凡納濱對蝦6-磷酸海藻糖合成酶在抗高溫脅迫中的表達特征*

胡利杰 李旭鵬 孟憲紅 欒 生 羅 坤 隋 娟 陳寶龍 曹寶祥 曹家旺 孔 杰①

凡納濱對蝦6-磷酸海藻糖合成酶在抗高溫脅迫中的表達特征*

胡利杰1,3李旭鵬2,3孟憲紅2,3欒 生2,3羅 坤2,3隋 娟2,3陳寶龍2,3曹寶祥3曹家旺3孔 杰2,3①

(1. 大連海洋大學水產(chǎn)與生命學院 大連 116023；2. 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071；3. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 青島 266071)

6-磷酸海藻糖合成酶(, TPS)是海藻糖合成的關(guān)鍵酶，在生物體逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。本研究以凡納濱對蝦()高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組測序的Unigene序列為基礎(chǔ)，采用直接PCR擴增的方法，獲得了部分cDNA (完整的ORF和部分UTR)序列()。序列分析結(jié)果顯示，序列包含1個2529 bp的開放閱讀框，可編碼842個氨基酸，分子量為95.4 kDa，等電點為6.17。具有Glyco-transf-20和Trehalose PPase 2個功能結(jié)構(gòu)域。多序列比對結(jié)果顯示，與中國對蝦()的相似性最高，為63.73%；系統(tǒng)進化樹顯示，凡納濱對蝦與中國對蝦親緣關(guān)系最近，并與藍蟹()、脊尾白蝦()、克氏原螯蝦()等無脊椎動物聚為一支，脊椎動物單獨聚為一支?；虮磉_水平的定量分析結(jié)果顯示，在鰓、肝胰腺、眼柄、心臟、神經(jīng)和肌肉6種組織中均表達。鰓和肌肉表達量基本相同，為最高；眼柄、心臟和神經(jīng)表達量次之，顯著低于鰓和肌肉中的表達量(<0.05)；肝胰腺中表達量為最低，顯著低于其他5種組織中的表達量(<0.05)。與26℃溫度下的凡納濱對蝦相比，水溫升至32℃時，眼柄和心臟中的顯著上調(diào)表達(<0.05)；水溫升至38℃時，鰓、肝胰腺、眼柄和心臟中顯著上調(diào)表達(<0.05)。其中，在肝胰腺中表達量變化較顯著。之后，隨著溫度的下降，其表達量總體呈下調(diào)趨勢。回溫至32℃和26℃時，6種組織中基因表達量與對照組均無顯著性差異。在神經(jīng)和肌肉中，不同溫度脅迫下的基因表達量沒有顯著變化。上述研究結(jié)果表明，與凡納濱對蝦應(yīng)對高溫脅迫過程密切相關(guān)。本研究可為解析凡納濱對蝦應(yīng)答高溫脅迫機制提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

6-磷酸海藻糖合成酶；凡納濱對蝦；高溫脅迫；基因表達

凡納濱對蝦()適應(yīng)能力強，養(yǎng)殖范圍分布廣，是目前世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大優(yōu)良品種之一，已經(jīng)在30多個國家實現(xiàn)人工養(yǎng)殖，也是我國最重要的水產(chǎn)經(jīng)濟養(yǎng)殖品種之一(郜衛(wèi)華等, 2013)。溫度是養(yǎng)殖水環(huán)境中最重要環(huán)境因子之一，能直接影響?zhàn)B殖生物的存活、生長和代謝強度等。凡納濱對蝦屬于變溫動物，且對環(huán)境溫度的依賴性較強，極易受到外界溫度的影響。楊鋒等(2001)報道，凡納濱對蝦生長的最適溫度為28℃~32℃；Wyban等(1995)研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦的適溫范圍為23℃~ 30℃；當水溫降至15℃~22℃或升至30℃~33℃時，就會受到來自環(huán)境的脅迫；同時，凡納濱對蝦生長的最適溫度受發(fā)育階段影響，大于5 g對蝦的最適溫度為27℃左右，而小于5 g對蝦的最適溫度高于30℃。對蝦流行性病毒病暴發(fā)具有明顯的季節(jié)性，尤其在夏季高溫的6~7月和9月上旬發(fā)病嚴重(丁志起等, 2005)，一方面可能是病毒及對蝦免疫力等共同作用的結(jié)果；另一方面是天氣和晝夜變化引起的溫度變化，或者持續(xù)高溫，造成對蝦生理機能協(xié)調(diào)失常，免疫防御能力明顯下降(Cheng, 2000)。對蝦在高溫季節(jié)的患病及死亡率明顯增加，因此，深入研究凡納濱對蝦高溫脅迫耐受性的分子機制，對培育溫度抗逆型凡納濱對蝦新品種、促進對蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展具有重要意義。

