鱈魚魚鰾抗氧化肽制備工藝研究*

李 娜 周德慶 劉 楠 王珊珊 馬玉潔

鱈魚魚鰾抗氧化肽制備工藝研究*

李 娜1,2周德慶1①劉 楠1王珊珊1馬玉潔1

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海 201306)

本研究以鱈魚()魚鰾為原料，選用6種不同蛋白酶對其進行酶解，通過比較酶解液的水解度與對DPPH自由基的清除能力，篩選出最佳蛋白酶為復(fù)合蛋白酶。通過單因素實驗與響應(yīng)面優(yōu)化實驗，確定最佳提取工藝：酶解時間為6 h、pH為7.21、溫度為58.56℃、酶添加量為200 U/ml。研究結(jié)果顯示，DPPH自由基清除率為61.1%，與理論值62.0%接近。鱈魚魚鰾肽體外清除自由基能力實驗發(fā)現(xiàn)，酶解產(chǎn)物對羥基自由基與超氧陰離子自由基具有一定的清除能力，同時，具有較好的亞鐵離子螯合能力。體外模擬胃腸消化后多肽的抗氧化活性變化，結(jié)果顯示，體外模擬消化產(chǎn)物水解度有增加，對自由基的清除能力與亞鐵離子螯合能力有一定的下降，其可能原因為，經(jīng)模擬胃腸消化后多肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化，導(dǎo)致了抗氧化活性的變化。

響應(yīng)面；鱈魚魚鰾；抗氧化肽；抗氧化活性

魚鰾作為一種高蛋白、低脂肪且含有較豐富礦物質(zhì)的重要水產(chǎn)食品資源，素有“海洋人參”的美譽，具有很好的滋補作用與藥用價值(張寶等, 2010; Onouma, 2015; 劉姝等, 2009)，但目前對魚鰾開發(fā)利用十分有限，大量的魚鰾常常被作為下腳料舍棄(Onouma, 2014)。大西洋鱈魚()年產(chǎn)量較大(孫曉飛等, 2017)，據(jù)FAO最新統(tǒng)計， 2016年大西洋鱈魚的全球捕撈量達1,329,450 t，而其魚鰾的質(zhì)量約占魚體質(zhì)量的1%，可見大西洋鱈魚魚鰾的年產(chǎn)量也達13,295 t。目前，對大西洋鱈魚魚鰾的開發(fā)利用較少，多為凍鮮品直接銷售或作為副產(chǎn)物生產(chǎn)魚粉。因此，當(dāng)下以鱈魚魚鰾為原料，研究開發(fā)高值化利用新途徑顯得十分迫切。

研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與消除失去平衡時，多余的氧自由基會導(dǎo)致細(xì)胞損傷，引起衰老、癌癥等疾病(Rahman, 2018; Wu, 2018; Gallego, 2018)。已有大量研究表明，通過酶解得到的介于一定分子量范圍的多肽，具有很好的抗氧化活性，能有效清除體內(nèi)多余自由基(趙玲等, 2013)，且與傳統(tǒng)的化學(xué)合成物作為主要來源的抗氧化劑相比，海洋生物來源的抗氧化肽具有較好抗氧化活性且對人體無害，更有益于人體健康。天然多肽將會成為越來越多消費者的選擇(Atef, 2017; Shavandi, 2017)。本研究以鱈魚魚鰾為原料，采用酶解法與響應(yīng)面優(yōu)化法獲得鱈魚魚鰾抗氧化肽制備工藝參數(shù)，驗證其酶解產(chǎn)物的體外抗氧化活性及體外胃腸模擬消化的穩(wěn)定性，建立酶解制備抗氧化肽的最佳工藝技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大西洋鱈魚魚鰾(凍鮮品)平均質(zhì)量為10.44 g/只，由山東省青島海洋兄弟食品有限公司提供。1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)購于上海如吉生物公司；酸性蛋白酶(50 U/mg)、中性蛋白酶(60 U/mg)和木瓜蛋白酶(500 U/mg)購于北京博奧拓達科技有限公司，復(fù)合蛋白酶(100 U/mg)、胃蛋白酶(500 U/mg)和胰蛋白酶(250 U/mg)購于北京索萊寶科技有限公司；可見分光光度計購于上海元析儀器有限公司；pH計購于梅特勒-托利多(上海)有限公司。

