腺癌的陽性表達(dá)率顯著高于其他3 型。 見表2。

表2 免疫組化法分子分型與EGFR、CK5／6 表達(dá)的相關(guān)性

3.3 2 組乳腺組織EGFR、CK5／6 mRNA 表達(dá)比較見表3。

3.4 EGFR、CK5／6 mRNA 表達(dá)與分子分型的相關(guān)性 對80 例患者的分子分型（Luminal A、Luminal B、HER-2 過表達(dá)型、基底細(xì)胞樣型）與EGFR、CK5／6 mRNA 表達(dá)情況進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果均呈直線正相關(guān)（EGFR：r＝0.726，P＝0.000；CK5／6：r＝0.550，P＝0.000）；EGFR、CK5／6 的表達(dá)也呈正相關(guān)（r＝0.562，P＝0.000）。

表3 2 組乳腺組織EGFR、CK5／6 mRNA 表達(dá)比較（x±s）

4 討 論

EGFR 是原癌基因c-erbB-1 的表達(dá)產(chǎn)物，其高表達(dá)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用［7-8］。EGFR 過度表達(dá)可導(dǎo)致惡性腫瘤病患復(fù)發(fā)率高，存活期短［9-11］。目前已有不少研究證實(shí)癌組織中EGFR 表 達(dá) 與 預(yù) 后 緊 密 相 關(guān)［12］，Kallel 等［13］研 究 也發(fā)現(xiàn)，據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)生存分析顯示EGFR 表達(dá)與生存顯著相關(guān)，可指導(dǎo)乳腺癌患者的預(yù)后。EGFR 的表達(dá)隨著乳腺癌惡性程度的增高、分期增加、分化越差而增強(qiáng)［14-15］，故EGFR 對乳腺癌預(yù)后具有較高的指導(dǎo)價(jià)值。 目前越來越多的研究證實(shí)CK5／6 可用于指導(dǎo)乳腺癌患者的預(yù)后［16］。 Sutton 等［17］也發(fā)現(xiàn)CK5／6的表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移有明顯的相關(guān)性，提示預(yù)后較差。

血瘀證是因瘀血內(nèi)阻而產(chǎn)生的證候，其在乳腺癌形成過程中占有十分重要的地位。唐容川謂：“離經(jīng)之血便是瘀。 ”瘀血聚集成塊，阻塞脈絡(luò)，消耗人體正氣，導(dǎo)致機(jī)體抗邪之力明顯下降，從而使癌細(xì)胞迅速增殖、擴(kuò)散。 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為惡性腫瘤中血瘀證患者體內(nèi)血液普遍呈高凝狀態(tài)，致使血流緩慢，癌栓形成，從而加速癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，影響患者預(yù)后［18］。本研究結(jié)果顯示，血瘀證乳腺癌分布于HER-2 過表達(dá)型和基底細(xì)胞樣型的例數(shù)總和較Luminal 型多，ER 值及PR 值平均秩均較低，提示預(yù)后可能較差，而非血瘀證乳腺癌組分布主要傾向于Luminal 型，預(yù)后相對較好。

本研究結(jié)果顯示：血瘀證乳腺癌組中，EGFR 蛋白和mRNA 表達(dá)明顯高于非血瘀證組（P＜0.05）；CK5／6 mRNA 表達(dá)明顯高于非血瘀證組（P＜0.05），但蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 由此仍可提示，血瘀證乳腺癌患者的預(yù)后較非血瘀證者差。

乳腺癌分子分型可分為Luminal A 型、Luminal B 型、HER-2 過表達(dá)型及基底細(xì)胞樣型，根據(jù)以上分型順序，預(yù)后依次變差。 本研究中：EGFR 表達(dá)陽性率與分子分型呈正相關(guān)（P＜0.05），分型越差，陽性率越高；CK5／6 表達(dá)陽性率與分子分型無相關(guān)。CK5／6 在基底細(xì)胞樣型乳腺癌中陽性率顯著高于其他三型，在Luminal B 型表達(dá)的陽性率比HER-2 過表達(dá)型稍高，表明CK5／6 可作為基底細(xì)胞樣型乳腺癌的標(biāo)志物。分子分型與EGFR、CK5／6 的表達(dá)情況呈直線正相關(guān)（P＜0.05），分型越差，EGFR、CK5／6 的灰度值越高；EGFR、CK5／6 的表達(dá)也呈正相關(guān)（P＜0.05）。 綜上所述，分子分型與EGFR 的表達(dá)呈正相關(guān)，而CK5／6 卻存在分歧，這可能和樣本量較少及免疫組化敏感性欠穩(wěn)定有關(guān)，今后將繼續(xù)追加樣本量，盡可能排除外界干擾因素，以繼續(xù)進(jìn)一步研究探討。