海藻糖(Trehalose)是一種非還原性雙糖，由兩分子葡萄糖單體以α,α-糖苷鍵連結(jié)而成(Elbein, 2003)，廣泛存在于各種生物體中，包括細菌、酵母、真菌、昆蟲、無脊椎動物以及低等和高等植物(Elbein, 2003; Chung, 2008)。海藻糖可抵抗多種環(huán)境脅迫，如高溫、低溫、干旱、冰凍、氧化、高鹽等，保護蛋白質(zhì)、核酸、生物膜等生物活性物質(zhì)和細胞結(jié)構(gòu)(Mu, 2016; Tang, 2010、2018)。大量研究表明，某些物種對外界惡劣環(huán)境所表現(xiàn)出來的抗逆耐受力與它們體內(nèi)存在的海藻糖有直接關(guān)系(聶凌鴻等, 2001)。昆蟲和其他無脊椎動物中的海藻糖合成被認為通過6-磷酸海藻糖合成酶(, TPS)和6-磷酸海藻糖酯酶(phosphatase, TPP)途徑發(fā)生(Tang, 2018)。海藻糖在生物體中分布最廣的合成途徑是葡萄糖從UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移到6-磷酸葡萄糖，然后通過6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)形成6-磷酸海藻糖和UDP，再由6-磷酸海藻糖酯酶(Trehalose-6- phosphate phosphatase, TPP)催化合成海藻糖(Elbein, 2003)。因此，TPS被認為是海藻糖生物合成途徑的關(guān)鍵酶。為了更好地闡明TPS的結(jié)構(gòu)和功能，目前已經(jīng)從動物、植物和微生物中克隆了大量的基因(Mu, 2016; Tang, 2010、2018; 聶凌鴻等, 2001; Kwon, 2003; Jiang, 2010; Wang, 2010; Jiang, 2014; Uyar, 2016; Wu, 2018; Zhang, 2019a)。在動物中，基因主要集中于節(jié)肢動物，尤其是昆蟲?；蛟诩讱ゎ悇游镏袌蟮垒^少，目前在藍蟹()、中國對蝦()和脊尾白蝦()中有報道。研究發(fā)現(xiàn)，藍蟹蛻皮過程中血細胞活性與血淋巴海藻糖水平的相關(guān)性，并揭示了它在能量代謝和生理適應(yīng)中的作用(Chung, 2008)。同時，在中國對蝦和脊尾白蝦的抗病毒實驗中發(fā)現(xiàn)了可能在蝦的免疫過程中起重要作用。(Zhang, 2019a; Zhang, 2012)。本研究對凡納濱對蝦基因在不同脅迫溫度下以及不同組織中的應(yīng)激表達特性進行分析，可為凡納濱對蝦應(yīng)答高溫脅迫提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 凡納濱對蝦樣品及脅迫處理

實驗材料均來自于2018年構(gòu)建的同一個凡納濱對蝦家系，8月齡，平均體重為(8.0±0.5) g。實驗在中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所遺傳育種中心進行。設(shè)置5個實驗組，分別為26℃常溫組、32℃高溫組、38℃高溫組、32℃回溫組和26℃回溫組，每個實驗組設(shè)置4個平行實驗(其中，1個平行實驗作為備份防止升降溫過程中電器故障而造成實驗失敗)，每個平行實驗使用對蝦10尾，放于(72 cm× 42 cm× 24 cm)泡沫箱中充氣暫養(yǎng)。升降溫操作方法如下：采用靜水法，自動恒溫加熱器控溫。26℃持續(xù)48 h之后，每12 h緩慢升溫或降溫1℃至實驗溫度。整個實驗過程，從26℃先升溫到32℃，再從32℃升溫到38℃，再從38℃回溫到32℃，再從32℃回溫到26℃。到達實驗溫度后，維持水溫12 h，從實驗組每個平行實驗中分別隨機取3尾凡納濱對蝦，每尾蝦取鰓、肝胰腺、眼柄、心臟、神經(jīng)和肌肉6種組織，最后將每個平行實驗的3尾蝦的同一組織等量混合后保存于液氮中。用于后續(xù)的RNA提取和基因表達定量實驗。