1.2 基本營養(yǎng)成分測定

采用國標(biāo)方法對鱈魚魚鰾原材料進行基本營養(yǎng)成分測定，具體參照：水分GB 5009.3-2016；脂肪GB 5009.6-2016；粗蛋白含量GB 5009.5-2016；灰分GB 5009.4-2016；總糖含量GB/T 9695.31-2008。

1.3 鱈魚魚鰾抗氧化肽的制備

1.3.1 鱈魚魚鰾預(yù)處理 將鱈魚魚鰾清洗后剪成約為0.5 cm×0.5 cm的小塊，加入10倍體積的 0.1 mol/L NaOH溶液攪拌浸泡24 h，然后，用蒸餾水洗至中性；再加入10倍體積的10%正丁醇溶液攪拌浸泡24 h進行脫脂，然后用蒸餾水沖洗干凈。將預(yù)處理好的鱈魚魚鰾加入10倍體積的蒸餾水進行勻漿備用(Liu, 2014)。

1.3.2 蛋白酶的篩選 分別選用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶6種蛋白酶，同時以單純的熱水抽提作對照，以酶解液對DPPH自由基的清除率為主要指標(biāo)，水解度(DH)為輔助指標(biāo)選擇最佳提取劑。查閱文獻確定各種酶的最適酶解條件(表1)，根據(jù)純度與酶活，選定加酶量為100 U/ml。

1.3.3 單因素實驗 篩選出最佳蛋白酶后，對酶解時間、pH、溫度與酶的濃度進行單因素實驗，以酶解液對DPPH的清除率為確定指標(biāo)，以確定單因素的水平范圍。

1.3.4 DPPH自由基清除率測定 2 ml鱈魚魚鰾抗氧化肽(SWP)水溶液加入2 ml 0.5 mmol/L DPPH的乙醇溶液混合搖勻后，暗處反映30 min，于波長517 nm下檢測其吸光度。以0.1、0.25、0.5、1.0和2.0 mg/ml GSH水溶液做陽性對照，空白對照組以2 ml蒸餾水代替試樣溶液，每個濃度均做3個重復(fù)(Takaidza, 2018)。清除率用下式計算：

清除率(%)= [1–(sample–blank)/control] × 100%

式中，sample為試樣平均吸光度，control對照的平均吸光度(蒸餾水代替樣品)，blank空白的平均吸光度(乙醇代替DPPH溶液)。

表1 鱈魚魚鰾酶解條件

Tab.1 Parameters for enzymatic hydrolysis of cod swimming bladder

1.3.5 水解度測定 采用甲醛滴定法對蛋白質(zhì)的水解度進行測量。取10 ml的酶解液加入等體積的去離子水，調(diào)節(jié)溶液PH至7.0后，加入10 ml 38%的甲醛溶液，混合均勻。用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至PH 9.5，記錄消耗的NaOH溶液體積，同時用去離子水代替酶解液做對照，記錄NaOH溶液體積(楊文博等, 2014)。水解度按下式計算：

式中，-NH2含量根據(jù)滴定消耗的NaOH的量即可換算出；為凱氏定氮所測值；為原料中游離-NH2含量；tot為每1 g鱈魚魚鰾肽中肽鏈當(dāng)量數(shù)，經(jīng)氨基酸含量測定后計算為9.48 mmol/g。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化實驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design-expert 8.0軟件Box-behnken中心組合實驗設(shè)計原理，設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗 (表2)，根據(jù)實驗結(jié)果確定復(fù)合蛋白酶酶解法提取鱈魚魚鰾肽的最佳提取工藝參數(shù)(陳曉彤等, 2018)。

1.4 體外清除自由基能力測定

將酶解產(chǎn)物的凍干品進行體外清除自由基實驗，包括羥基自由基清除實驗、超氧陰離子自由基清除實驗、總還原能力測定與鐵離子結(jié)合實驗，以檢測鱈魚魚鰾肽的體外抗氧化活性，同時，以谷胱甘肽(GSH)作為陽性對照。

表2 響應(yīng)面因素及水平表

Tab.2 Factor and levels of response surface methodology

1.4.1 羥基自由基清除率測定 2 ml SWP水溶液加入1 ml 1.5 mmol/L FeSO4, 0.7 ml 6 mmol/L H2O2, 0.3 ml 225 mmol/L 水楊酸。37℃水浴加熱1 h后，于562 nm下測定吸光度值(Liu, 2018)。清除率用下式計算：

