利用CNV-seq技術(shù)產(chǎn)前診斷Pallister-Killian綜合征胎兒一例

馮暄，張慶華，張釧，郝勝菊，鄭雷，王興

Pallister-Killian綜合征（Pallister-Killian syndrome，PKS，OMIM 601803）的臨床表現(xiàn)包括特征性顱面畸形、先天性心臟缺損、膈疝、低張力、癲癇和皮膚色素異常。1977年，Pallister等[1]在成人中首次描述了這種病。雖然發(fā)病率尚不清楚，但醫(yī)學文獻中已經(jīng)報道了100多例PKS，隨著產(chǎn)婦年齡的增加，PKS的發(fā)病率也隨之增加[2]。PKS的細胞遺傳學特點是特定組織中以嵌合體形式存在的12號短臂等臂染色體，故也稱為等臂12p綜合征或12p四體綜合征。這些異常細胞由4個12號短臂染色體組成，而不是正常存在的2個染色體。12p四體的嵌合效應(yīng)是由于額外染色體上攜帶的基因，最終導(dǎo)致顱面部、心血管、腎臟和其他系統(tǒng)異常。

1 病例報告

孕婦27歲，孕2產(chǎn)1，否認近親婚配，且無遺傳病家族史。未做產(chǎn)前篩查，妊娠中期四維彩色超聲提示：胎兒膈疝可能性大，主/肺動脈比例不協(xié)調(diào)。經(jīng)過產(chǎn)科醫(yī)生咨詢，簽署知情同意書后，于孕24周行羊水穿刺，抽取孕婦羊水30 mL，取其中10 mL用于高通量測序拷貝數(shù)變異測序（copy number variation sequencing，CNV-seq）檢測。其余20 mL羊水分2管，經(jīng)離心機（Eppendorf 5804R）2 000 r/min離心10 min后棄上清，取沉淀細胞，加適量羊水細胞培養(yǎng)基，接種于無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)8～9 d，后進行消化、染色體制片、G顯帶及核型分析。以G顯帶染色制備染色體標本。按照人類細胞遺傳學國際命名體制（2013）標準，計數(shù)20個中期分裂相，分析5個核型。胎兒羊水細胞染色體核型分析結(jié)果：47，XY，＋i（12）（p10）[58]/46,XX[42]，說明該樣本為12號短臂等臂染色體的嵌合體，見圖1。

圖1 胎兒羊水培養(yǎng)染色體核型圖

高通量測序CNV-seq法提取羊水基因組DNA，進行文庫構(gòu)建：通過片段化－連接、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）前純化、PCR擴增、PCR后純化一系列過程，利用Next Seq CN500高通量測序平臺行CNV-seq檢測，并進行測序分析，測序結(jié)果經(jīng)貝瑞基因Enliven?變異注釋系統(tǒng)標注。CNV-seq結(jié)果提示：du p（12）（p13．33p11．1）（mos），提示該樣本12號染色體p13.33-p11.1處檢測到拷貝數(shù)為3.5、片段大小為34.70 Mb的嵌合重復(fù)區(qū)域，起始位置為chr12:160001-34860000，見圖2，3。查閱Decipher數(shù)據(jù)庫（Database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensemble resource）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、PubMed數(shù)據(jù)庫和UCSC Genome Browser（University of California Santa Cruz），該變異包含了Pallister-Killian syndrome（PKS）[OMIM:601803]的全部區(qū)域。數(shù)據(jù)庫顯示，PKS患者主要表現(xiàn)為不同程度的智力障礙和發(fā)育遲緩，特殊面容，毛發(fā)稀疏，皮膚著色異常，耳聾，癲癇，脊柱側(cè)彎，先天性髖關(guān)節(jié)脫位，指/趾畸形，新生兒肌張力減退，膈疝，先天性心臟缺陷，肺部發(fā)育不良，腎臟發(fā)育不良，喂養(yǎng)困難，腸旋轉(zhuǎn)不良，肛門異常，腹股溝疝，男性外生殖器異常等。結(jié)合羊水染色體核型分析與CNV-seq結(jié)果，該樣本確診為PKS。為明確變異來源，召回孕婦及其丈夫，進行外周血染色體核型分析。夫妻雙方G顯帶核型結(jié)果均未見異常，見圖4，說明胎兒的染色體異常為新發(fā)。