1.2 總RNA的提取

通過TRIZOL法提取凡納濱對蝦6種組織的總RNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量以及完整性。使用NanoDrop 2000 UV/Vis分光光度計(Thermo Fisher Scientific)在260 nm和280 nm的波長下通過分光光度法定量總RNA。根據(jù)說明書，使用試劑盒HiScriptⅡ Q RT SuperMix for qPCR逆轉(zhuǎn)錄酶(Vazyme)和銜接子寡聚(dT)引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.3 引物的設(shè)計與篩選

根據(jù)的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件結(jié)合DNAStar分析軟件及BLAST程序，設(shè)計cDNA序列擴增、基因表達定量所用的引物，信息如表1所示。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用無菌水稀釋到10 μmol/L，–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列信息

Tab.1 Sequences of primers

1.4 LvTPS基因序列的驗證

根據(jù)已有凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組(未發(fā)表)中Unigene序列，設(shè)計序列擴增引物(表1)，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，進行普通PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行切膠回收和測序，并將測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組中Unigene序列比對，以確定的cDNA序列。

1.5 LvTPS基因的生物信息學分析

利用DNAMAN 8.0軟件，根據(jù)獲得的的cDNA序列翻譯獲得氨基酸序列；通過ExPASy- ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測蛋白質(zhì)分子量、理論等電點、不穩(wěn)定性指數(shù)等；通過TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)；使用SignalP 4.0 (http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽預(yù)測；NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetNGlyc/)進行糖基化位點分析；NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進行磷酸化位點分析；氨基酸序列通過使用InterProScan (http:// www.ebi.ac.uk/InterProScan/)進行蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析；SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；基于BLAST搜索結(jié)果，對在氨基酸水平上進行同源比較和進化樹分析，使用DNAMAN 6.0進行同源多序列比對，MEGA 7.0鄰接法(Neighbour- joining method, NJ)完成基因進化樹構(gòu)建。

1.6 LvTPS的表達定量分析

按照Thunderbird SYBR qPCR Mix的說明書，通過Real-time PCR分析在6種組織中的表達水平，每個樣品設(shè)置3個平行實驗。Real-time PCR在10 μl反應(yīng)體系中進行：5 μl Thunderbird SYBR qPCR Mix，0.2 μl 50×ROX reference，0.15 μl正向引物和0.15 μl反向引物，3.5 μl滅菌超純水以及1 μl cDNA (100 ng)。反應(yīng)條件：95℃初始變性60 s；95℃變性15 s，60℃退火35 s，40個循環(huán)；熔解曲線95℃ 15 s，55℃ 1 min，95℃ 15 s。

1.7 數(shù)據(jù)分析

以凡納濱對蝦18S rRNA基因表達水平為內(nèi)參，利用2–△△Ct法計算目的基因的相對表達量(Bai, 2012)。采用SPSS 17.0軟件分析在不同溫度下同一組織中差異表達的顯著性，若<0.05，則認為差異顯著；利用OriginPro 9.1軟件完成相關(guān)圖表的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 LvTPS ORF序列的驗證及特征分析結(jié)果

利用RT-PCR技術(shù)獲得的cDNA序列與轉(zhuǎn)錄組測序獲得的Unigene序列完全一致。序列包含1個2529 bp的開放閱讀框，可編碼842個氨基酸，預(yù)測其帶有負性電荷的氨基酸殘基為102個 (Asp+Glu)，帶有正電荷的氨基酸殘基為89個(Lys+ Arg)，分子量為95.4 kDa，等電點為6.17，不穩(wěn)定系數(shù)為51.75，歸類為不穩(wěn)定蛋白，脂肪族指數(shù)為83.46，親水性總平均值為–0.34；無跨膜蛋白和信號肽結(jié)構(gòu)；預(yù)測包含72個磷酸化位點和3個糖基化位點；包含2個功能結(jié)構(gòu)域，分別為Glyco-transf-20 domain和Trehalose_PPase domain (圖2)；預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋(353個氨基酸)占41.92%，-折疊(131個氨基酸)占15.56%，-轉(zhuǎn)角(43個氨基酸)占5.11%，無規(guī)卷曲(315個氨基酸)占37.41%，說明基因編碼的蛋白以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主，含少量的-折疊，間或有-轉(zhuǎn)角。