清除率(%) = [1–(sample–blank)/control] × 100%

式中，sample為試樣平均吸光度，control對照的平均吸光度(蒸餾水代替樣品)，blank空白的平均吸光度(蒸餾水代替H2O2溶液)。

1.4.2 超氧陰離子自由基清除率測定 1 ml SWP 水溶液加入1.25 ml 50 mmol/L Tris-HCl (pH=8.2)。 25℃孵育20 min后，加入0.5 ml 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，5 min后，加入0.2 ml 10 mol/L HCl，于320 nm下測定吸光度(Li, 2016)。

清除率用下式計算：

清除率(%) = [1–(sample–blank)/control] ×100%

式中，sample為試樣平均吸光度，control對照的平均吸光度(蒸餾水代替樣品)，blank空白的平均吸光度(蒸餾水代替鄰苯三酚溶液)；

1.4.3 亞鐵離子螯合能力測定 樣品用MES溶液(10 mmol/L, pH=5.5)配制0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 mg/ml的濃度，取不同濃度的樣品溶液1.96 ml，加入0.28 ml的0.2 mmol/L FeSO4·7H2O溶液，混合后37℃水浴3 h，后加入0.56 ml菲咯嗪溶液 (5 mmol/L)，在室溫下放置10 min，于562 nm處檢測吸光度值(Zhang, 2018a)。

螯合率(%) = [1–(sample–blank)/control]×100%

式中，sample為試樣平均吸光度，control對照的平均吸光度(蒸餾水代替樣品)，blank空白的平均吸光度(蒸餾水代替FeSO4·7H2O溶液)。

1.5 體外模擬消化活性變化

食物從口腔進入人體后，先后在胃與腸道中被消化，通過參照Zhu等(2014)可構(gòu)建體外模擬胃腸消化環(huán)境，檢測鱈魚魚鰾肽被人體攝入后的穩(wěn)定性變化。

1.5.1 體外模擬胃消化 將SWP按照10 mg/ml溶解在蒸餾水中，用0.5 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2.0，37℃水浴20 min，按酶與底物1∶40的比例加入胃蛋白酶，37℃水浴攪拌20 min后胃消化階段結(jié)束。用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.5終止胃蛋白酶反應(yīng)。并取出部分溶液凍干，以備后續(xù)實驗使用。

1.5.2 體外模擬腸消化 將胃消化階段剩余液體37℃預(yù)熱15 min，酶與底物按照1∶25的比例加入胰酶，繼續(xù)37℃條件下反應(yīng)120 min，反應(yīng)結(jié)束后，將樣品加熱到100℃持續(xù)10 min滅活酶、終止反應(yīng)，凍干后貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 體外模擬胃腸消化產(chǎn)物抗氧化活性變化 對胃消化與腸消化產(chǎn)物的凍干品進行水解度測定與體外清除自由基能力測定，比較模擬消化前后鱈魚魚鰾肽的抗氧化活性變化情況。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Design-expert 8.0.6和Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 基本營養(yǎng)成分組成分析

鱈魚魚鰾基本營養(yǎng)成分組成如表3所示，其鮮品中水分含量較高，約為76%；脂肪含量與總糖含量較低，分別為0.55%與1.02%，主要營養(yǎng)成分為蛋白質(zhì)，占樣品鮮重的22.08% (占干重達91%)，表明鱈魚魚鰾是一種低脂肪高蛋白食品原料。

表3 鱈魚魚鰾基本營養(yǎng)成分

Tab.3 Essential nutrient of cod swimming bladder

2.2 蛋白酶的篩選

對蛋白酶的篩選，本研究選用了6種酶與單純的熱水抽提進行比較。經(jīng)查閱文獻確定各種酶的最適溫度與最適pH，100 U/ml的加酶量條件下水解4 h，選用了DPPH自由基清除率與水解度作為評價指標(biāo)。實驗結(jié)果如圖1顯示，復(fù)合蛋白酶水解液的DPPH自由基清除率與水解度都是最高的，且在酶解后對酶解液進行過濾過程中，復(fù)合蛋白酶組的酶解液濾過速度最快，可判斷復(fù)合蛋白酶的酶解效果更佳，因此，選用的蛋白酶為復(fù)合蛋白酶。

