基因編輯CRISPR/Cas9技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用

宋麗莉，黃艷娜，蔣 瑋，鄭洪建，趙子軼，唐雪明*

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心(上海)，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海 201106；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所，CIMMYT-中國特用玉米研究中心，上海201403；3上海容暉生物科技有限公司，上海200231)

隨著世界人口的增長和氣候的變化，如何提高作物的產(chǎn)量和質(zhì)量是科研工作者面臨的重要問題。作物改良育種主要依賴于遺傳變異(自然誘變，物理誘變和化學(xué)誘變劑誘變)、T-DNA(Transfer DNA)插入突變或轉(zhuǎn)座子標簽。近年來，新興的基因組編輯技術(shù)在作物改良方面取得了顯著的成果?；蚓庉嫾夹g(shù)是序列特異核酸酶在基因組水平上對靶標基因進行定向、準確修飾的一種基因工程方法。本文主要介紹CRISPRCas9基因編輯系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)特征、工作原理、在作物基因功能研究和作物育種方面的應(yīng)用以及該技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用潛力和發(fā)展前景。

1 基因編輯技術(shù)概述

目前，基因編輯技術(shù)應(yīng)用中的關(guān)鍵工程核酸酶主要分為3類，分別是類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)、鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFNs)以及新近發(fā)展的CRISPRCas系統(tǒng)(The clustered regularly interspersed shortpalindromic repeatsCRISPR-associated)?；蚓庉嫾夹g(shù)通過序列特異性核酸酶識別、錨定基因組上的靶標位點序列，切割目標DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂，通過同源重組或非同源末端連接進行DNA修復(fù)，使基因組特定位點出現(xiàn)堿基缺失、插入或替換，進而實現(xiàn)對基因組的定向修飾[1]。ZFNs和TALENs主要通過DNA識別結(jié)構(gòu)域(ZF或TAL效應(yīng)子)與核酸酶結(jié)構(gòu)域的融合而形成嵌合蛋白，由于組裝ZFNs和TALENs的DNA識別結(jié)構(gòu)域的表達單元比較復(fù)雜，靶點切割效率較低，而CRISPR技術(shù)通過一段向?qū)NA和配套的核酸酶對特定的基因組序列進行定點編輯，具有操作簡單、編輯高效、成本低廉等優(yōu)點。目前，CRISPR 基因編輯技術(shù)廣泛應(yīng)用于模式植物(擬南芥、煙草)[2-3]和一些主要農(nóng)作物(水稻、小麥、玉米等)[4]，促進了植物基因功能研究和預(yù)期農(nóng)藝性狀的選擇。

2 CRISPRCas9系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)特征及工作原理

2.1 基本結(jié)構(gòu)特征

2.2 工作原理

CRISPR 系統(tǒng)是細菌的一套免疫系統(tǒng)，用于對抗噬菌體或其他病毒的侵染。該系統(tǒng)分為3個類型(Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型)，其中Ⅰ型和Ⅲ型CRISPRCas系統(tǒng)較為復(fù)雜，需要多個Cas蛋白形成復(fù)合體切割DNA雙鏈，而CRISPRCasⅡ型系統(tǒng)只需要一個Cas9蛋白核酸酶來切割DNA雙鏈。CRISPRCasⅡ型系統(tǒng)由Cas9蛋白核酸酶、CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)組成。當(dāng)噬菌體或其他病毒侵染宿主時，外源DNA中特定的前間隔序列和其鄰近基序?qū)⒈凰拗鞯腃RISPR系統(tǒng)識別，宿主將形成“記憶”，即將重復(fù)片段和這一段新的間隔序列插在前導(dǎo)序列和第一個重復(fù)序列之間，將其整合進入CRISPR 系統(tǒng)。當(dāng)同一噬菌體或其他病毒再次侵染時，在前導(dǎo)序列作用下，CRISPR 序列通過轉(zhuǎn)錄、加工形成小crRNA，然后與tracrRNA復(fù)合體形成sgRNA(Single guide RNA)。最后，在sgRNA的作用下，tracrRNA引導(dǎo)CRISPRCas9蛋白識別和切割靶基因，Cas9蛋白復(fù)合體通過干擾入侵的噬菌體或其他病毒的DNA 序列，使宿主免受同一噬菌體或其他病毒的二次侵害[6]。