圖1 LvTPS基因cDNA序列和對應(yīng)的氨基酸序列

圖2 LvTPS的功能結(jié)構(gòu)域

2.2 LvTPS的同源性分析

利用NCBI BLASTP對基因編碼的氨基酸序列進行同源序列比對(圖3)，發(fā)現(xiàn)LvTPS與其他甲殼動物如中國對蝦、脊尾白蝦、克氏原螯蝦()、藍蟹同源性較高，分別為63.73%、55.40%、55.40%和51.16%，與煙粉虱()、阿根廷蟻()、蜜蜂()、甜菜夜蛾()、棉鈴蟲()、秀麗隱桿線蟲()和大腸桿菌()同源性分別為38.91%、38.99%、38.43%、38.43%、26.34%、13.13%和12.81%。

圖3 TPS氨基酸序列比對

TPS序列GenBank登錄號：脊尾白蝦(MK896805)，克氏原螯蝦(ASW35095.1)，中國對蝦(ACD74843.1)，藍蟹(ACL00655.1)，煙粉虱(XP_018915964.1)，阿根廷蟻(XP_012234592.1)，蜜蜂(XP_026297280.1)，秀麗隱桿線蟲(AJ512333)，大腸桿菌(EU070413)，棉鈴蟲(DQ086235)，甜菜夜蛾(EF051258)

The GenBank accession numbers of TPS amino acid sequences are as follows:(MK896805),(ASW35095.1),(ACD74843.1),(ACL00655.1),(XP_018915964.1),(XP_012234592.1),(XP_026297280.1),(AJ512333),(EU070413) ),(DQ086235),(EF051258)

2.3 TPS的系統(tǒng)進化分析

對基因編碼的蛋白序列進行系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示(圖4)，凡納濱對蝦與中國對蝦親緣關(guān)系最近，并與藍蟹、脊尾白蝦、克氏原螯蝦等無脊椎動物聚為一支，脊椎動物單獨聚為一支，符合系統(tǒng)進化學分類地位。

圖4 TPS系統(tǒng)進化發(fā)育樹分析

TPS序列GenBank登錄號：阿根廷蟻(XP_012234592.1)，蜜蜂(XP_026297280.1)，棉鈴蟲(DQ086235)，甜菜夜蛾(EF051258)，煙粉虱(XP_018915964.1)，秀麗隱桿線蟲(AJ512333)，大腸桿菌(EU070413)，中國對蝦(ACD74843.1)，藍蟹(ACL00655.1)，脊尾白蝦(MK896805)，克氏原螯蝦(ASW35095.1)

The GenBank accession numbers of TPS amino acid sequences are as follows:(XP_012234592.1),(XP_026297280.1),(DQ086235),(EF051258),(XP_018915964.1),(AJ512333),(EU070413),(ACD74843.1),(ACL00655.1),(MK896805),(ASW35095.1)

2.4 LvTPS基因在正常凡納濱對蝦組織中的表達

Real-time PCR分析顯示，在凡納濱對蝦的6種組織中均有表達，鰓和肌肉中的表達量基本相同，為最高；眼柄、心臟和神經(jīng)中次之，顯著低于鰓和肌肉中的表達量(<0.05)；肝胰腺中為最低，顯著低于其他5種組織中的表達量(<0.05) (圖5)。

圖5 26℃時LvTPS在6種組織中的表達分布

1：鰓；2：肝胰腺；3：眼柄；4：心臟；5：神經(jīng)；6：肌肉標有不同字母的值之間差異顯著(<0.05)，下同

1: Gill; 2: Hepatopancreas; 3: Eye stalk; 4: Heart; 5: Nerve tissue; 6: Muscle Values marked with different letters are significantly different (<0.05). The same as below

2.5 不同溫度脅迫下LvTPS基因在不同組織中的表達

以26℃下的凡納濱對蝦為對照組，在不同溫度脅迫下，基因在凡納濱對蝦6種組織中的相對表達量見圖6。與對照組(26℃)下的凡納濱對蝦相比，水溫升至32℃時，眼柄和心臟中的基因顯著上調(diào)表達(<0.05)。水溫升至38℃時，鰓、肝胰腺、眼柄和心臟中基因顯著上調(diào)表達(<0.05)，其中，在肝胰腺中表達量變化比較顯著。之后隨著溫度的下降其表達量總體呈下調(diào)趨勢?；販刂?2℃和26℃時，6種組織中表達量與對照組均無顯著性差異(0.05)。在神經(jīng)和肌肉中，不同溫度脅迫下的基因表達量沒有顯著變化(0.05) (圖6)。