圖1 蛋白酶篩選

1: 酸性蛋白酶; 2: 中性蛋白酶; 3: 胃蛋白酶; 4: 木瓜蛋白酶; 5: 復(fù)合蛋白酶; 6: 胰酶; 7: 熱水(對照)

1: Acid proteinase; 2: Dispase; 3: Pepsin; 4: Papain; 5: Compound proteinase; 6: Trpsin; 7: Hot water (Control)

2.3 單因素實驗

單因素實驗結(jié)果見圖2，結(jié)果顯示，酶解時間、pH、溫度與酶的濃度均對酶解液清除DPPH自由基的能力有較大影響。鱈魚魚鰾酶解液對DPPH自由基的清除能力隨酶解時間的增加而增大，酶解5 h之后趨于平緩；隨pH與酶解溫度的升高呈先增大后減小的趨勢，且在pH為7、溫度為55℃時清除能力最強，可見pH和溫度過高或者過低均會影響酶活性，甚至使酶失活；酶濃度對酶解液清除DPPH自由基的影響是隨濃度的增大呈正相關(guān)的。因此，單因素實驗結(jié)果確定了響應(yīng)面實驗中4個因素的水平范圍。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化

通過Design-expert 8.0軟件對表4的數(shù)據(jù)進行分析，得到結(jié)果表5所示。時間(<0.01)和酶添加量(<0.01)對抗氧化肽提取影響顯著。以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，得到回歸方程：

DPPH清除率=–941.15–21.58+213.49+7.38+ 0.46–2.37+0.32–0.004–0.32–0.03+ 0.0008+2.572–11.992–0.062–0.062

經(jīng)方差分析結(jié)果，上述回歸方程與響應(yīng)面值之間的關(guān)系模型中<0.01是顯著的，失擬項=0.5084不顯著，表明模型充分?jǐn)M合實驗數(shù)據(jù)，所以，可以利用此回歸方程確定最佳制備工藝。軟件分析確定的最佳條件值為：酶解時間為6 h、pH為7.21、溫度為58.56℃、酶添加量為200 U/ml；理論值為62.0%，驗證實驗結(jié)果為61.1%，測定值穩(wěn)定、偏差小，證明該結(jié)果合理可靠。

圖2 單因素實驗

表4 復(fù)合蛋白酶響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

Tab.4 Response surface design and values

表5 回歸模型方差分析

Tab.5 ANOVA for response surface quadratic model

圖3 體外自由基清除能力

2.5 酶解產(chǎn)物體外清除自由基能力測定

按照最佳制備工藝條件酶解，并進行冷凍干燥，獲得鱈魚魚鰾肽SWP，檢測其體外清除自由基能力與亞鐵離子螯合能力。從圖3可以看出，SWP對 DPPH自由基與超氧陰離子自由基具有一定的清除能力，最大清除率分別能到達71.4%和63.6%，IC50分別為8.29和5.03 mg/ml；通過Fenton反應(yīng)，SWP顯示出良好的羥基自由基清除能力，并具有良好的濃度依賴線性關(guān)系，IC50為5.43 mg/ml。SWP與亞鐵離子螯合能力的結(jié)果顯示，鱈魚魚鰾肽具有很好的亞鐵離子螯合能力，在濃度為2 mg/ml時，幾乎可達到與乙二胺四乙酸二鈉相近的螯合性，接近100%，IC50為1.35 mg/ml。

2.6 體外模擬消化產(chǎn)物抗氧化活性變化

經(jīng)體外模擬胃腸消化后，鱈魚魚鰾肽的水解度變化與抗氧化能力變化如圖4和圖5所示。從圖4中可以看出，體外模擬胃消化與腸消化均可使酶解產(chǎn)物的水解度增加，說明胃腸消化過程中的胃蛋白酶與胰酶使酶解產(chǎn)物進一步水解，生成更多的游離氨基。接下來對模擬消化產(chǎn)物進行體外自由基清除實驗，結(jié)果顯示與原酶解產(chǎn)物相比，胃消化液與腸消化液對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力與對鐵離子的結(jié)合能力并無提升(圖5)。