2 討論

圖2 孕婦及丈夫外周血染色體核型圖

圖3 胎兒CNV-seq檢測12號染色體測序散點圖

圖4 胎兒cnv-seq檢測12號染色體拷貝數(shù)變異圖示

PKS可能涉及體內(nèi)的任何器官系統(tǒng)。雖然沒有可以作為PKS臨床診斷的典型畸形表現(xiàn)，但依然存在著很明顯的臨床特征：①特殊面容，皮膚色素異常、粗獷面容、眼距寬、高腭弓、前額突出、短頸等；②神經(jīng)系統(tǒng)：腦結(jié)構(gòu)異常、癲癇、肌張力減退；③心臟缺陷：房間隔缺損；④肺部受累：肺發(fā)育不全、膈疝；⑤胃腸道表現(xiàn)可能包括腸旋轉(zhuǎn)不良和肛門移位；⑥骨骼肌肉系統(tǒng)發(fā)育異常，包括PKS特有的生長模式，即在宮內(nèi)提示明顯的生長過度現(xiàn)象，但在出生后立即表現(xiàn)為生長發(fā)育遲緩；75%的PKS患者還患有一定程度的視力損傷[3]。先天性膈疝被認為是PKS典型的特征，并且經(jīng)常是出生后早期的死亡原因[4]。PKS在妊娠中期超聲中可顯示明顯的畸形，常見的畸形包括：羊水過多、膈疝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、胎兒水腫、顏面部異常、心室擴張、短肢畸形；當超聲提示羊水過多、膈疝、肢根骨短小，尤其伴有生長過度時，尤其應(yīng)考慮本病[5]。本病例中的孕婦，妊娠中期系統(tǒng)超聲提示：胎兒先天性膈疝，股骨、肱骨位于平均值的2個標準差以下、心臟移位至右側(cè)胸腔、肺/主動脈比值增大、心包積液、三尖瓣返流（少量）。符合PKS超聲指標的主要特征。

PKS是一種散發(fā)的，罕見的染色體疾病，具有復(fù)雜的臨床表型及特殊的遺傳學特點，臨床上往往容易漏診，所以準確有效的產(chǎn)前診斷，是避免缺陷患兒出生、減輕患兒家庭和社會負擔的最佳手段。在產(chǎn)前診斷中，超聲檢查對PKS的診斷具有重要價值，當碰到羊水過大、先天性膈疝、四肢短小、過度發(fā)育的胎兒應(yīng)該高度警惕，隨著三維超聲技術(shù)的發(fā)展，胎兒面部特點的三維成像也能為PKS產(chǎn)前診斷提供更多的信息；當在臨床中遇到特征性的粗獷面容（大前額、頭發(fā)稀疏、眼間距增寬、短鼻且鼻孔前傾、鼻梁低平、人中長、頸短），重度發(fā)育遲緩、皮膚色素異常等癥狀時，臨床醫(yī)師可提出初步判斷，并且應(yīng)注意不同組織來源標本的特點，并結(jié)合多種檢測技術(shù)進行診斷。盡管PKS真實的發(fā)病率不能確定，但其是一種很罕見的遺傳病，因為癥狀相對較輕的此病患兒可能會被人們忽視，所以某些患者事實上并未在醫(yī)院留有確診記錄。因此，被確診的病例僅僅是此病癥狀相對嚴重的一些患兒。在已有的醫(yī)學文獻記錄中，僅有150多例PKS的確診病例。正是由于PKS具有特殊的細胞遺傳學特點，即異常的染色體有組織特異性，在臨床中診斷可能常會被遺漏，所以遺傳咨詢就顯得更為重要。特別是對已經(jīng)生過PKS患兒的家庭，產(chǎn)前診斷與遺傳咨詢是杜絕此類患兒再次出生的唯一手段。首先，從遺傳模式來講，PKS不具有遺傳性。誘發(fā)此病的染色體變異一般是屬于父源或母源生殖細胞（精子或卵子）形成過程中發(fā)生的不確定事件。通?；颊咂渌彝コ蓡T都并沒有此病癥的患病史。細胞分裂中的反?，F(xiàn)象，醫(yī)學上常稱其為黏合現(xiàn)象，很可能會在某個生殖細胞中產(chǎn)生多余的12號短臂等臂染色體。如果此反常的生殖細胞影響到了下一代體內(nèi)細胞的基因組合，那么該新生兒體內(nèi)細胞可能會兼有12號染色體的兩份正常拷貝和多余的12號短臂等臂染色體。在胎兒的早期發(fā)育過程中，其體內(nèi)某些細胞內(nèi)并沒有多余的父源或母源12號短臂等臂染色體，而另一些細胞內(nèi)卻有。此遺傳現(xiàn)象在醫(yī)學上被稱為染色體嵌合。幾乎所有的PKS都是由于此染色體嵌合現(xiàn)象引發(fā)的。如果所有的機體細胞里都有此多余的等臂染色體的話，那么引發(fā)的PKS癥狀的嚴重程度會使患者的生存質(zhì)量大為降低。