3 討論

研究表明，海藻糖由于其獨特的化學性質(zhì)，可以保護生物體免受不同的環(huán)境壓力，包括高溫、氧化、低溫、缺氧或干燥(聶凌鴻等, 2001)。是海藻糖生物合成途徑的關(guān)鍵酶，生物在長期進化過程中，可通過提高海藻糖的含量來抵御逆境。本研究從凡納濱對蝦中獲得完整的ORF序列，預(yù)測的氨基酸序列中有2個功能域(Glyco-transf-20和Trehalose_ PPase)。這不僅與中國對蝦和脊尾白蝦的預(yù)測結(jié)果相一致(Zhang, 2019a; Zhang, 2012)，同時，與真核生物擬南芥()、黑腹果蠅()、裂殖酵母()和水稻()的功能域一致。而原核生物秀麗隱桿線蟲和大腸桿菌只有1個功能域(Glyco-transf-20 domain) (張冰君等, 2008)。這可能與真核生物和原核生物在基因表達與調(diào)控時策略的不同有關(guān)。生物信息學分析表明，具有糖基轉(zhuǎn)移酶和海藻糖-磷酸酶活性，糖基轉(zhuǎn)移酶的作用是合成雙糖、寡糖和多糖。海藻糖-磷酸酶催化6-磷酸海藻糖去磷酸合成海藻糖和磷酸鹽。

圖6 不同溫度下LvTPS在6種組織中的表達分布

海藻糖廣泛存在于低等植物、藻類、細菌、真菌、酵母、昆蟲及無脊椎動物中，既是一種貯藏性糖類，又是應(yīng)激代謝的重要產(chǎn)物(聶凌鴻等, 2001)。生物體對逆境脅迫的響應(yīng)是一個非常復(fù)雜的生理生化過程，其中包括多種基因、多種生理機制的共同調(diào)控。海藻糖由于可與2個水分子結(jié)合形成玻璃態(tài)結(jié)構(gòu)，具有很強的抗逆作用，在逆境條件下可穩(wěn)定生物膜、蛋白質(zhì)和核酸等細胞結(jié)構(gòu)和生物大分子，顯著提升生物的抗逆性，因此，近年來，成為了抗逆基因工程研究的重點。凡納濱對蝦是我國最重要的水產(chǎn)經(jīng)濟養(yǎng)殖品種之一。近年來，天氣持續(xù)高溫導(dǎo)致對蝦患病及死亡率明顯增加。基因是凡納濱對蝦海藻糖合成過程的關(guān)鍵基因。摸清基因在逆境脅迫條件下的表達水平變化，對于了解海藻糖在凡納濱對蝦逆境脅迫應(yīng)答中的作用具有重要意義。本研究采用Real-time PCR技術(shù)檢測了基因在凡納濱對蝦溫度脅迫時6種組織表達水平變化，結(jié)果表明，在所有檢測的組織中都有表達，表明這些組織都可以合成海藻糖，這與在藍蟹、中國對蝦和脊尾白蝦中的發(fā)現(xiàn)一致(Chung, 2008; Zhang, 2019a; Zhang, 2012)。同時發(fā)現(xiàn)，溫度升至38℃后，在鰓、肝胰腺、眼柄和心臟4種組織中出現(xiàn)差異表達，說明基因可能在對蝦受到高溫脅迫時發(fā)揮了應(yīng)激調(diào)節(jié)作用。其中，在肝胰腺、眼柄和心臟中，表達明顯呈現(xiàn)出隨溫度變化先升高后降低的趨勢，進一步證明，凡納濱對蝦功能與溫度脅迫過程密切相關(guān)。結(jié)果也表明，高溫脅迫對的誘導(dǎo)表達存在組織的特異性，這可能與不同組織的功能定位有關(guān)。其中，在肝胰腺中的表達量變化最高，表明高溫脅迫對凡納濱對蝦肝胰腺中的海藻糖合成水平影響較大，提示肝胰腺在對蝦應(yīng)對溫度脅迫中發(fā)揮重要作用。另外，溫度由26℃逐漸升溫到32℃，表達水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化的原因可能與32℃屬于凡納濱對蝦自然海區(qū)水溫有關(guān)，對凡納濱對蝦而言，這個溫度改變構(gòu)不成環(huán)境脅迫，不會啟動應(yīng)激響應(yīng)機制。而在受到較高溫度(38℃)脅迫時，基因啟動表達，應(yīng)對環(huán)境脅迫。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，表達水平的高低對生物體的抗逆能力和環(huán)境適應(yīng)能力具有重要的影響。結(jié)合異色瓢蟲()和德國小蠊()等昆蟲的溫度誘導(dǎo)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低溫或高溫誘導(dǎo)情況下，基因表達量均顯著高于正常溫度下的表達量(秦資等, 2012; 陳靜, 2015)。轉(zhuǎn)染果蠅基因的哺乳動物細胞海藻糖水平升高，以保護細胞免受缺氧損傷(Chen, 2002、2004; Chen, 2003)。在蔥蠅()中，基因表達量在滯育或打破滯育后的變化顯著，滯育前期和后期的表達量較高，非滯育時期表達量較低(李源等, 2013)，說明合成的海藻糖在協(xié)助昆蟲抵御不良環(huán)境中發(fā)揮重要作用。近期，Zhang等(2019b)報道了家蠅()在受到大腸桿菌或金黃色葡萄球菌()侵襲后表達上調(diào)，推測通過合成其產(chǎn)物海藻糖，參與家蠅的免疫防御。結(jié)合本研究中凡納濱對蝦受高溫脅迫后組織中表達明顯升高，之后隨溫度降低，表達量又逐漸降低，再次說明與凡納濱對蝦應(yīng)對高溫脅迫過程密切相關(guān)。但表達量和海藻糖含量的相關(guān)性還有待于進一步研究，因為已有研究表明，基因表達與海藻糖含量變化并不完全一致。例如，優(yōu)雅蟈螽()海藻糖合成酶基因在15℃處理下表達量最高，而海藻糖含量在0℃處理下表達量最高(騫蕾陽等, 2017)。繼續(xù)深入對的研究，對凡納濱對蝦健康養(yǎng)殖和抗逆新品種選育具有一定意義。