圖4 體外模擬消化產(chǎn)物水解度

1: 胃消化液; 2: 腸消化液; 3: SWP

1: Stomach digestive juices; 2: Intestinal digestive juices; 3: SWP

3 討論

工藝優(yōu)化實驗中選用DPPH自由基清除率作為評價指標(biāo)，通過單因素實驗與響應(yīng)面優(yōu)化法，確定了酶解鱈魚魚鰾獲取多肽的最佳提取工藝，酶解時間為 6 h，pH為7.21，溫度為58.56℃，酶添加量為200 U/ml，所得酶解液的DPPH自由基清除率可達61.1%。向澤敏等(2017)使用復(fù)合蛋白酶對鰹魚()鰾進行酶解，以DPPH自由基清除率為參考指標(biāo)，通過單因素實驗與響應(yīng)面優(yōu)化法獲得最佳工藝參數(shù)：加酶量為8.53 U/mg，酶解pH為5.54，酶解溫度為 50.03℃，酶解時間為5.07 h。此結(jié)果與本研究結(jié)果一致的是復(fù)合蛋白酶都是最優(yōu)蛋白酶，因為復(fù)合蛋白酶具有多個酶切位點，因此，可以獲得更多種類的肽端游離氨基，使其具有更好的自由基清除能力；同時也有一定程度的差異，其可能原因為復(fù)合蛋白酶組成酶種類與配比各不相同，導(dǎo)致其最佳最適酶解溫度與最適pH的不同。

圖5 體外模擬消化產(chǎn)物清除自由基能力

1: 2 mg/ml胃消化液Stomach digestive juices; 2: 2 mg/ml腸消化液Intestinal digestive juices; 3: 2 mg/ml SWP; 4: 1 mg/ml GSH

羥基自由基與超氧陰離子自由基等活性氧自由基能損傷DNA、蛋白質(zhì)等大分子，引發(fā)機體衰老或發(fā)生病變(Zhang, 2018b)。抗氧化體外清除自由基實驗，顯示了本實驗制備的抗氧化肽對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基有一定的清除能力，并有較好的亞鐵離子螯合能力，且自由基清除能力與SWP濃度呈正相關(guān)。涂宗財?shù)?2017)以草魚()魚鰾為原料，通過酶解制備抗氧化多肽，對DPPH自由基與羥基自由基等均具有較好的清除能力，其IC50分別為8.05和3.54 mg/ml。本研究結(jié)果顯示，鱈魚魚鰾抗氧化肽的活性與草魚魚鰾抗氧化肽接近，且本研究對鱈魚魚鰾抗氧化肽清除超氧陰離子自由基與螯合亞鐵離子能力進行了測定，更全面的反映了鱈魚魚鰾肽的體外抗氧化活性。且研究結(jié)果顯示，鱈魚魚鰾肽具備很好的亞鐵離子螯合能力，后期研究可利用此性質(zhì)制備肽-鐵螯合物，為新型的有機鐵元素補充劑提供原料來源。

體外模擬胃腸消化實驗中，獲得了模擬胃消化與模擬腸消化的酶解產(chǎn)物，進而檢測水解度與體外清除自由基的能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)模擬胃腸消化后，酶解產(chǎn)物的水解度是進一步增大的，但其體外清除自由基能力與亞鐵離子結(jié)合能力均有一定程度的下降。此結(jié)果與蛋白酶篩選中的二者關(guān)系趨勢并不一致，在文獻中也有過相同情況的報道(楊文博等, 2014; 杜芬等, 2016)，分析其可能原因為，在模擬胃腸消化過程中，因反應(yīng)條件的變化，如pH值的改變對多肽的組成及結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響，進而改變了多肽的生物活性，具體的變化有待進一步實驗驗證。

本研究通過酶解方法制備了具有一定抗氧化活性的鱈魚魚鰾肽，與傳統(tǒng)發(fā)酵制備方法相比，該法提取效率高，反應(yīng)時間短，條件溫和且所制備的酶解產(chǎn)物抗氧化活性更高。因此，本研究所制備的鱈魚魚鰾肽可作為抗氧化活性肽資源，為開辟魚鰾資源的綜合開發(fā)與高值化利用提供了理論及技術(shù)支撐。

Atef M, Ojagh SM. Health benefits and food applications of bioactive compounds from fish byproducts: A review. Journal of Functional Foods, 2017, 35: 673–681

Chen XT, Huang LP, Sun M,. Optimization of conversion process of α-cyclodextrin with enzyme using response surface methodology. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(5): 143–151 [陳曉彤, 黃立萍, 孫謐, 等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化α-環(huán)糊精的酶轉(zhuǎn)化工藝. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2018, 39(5): 143–151]