3 CRISPRCas9基因編輯技術(shù)在基因功能研究中的應(yīng)用

非同源末端連接是用來修復(fù)植物DNA雙鏈斷裂的主要途徑，該過程通常會產(chǎn)生小于100 bp序列的缺失或插入。編碼區(qū)序列缺失或插入將產(chǎn)生移碼突變，導(dǎo)致基因功能喪失，這種突變在植物后代可以穩(wěn)定遺傳。

3.1 單堿基突變

基因編輯技術(shù)解決了單堿基定點突變材料獲得難的問題。借鑒哺乳動物單堿基編輯方法，Zong等[7]成功構(gòu)建了高效植物單堿基編輯系統(tǒng)nCas9-PBE，并在小麥、水稻和玉米三大重要農(nóng)作物基因組中實現(xiàn)了高效、精確的單堿基定點突變。D’Ambrosio C等[8]利用CRISPRCas9技術(shù)分別對番茄類胡蘿卜素生物合成關(guān)鍵基因Psy1和CrtR-b2進行編輯，獲得單堿基插入或缺失的突變體。Hua等[9]等開發(fā)的一系列堿基編輯器實現(xiàn)了對水稻基因組DNA四種堿基的編輯替換，這對水稻基因功能解析和現(xiàn)代分子育種研究具有重大推進作用。

3.2 多重基因突變

多重基因編輯不僅可以用于基因家族功能的研究，還可以快速聚合農(nóng)作物的多個性狀。Xiong等[10]利用CRISPRCas9系統(tǒng)靶向油菜果膠酯酶基因Bra003491，Bra007665和Bra014410，并成功獲得兩個目標基因突變的株系。Zhu等[11]利用CRISPRCas9系統(tǒng)成功地獲得擬南芥CBF1、CBF2和CBF3基因同時突變的植株。

4 CRISPRCas9基因編輯技術(shù)在作物改良上的應(yīng)用

基因編輯技術(shù)作為高效的輔助育種手段已被用于改良作物性狀(表1)，包括提高作物產(chǎn)量、作物營養(yǎng)品質(zhì)，抗病性等[12-14]。

4.1 作物產(chǎn)量

作物的產(chǎn)量受籽粒數(shù)量、大小和重量等影響[15]。敲除負調(diào)控水稻產(chǎn)量的基因，如GS3、DEP1、GS5、GW2、Gn1a和TGW6，是提高作物產(chǎn)量的一種簡單、直接的方式[16]。Xu等[17]利用CRISPR技術(shù)同時敲除GW2、GW5和TGW6基因獲得的水稻三突變體千粒重增加29.8%。GASR7是核寬度和重量的負調(diào)節(jié)因子，利用CRISPRCas9敲除面包小麥GASR7三個同源基因的突變體千粒重有所增加[18]。然而，增加單株千粒重并不一定能提高作物產(chǎn)量，還需通過大規(guī)模田間試驗驗證。

4.2 作物營養(yǎng)品質(zhì)

Sun等[19]通過CRISPRCas9技術(shù)敲除淀粉分支酶基因SBEI和SBEIIb，獲得的大米直鏈淀粉含量高。玉米Waxy(Wx)基因編碼顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)，負責(zé)籽粒直鏈淀粉合成，野生型玉米籽粒支鏈淀粉和直鏈淀粉含量分別為75%和 25%，而wx/wx突變株糯玉米支鏈淀粉含量近100%[20]。Zhang等[21]利用CRISPRCas9技術(shù)敲除Waxy基因，獲得了有經(jīng)濟價值的糯稻。黃忠明[15]利用CRISPRCas9技術(shù)對TMS5基因進行編輯，發(fā)現(xiàn)水稻對溫度的敏感閾值快速升高。孫慧宇等[22]利用CRISPRCas9技術(shù)對Badh2基因進行編輯，改良了粳稻的香味。FAD2基因家族調(diào)控油酸(單不飽和脂肪酸)向亞油酸的轉(zhuǎn)化[23]，Abe等[24]利用CRISPRCas9技術(shù)獲得OsFAD2-1基因敲除純合水稻，發(fā)現(xiàn)突變體油酸含量增加，且未檢測出亞油酸。