Bai H, Du JF, Hu M,. Analysis of mechanisms of resistance and tolerance ofto enrofloxacin. Annals of Microbiology, 2012, 62(1): 293–298

Chen J, Zhang DW. Molecular cloning, tissue distribution and temperature-induced expression of two trehalose-6-phosphatesynthase genes in(Blattodea: Blattellidae).Acta Entomologica Sinica, 2015, 58(10): 1046–1053 [陳靜, 張道偉. 德國小蠊兩個海藻糖合成酶基因的克隆、組織分布及溫度誘導(dǎo)表達分析. 昆蟲學報, 2015, 58(10): 1046– 1053]

Chen Q, Behar KL, Tian X,. Expression oftrehalose-phosphate synthase in HEK-293 cells increases hypoxia tolerance. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(49): 49113–49118

Chen Q, Enbo M, Behar KL,. Role of trehalose phosphate synthase in anoxia tolerance and development in. Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(5): 3274–3279

Chen Q, Haddad GG. Role of trehalose phosphate synthase and trehalose during hypoxia: From flies to mammals. Journal of Experimental Biology, 2004, 207(18): 3125

Cheng W, Chen JC. Effects of pH, temperature and salinity on immune parameters of the freshwater prawn. Fish and Shellfish Immunology, 2000, 10(4): 387–391

Chung JS. A trehalose 6-phosphate synthase gene of the hemocytesof the blue crab,: Cloning, the expression, its enzyme activity and relationship to hemolymph trehalose levels. Saline Systems, 2008, 4(1): 18

Ding ZQ, Feng YP. Discussion on the pathogenesis and prevention of prawn. Scientific Fish Farming, 2005(6): 64 [丁志起, 馮艷萍. 對蝦發(fā)病規(guī)律與防治對策的探討. 科學養(yǎng)魚, 2005(6): 64]

Elbein AD, Pan YT, Pastuszak I,. New insights on trehalose: A multifunctional molecule. Glycobiology, 2003, 13(4): 17–27

Gao WP, Tan BP, Mai KS,. Dentification of differentially expressed genes in hepatopancreas of white shrimpinduced by long-term low-salinity stress. Periodical of Ocean University of China (Natural Science), 2013, 43(9): 43–50 [郜衛(wèi)華, 譚北平, 麥康森, 等. 長期低滲脅迫誘導(dǎo)凡納濱對蝦肝胰腺差異表達基因的研究. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2013, 43(9): 43–50]

Jiang T, Zhai H, Wang FB,. Cloning and characterization of a salt tolerance-associated gene encoding trehalose-6-phosphate synthase in sweet potato. Journal of Integrative Agriculture, 2014, 13(8): 1651–1661

Jiang W, Fu FL, Zhang SZ,. Cloning and characterization of functional trehalose-6-phosphate synthase gene in Maize. Journal of Plant Biology, 2010, 53(2): 134–141

Kwon HB, Yeo ET, Hahn SE,. Cloning and characterization of genes encoding trehalose-6-phosphate synthase (TPS1) and trehalose-6-phosphate phosphatase (TPS2) from. FEMS Yeast Research, 2003, 3(4): 433–440