Du F, Hou H, Zhao YR,. Stability of Alaska Pollock-derived metal chelating peptide duringgastrointestinal digestion. Modern Food Science and Technology, 2016, 32(7): 33–38 [杜芬, 侯虎, 趙玉然, 等. 鱈魚源金屬螯合肽體外模擬胃腸消化穩(wěn)定性研究. 現(xiàn)代食品科技, 2016, 32(7): 33–38]

Gallego M, Mora L, Toldrá F. Characterisation of the antioxidant peptide AEEEYPDL and its quantification in Spanish dry-cured ham. Food Chemistry, 2018, 258: 8–15

Li N, Shen XR, Liu YM,. Isolation, characterization, and radiation protection ofL. polysaccharide. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 83: 288–296

Liu DS, Liang L, Regenstein JM,. Extraction and characterisation of pepsin-solubilised collagen from fins, scales, skins, bones and swim bladders of bighead carp (). Food Chemistry, 2014, 133(4): 1441–1448

Liu S, Yu B. Peptides from variegated carp () swim bladder: Fermentation production and assessment of antioxidant properties. Food Science, 2009, 30(21): 58–62 [劉姝, 余勃. 發(fā)酵法制備魚鰾多肽及其抗氧化活性研究. 食品科學(xué), 2009, 30(21): 58–62]

Liu Y, Sun YY, Huang GL. Preparation and antioxidant activities of important traditional plant polysaccharides. International Journal of Biological Macromolecules, 2018, 111: 780–786

Onouma K, Scoottawat B. Effect of ethanolic extract of coconut husk on gel properties of gelatin from swim bladder of yellowfin tuna. LWT-Food Science and Technology, 2015, 62(2): 955–961

Onouma K, Soottawat B, Thammarat K,. Characteristics of collagens from the swim bladders of yellowfin tuna ().Food Chemistry, 2014, 155: 264–270

Rahman MS, Choi YH, Choi YS,. A novel antioxidant peptide, purified from, showed strong antioxidant potential via Nrf-2 mediated heme oxygenase-1 expression. Food Chemistry, 2018, 239: 502–510

Shavandi A, Hu ZH, Teh SS,. Antioxidant and functional properties of protein hydrolysates obtained from squid pen chtosan extraction effluent. Food Chemistry, 2017, 227: 194–201

Wu RB, Wu CL, Liu D,. Antioxidant and anti-freezing peptides from salmon collagen hydrolysate prepared by bacterial extracellular protease. Food Chemistry, 2018, 248: 346–352

Sun XF, Jiang D, Wan C,. A new SYBR Green fluorescent PCR method for rapid identification ofand its products. Journal of Northeast Normal University (Natural Science), 2017, 49(3): 127–130 [孫曉飛, 蔣丹, 萬超, 等. 建立一種快速鑒定大西洋鱈魚及其制品的SYBR Green 熒光PCR方法. 東北師大學(xué)報(自然科學(xué)版), 2017, 49(3): 127–130]

Takaidza S, Mtunzi F, Pillay M. Analysis of the phytochemical contents and antioxidant activities of crude extracts from Tulbaghia species. Journal of Traditional Chinese Medicine， 2018, 38(2): 272–279

Tu ZC, Tang PP, Zheng TT,. Optimization of swimming bladder collagen peptide preparation using response surface methodology and its antioxidant activity research. Food and Fermentation Industries, 2017, 43(5): 160–166 [涂宗財, 唐平平,鄭婷婷, 等. 響應(yīng)面優(yōu)化魚鰾膠原肽制備工藝及其抗氧化活性研究. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2017, 43(5): 160– 166]

Xiang ZM, Qiu XT, Lou YJ,. Methodology of the preparation of enzymatic hydrolysates with antioxidant activity of skipjack tuna () swim bladder protein. Journal of Fisheries of China, 2017, 41(6): 962–970 [向澤敏, 邱曉挺, 婁永江, 等. 鰹鰾蛋白抗氧化酶解物制備工藝. 水產(chǎn)學(xué)報, 2017, 41(6): 962–970]

Yang WB, Zhang YH. Study on the determination methods for hydrolysis degree of protein. China Condiment, 2014, 39(3): 88–90 [楊文博, 張英華. 蛋白質(zhì)水解度的測定方法研究. 中國調(diào)味品, 2014, 39(3): 88–90]