4.3 抗病

植物病害不僅影響作物產(chǎn)量，還影響許多作物的鮮食生產(chǎn)和食品加工與安全。通過對MLO基因家族成員進行基因編輯，獲得的mlo基因缺失突變體對小麥白粉菌(Bgt)引起的白粉病具有較持久的抗性。經(jīng)CRISPRCas9修飾番茄SIMLO1基因后，提高了番茄對白粉病的抗性[25]。Kis等[26]利用CRISPRCas9技術(shù)創(chuàng)建的大麥對小麥矮縮病毒具有高效抗性。真核翻譯起始因子eIF4E是維持植物生命周期RNA病毒寄主因子。利用CRISPRCas9技術(shù)對eIF4E基因進行編輯，獲得的黃瓜突變體具有抗病毒性[27]。柑橘CsLOB1是宿主疾病易感基因，該基因促進病原菌的生長形成膿皰，Jia等[28]利用CRISPRCas9靶定CsLOB1基因，獲得了抗?jié)儾〉母涕僦仓?。Shao 等[29]利用CRISPRCas9技術(shù)對MaGA20ox2基因進行編輯獲得具有抗倒伏性狀的半矮稈香蕉。

表1 CRISPRcas9基因編輯技術(shù)在作物改良中的應(yīng)用

Table 1 Application of CRISPRcas9 genome editing for crop improvement

表1 CRISPRcas9基因編輯技術(shù)在作物改良中的應(yīng)用

作物基因修飾方式表型水稻TMS5[15]基因敲除溫度敏感閾值增加水稻GW2∕GW5∕TGW6[17]基因敲除增加產(chǎn)量水稻SBEI and SBEIIb[19]基因敲除直鏈淀粉含量高水稻W(wǎng)axy[21]基因敲除糯性增加水稻Badh2[22]基因敲除改變香味水稻FAD2-1[24]基因敲除油酸含量增加水稻EPSPS[30]基因敲除抗除草劑玉米Waxy[20]基因敲除糯性增加小麥GASR7[18]基因敲除千粒重有所增加大麥WDV[26]基因敲除抗小麥矮縮病毒黃瓜Eif4e[27]基因敲除抗病毒柑橘CsLOB1[28]干擾啟動子抗?jié)儾》裇IMLO1[25]基因敲除抗白粉病番茄Psy1∕ CrtR-b2[8]基因敲除類胡蘿卜素增加油菜Bra003491∕Bra007665∕ Bra014410[10]基因敲除果膠酯增加香蕉MaGA20ox2[29]基因敲除抗倒伏

4.4 抗除草劑

EPSPS基因編碼5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶，參與芳香族氨基酸生物合成，是植物生存所必需的合成酶。草甘膦是一種廣泛使用的除草劑，它可以結(jié)合EPSPS功能位點阻止其活動。EPSPS基因經(jīng)CRISPRCas9系統(tǒng)編輯后，亞麻抗草甘膦耐受性顯著提高。利用同樣的方法對EPSPS基因進行堿基替換，可獲得抗草甘膦水稻植株[30]。

ALS是編碼乙酰乳酸合成酶的基因，參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等支鏈氨基酸的生物合成[3]。ALS抑制劑泛指除草劑，包括磺酰脲類，咪唑啉酮，三唑并嘧啶和磺酰氨基羰基三唑啉酮，通過慢慢“餓死”這些氨基酸進而導(dǎo)致植物DNA合成受到抑制。ALS保守區(qū)域特定的點突變，可提高植物對除草劑的抗性。Svitashev等[31]利用CRISPRCas9技術(shù)定點編輯ALS基因獲得抗除草劑的玉米、大豆、水稻植株。

5 展望

近期，美國農(nóng)業(yè)部裁定經(jīng)CRISPR編輯改良的作物(如蘑菇和糯玉米)不含有外源DNA，因此被免除轉(zhuǎn)基因監(jiān)管。Cas9蛋白-gRNA核糖體組裝體已在水稻、小麥和玉米等細胞中成功完成基因編輯，這意味著新的、高效的無DNA基因組編輯方法有望在不久的將來得到發(fā)展，并應(yīng)用于更多的作物[32]。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，核桃、蘋果、草莓、葡萄等植物基因組數(shù)據(jù)的公開將推動基因組編輯技術(shù)對作物性狀、營養(yǎng)品質(zhì)等方面的研究。然而，許多優(yōu)良品種和具有重要商品價值的作物都難以實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化。Zhao等[33]利用納米磁珠作為CRISPR復(fù)合體的載體進行瞬時表達，實現(xiàn)DNA-free基因編輯。Kelliher等[34]將單倍體誘導(dǎo)育種與基因編輯技術(shù)結(jié)合，在短時間內(nèi)完成已商業(yè)化的玉米品種改良。鑒于基因組編輯技術(shù)的不斷開發(fā)和完善，作物改良育種必將發(fā)生革命性的變化，這也將為我國農(nóng)業(yè)快速發(fā)展提供技術(shù)基礎(chǔ)。