Li Y, Hao YJ, Zhang YJ,. Cloning, bioinformatic analysis and diapauserelated expression of trehalose6-phosphate synthase gene from the onion maggot,(Diptera: Anthomyiidae). Acta Entomologica Sinica, 2013, 56(4): 329–338 [李源, 赫友進, 張玉娟, 等. 蔥蠅海藻糖6-磷酸合成酶基因的克隆、序列分析及滯育相關(guān)表達. 昆蟲學報, 2013, 56(4): 329–338]

根據(jù)“四看”（看季節(jié)，看天氣，看水質(zhì)，看魚的活動情況）和“四定”（定時，定點，定質(zhì)，定量）原則靈活掌握，合理投餌，確保池魚吃的勻、好、足，降低池魚餌料系數(shù)，增強池魚體質(zhì)，增加魚體免疫力和抗病力，養(yǎng)出的魚規(guī)格大，產(chǎn)量高，肉質(zhì)鮮美，口感好。

Mu M, Lu XK, Wang JJ,. Erratum to: Genome-wide identification and analysis of the stress-resistance function of the TPS (Trehalose-6-Phosphate Synthase) gene family in cotton. BMC Genetics, 2016, 17(1): 1

Nie LH, Ning ZX. Biological protection of trehalose. Chemistry of Life, 2001, 21(3): 206–209 [聶凌鴻, 寧正祥. 海藻糖的生物保護作用. 生命的化學, 2001, 21(3): 206–209]

Pan LQ. The effect of different acclimation temperatures on the prophenoloxidase system and other defence parameters in. Fish and Shellfish Immunology, 2008, 25(1): 137–142

Qian LY, Kou XY, Dong ZH,. Effects of different temperature regimes on the expression of the trehalose-6-phosphate synthase gene and haemolymph sugar content in. Journal of Applied Entomology, 2017, 54(1): 56–67 [騫蕾陽, 寇曉艷, 董澤華, 等. 不同溫度馴化策略誘導(dǎo)優(yōu)雅蟈螽海藻糖合成酶基因表達及血淋巴糖類含量變化. 應(yīng)用昆蟲學報, 2017, 54(1): 56–67]

Qin Z, Wang S, Wei P,. Molecular cloning and cold-induced expression of trehalose-6-phosphate synthase genes in(Coleoptera: Coccinellidae). Acta Entomologica Sinica, 2012, 55(6): 651–658 [秦資, 王甦, 魏蘋, 等. 異色瓢蟲海藻糖合成酶基因的克隆及低溫誘導(dǎo)表達分析. 昆蟲學報, 2012, 55(6): 651–658]

Tang B, Chen J, Yao Q,. Characterization of a trehalose-6- phosphate synthase gene fromand its function identification through RNA interference. Journal of Insect Physiology, 2010, 56(7): 813–821

Tang B, Wang S, Wang SG,. Invertebrate trehalose-6- phosphate synthase gene: Genetic architecture, biochemistry, physiological function, and potential applications. Frontiers in Physiology, 2018, 9: 30–30

Uyar EO, Yücel M, Hamamc? H. Cloning and expression of trehalose-6-phosphate synthase 1 from. Journal of Basic Microbiology, 2015, 56(5): 459–468

Wang GL, Zhao G, Feng YB,. Cloning and comparative studies of seaweed trehalose-6-phosphate synthase genes. Marine Drugs, 2010, 8(7): 2065–2079

Wu X, Hou Z, Huang C,. Cloning, purification and characterization of trehalose-6-phosphate synthase from. PeerJ, 2018, 6(7): e5230

Wyban J, Walsh WA, Godin DM. Temperature effects on growth, feeding rate and feed conversion of the Pacific white shrimp (). Aquaculture, 1995, 138(1): 267–279

Yang F, Cai Q, Ye FX,. A demonstration of closed-type ecological farming of. Journal of Fisheries of China, 2001(11): 56–59 [楊鋒, 蔡強, 葉妃軒, 等. 關(guān)于南美白對蝦的養(yǎng)殖技術(shù)之一南美白對蝦封閉式生態(tài)養(yǎng)殖試驗示范. 中國水產(chǎn), 2001(11): 56–59]

Zhang BJ, Xuan JS. Electron cloning of full-length cDNA of 6-phosphate trehalose synthase gene from seaweed. Bioinformatics, 2008(1): 8–10 [張冰君, 宣勁松. 條斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因全長cDNA的電子克隆. 生物信息學, 2008(1): 8–10]