Zhang B, Chen YZ, Xu Y,. Characterization of collagens from swim bladders of grass carp. Food Science, 2010, 31(1): 58–62 [張寶, 陳運中, 徐穎. 等. 草魚魚鰾膠原性質(zhì)的研究. 食品科學(xué), 2010, 31(1): 58–62]

Zhang L, Hu Y, Duan XY,. Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms. International Journal of Biological Macromolecules, 2018a, 113: 1–7

Zhang ZS, Wang XM, Su HL,. Effect of sulfated galactan fromon H2O2-induced premature senescence in WI-38 cells. International Journal of Biological Macromolecules, 2018b, 106: 1235–1239

Zhao L, Geng XX, Liu Q,. Antioxidant activity of polypeptide from sea cucumber cooking water. Progress in Fishery Sciences, 2013, 34(5): 69–73 [趙玲, 耿曉曉, 劉淇, 等.海參水煮液酶解多肽的抗氧化活性. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2013, 34(5): 69–73]

Zhu CZ, Zhang WG, Kang ZL,. Stability of an antioxidant peptide extracted from Jinhua ham. Meat Science, 2014, 96(2): 783–789

Research on Preparation of Antioxidant Peptides from Cod Swim Bladder

LI Na1,2, ZHOU Deqing1①, LIU Nan1, WANG Shanshan1, MA Yujie1

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Laboratory of Marine Drugs and Bioproducts Products, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao) , Qingdao 266071; 2. College of Food Sciences and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

To reduce the wastage of aquatic resources and improve the additional value of cod swim bladder, we determined the optimum technological conditions for antioxidant peptides from the cod swim bladder and observed the changes in antioxidant activities after being digested. Six kinds of proteases, namely, acid proteinase, dispase, pepsin, papain, compound proteinase, and trypsin, were used to hydrolyze the cod swim bladder in order to select the optimal protease by determining the degree of hydrolysis and DPPH radical scavenging rate. Combining the single factor method and response surface methodology, the optimum process was ensured at the hydrolysis temperature of 58.56℃, hydrolysis time of 6 h, pH of 7.21, and enzyme addition of 200 U/ml. The results of the confirmatory experiment showed that the scavenging rate of DPPH was 61.1%, which agreed with the predicted value of 62.0%, and the results proved that the optimized extraction process was stable and reliable. The free radical scavenging rates of peptides were detected, and the results showed that swim bladder peptides have good abilities of scavenging free radicals of DPPH, OH, O2-, and chelating Fe2+. Besides, the half maximal inhibitory concentration (IC50) of these was 8.29 mg/ml, 5.03 mg/ml, 5.43 mg/ml, and 1.35 mg/ml, respectively. After being digested, the degree of hydrolysis increased while the free radicals scavenging abilities and chelating power of Fe2+decreased. This might have occurred because the changes of reaction conditions in the simulated gastrointestinal digestion process such as the change of pH value lead to the changes of composition and structure of the peptides. Meanwhile, the changes of composition and structure lead to the changes in antioxidant activities. In conclusion, swim bladder peptides had potent antioxidants and could serve as useful ingredients in the food industry.

Response surface methodology; Cod swim bladder;Antioxidant peptides; Antioxidant activity

周德慶，研究員，E-mail: zhoudq@ysfri.ac.cn

2019-01-24,

2019-02-21

S985.1

A

2095-9869(2020)02-0191-09

* 中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費項目(2016HY-ZD0801)、中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費專項(20603022018012)和山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題(2016)共同資助[This work was supported by Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2016HY-ZD0801), Fundamental Research Funds for Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences (20603022018012), and Shandong Agricultural Major Application Technology Innovation (2016)]. 李 娜，E-mail：lina251821@163.com

10.19663/j.issn2095-9869.20190124002

http://www.yykxjz.cn/

李娜, 周德慶, 劉楠, 王珊珊, 馬玉潔. 鱈魚魚鰾抗氧化肽制備工藝研究. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2020, 41(2): 191–199

Li N, Zhou DQ, Liu N, Wang SS, Ma YJ. Research on preparation of antioxidant peptides from cod swim bladder. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(2): 191–199

ZHOU Deqing, E-mail: zhoudq@ysfri.ac.cn

(編輯 陳 輝)