隨著二胎政策的全面放開，高齡孕婦不斷增加，現(xiàn)行產(chǎn)前診斷技術(shù)核型分析不能滿足臨床產(chǎn)前診斷需求，鑒于CNV-seq在臨床的不斷實踐，其憑借著檢測范圍廣、精準、通量高、成本低、操作簡便等優(yōu)勢，在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用逐步深入。2019年4月10日，國內(nèi)首個《低深度全基因組測序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識》（簡稱《共識》）在《中華醫(yī)學遺傳學》上刊發(fā)?！豆沧R》對CNV-seq技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用規(guī)范進行了詳細的闡述說明，對規(guī)范CNV-seq技術(shù)的臨床應(yīng)用，推動技術(shù)發(fā)展起到了非常重要的作用。本病例用CNV-seq技術(shù)在產(chǎn)前明確診斷出PKS，也進一步證實了CNV-seq技術(shù)作為一線技術(shù)應(yīng)用在臨床的效果，真實有效地評價了該技術(shù)的診斷水平。

本病例妊娠中期超聲提示先天性膈疝、股骨短等異常，進行產(chǎn)前診斷。運用染色體G顯帶核型分析和CNV-seq技術(shù)檢測。羊水核型最初發(fā)現(xiàn)該樣本核型以嵌合形式存在1條額外標記染色體，核型結(jié)果為47，X Y，+mar[58]/46，X Y[42]。與CNV-seq結(jié)果核對之后，可以明確這條額外標記染色體的來源為12號染色體短臂，最終確定了羊水核型分析結(jié)果：47，X Y，+i（12）（p10）[58]/46，X Y[42]。這也證明了CNV-seq技術(shù)可以鑒別來源不明的胎兒標記染色體，明確其遺傳物質(zhì)的來源，對染色體微缺失/微重復(fù)綜合征的診斷有重要價值。PKS患者異常的染色體有組織特異性，通常在皮膚成纖維細胞中可以檢測到異常。因此，由于PKS這種特殊的組織特異性，PKS的診斷可能經(jīng)常被遺漏，并且通常在快速分裂的細胞，如外周血淋巴細胞中未檢測到[6-7]?，F(xiàn)已報道的病例中幾乎沒有在外周淋巴細胞中診斷出異染色體i（12）（p10）的報道[8]。據(jù)不同組織中期染色體核型分析統(tǒng)計，包含異常染色體i（12）（p10）的組織中，淋巴細胞檢出率為0～2%，成纖維細胞檢出率為50%～100%，羊水細胞和骨髓細胞檢出率為100%[9]。本病例羊水細胞中i（12）（p10）占58%，羊水CNV-seq結(jié)果示12號染色體短臂重復(fù)，拷貝數(shù)為3.5，一般來說，單純的染色體重復(fù)，檢測到的拷貝數(shù)應(yīng)為3，但該樣本是12號短臂等臂四倍體的嵌合體，導(dǎo)致其拷貝數(shù)為3.5。說明CNV-seq技術(shù)可以精準地檢測出比例高于5%的嵌合體。綜上所述，G顯帶核型分析與CNV-seq技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，可以明確診斷PKS。