Zhang J, Li F, Sun Y,. A trehalose-6-phosphate synthase gene from Chinese shrimp,. Molecular Biology Reports, 2012, 39(12): 10219–10225

Zhang J, Liu Y, Zhou Y,. Cloning of a trehalose-6-phosphate synthase gene fromand its expression response to bacteria challenge. Fish and Shellfish Immunology, 2019a, 93: 387–394

Zhang Y, Wang F, Feng Q. Involvement of trehalose-6- phosphate synthase in innate immunity of. Developmental and Comparative Immunology, 2019b, 91: 85–92

Expression Characteristics of Trehalose-6-Phosphate Synthase inunder High-Temperature Stress

HU Lijie1,3, LI Xupeng2,3, MENG Xianhong2,3, LUAN Sheng2,3, LUO Kun2,3, SUI Juan2,3, CHEN Baolong2,3, CAO Baoxiang3, CAO Jiawang3, KONG Jie2,3①

(1. College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116023; 2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071; 3. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071)

Trehalose-6-phosphate synthase (TPS) is a key enzyme in trehalose synthesis and plays an important role in the response of organisms to stress. In this study, based on the unigene sequences from transcriptome sequencing ofchallenged with high-temperature stress, the partialcDNA sequence (complete ORF and partial UTR) () was obtained directly by PCR amplification. Sequence analysis revealed that thesequence contained a 2529 bp open reading frame, encoding 842 amino acids with a molecular weight of 95.4 kDa and an isoelectric point of 6.17.had two functional domains, the Glyco-transf-20 domain and the Trehalose_PPase domain. Multiple sequence alignments showed thathad the highest homology with the corresponding gene in, with a similarity value of 63.73%. The phylogenetic tree indicated thatwas closely related tothat of, and clustered with invertebrates, such as,, andVertebrates were clustered onto a signal branch. Quantitative analysis of gene expression levels showed thatwas widely expressed in all of the examined tissues with different expression levels. The gill and muscle had similar levels and the highest expression. The expression of the eye stalk, heart, and nerve was next, being significantly lower than that of gill and muscle (0.05). The expression in the hepatopancreas was the lowest, being significantly lower than that of the other five tissues (<0.05).kept at 26℃ were used as control group. When the temperature was increased to 32℃, thegene in the eye stalk and heart was significantly increased (0.05). When the temperature was increased to 38℃, the expressionof thegene significantly rose in gill, hepatopancreas, eye stalk, and heart (0.05). Expression in the hepatopancreas was significantly changed. Thereafter, the expression of thegene decreased when the temperature decreased. When the temperature was returned to 32℃ and 26℃, the expression of thegene in the six tissues was not significantly different from that of the control group. There was no significant difference in expression under different levels of temperature stress in the nerve and muscle. The above results indicated thatwas closely related to the response to high-temperature stress. This study provided basic data for the analysis of the mechanism of the response to high-temperature stress in.

Trehalose-6-phosphate synthase;; High temperature stress; Gene expression

S917.4

A

2095-9869(2020)02-0159-09

孔 杰, 研究員, E-mail: kongjie@ysfri.ac.cn

2019-10-25,

2019-11-18

* 國家自然科學基金聯(lián)合基金項目(U1706203)、山東省農(nóng)業(yè)良種工程(2017LZN011)、泰山學者山東省良種工程項目和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(CARS-48)共同資助 [This work was supported by the Joint Fund of the National Natural Science Foundation of China (U1706203), Shandong Province Agricultural Seed Improvement Project (2017LZN011), Taishan Scholar Program for Seed Industry, and China Agriculture Research System (CARS-48)]. 胡利杰，E-mail: hulijie05@foxmail.com

10.19663/j.issn2095-9869.20191025003

http://www.yykxjz.cn/

胡利杰, 李旭鵬, 孟憲紅, 欒生, 羅坤, 隋娟, 陳寶龍, 曹寶祥, 曹家旺, 孔杰. 凡納濱對蝦6-磷酸海藻糖合成酶在抗高溫脅迫中的表達特征. 漁業(yè)科學進展, 2020, 41(2): 159–167

Hu LJ, Li XP, Meng XH, Luan S, Luo K, Sui J, Chen BL, Cao BX, Cao JW, Kong J. Expression characteristics of trehalose-6- phosphate synthase inunder high-temperature stress. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(2): 159–167

KONG Jie, E-mail: kongjie@ysfri.ac.cn

(編輯 馮小花)