PTEN 基因調(diào)控Raf-1 磷酸化對前列腺癌PC3 細胞凋亡的影響

孫健瑋，王劍松，劉子超，鄭立民

（1）昆明醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院超聲科，云南個舊 661000；2）昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科，云南昆明 650101；3）昆明學院生命科學與技術(shù)系，云南昆明 650214；4）昆明醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院泌尿外科，云南個舊 661000）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）多發(fā)于老年男性，其發(fā)病率近年來呈明顯上升趨勢[1]，大多數(shù)病例由于內(nèi)分泌治療產(chǎn)生抵抗而出現(xiàn)復發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡。目前尚缺乏PCa 早期診斷的分子生物學檢測標記物以及治療的分子靶向藥物，對PCa 發(fā)生發(fā)展的分子生物學基礎研究已成為熱點。

PCa 的發(fā)生發(fā)展受多基因及多信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控。第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatease and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）屬于抑癌基因，多種腫瘤的發(fā)生與其表達水平降低或丟失關系密切[2]。多種原因?qū)е碌腜TEN 基因表達減低或缺失可經(jīng)由多個信號轉(zhuǎn)導通路影響PCa 的發(fā)生發(fā)展[3]。細胞凋亡（apoptosis）也稱程序性細胞死亡，此過程以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定為目的，是腫瘤細胞生存的重要影響因素之一，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。作為真核細胞信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡途徑之一的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號轉(zhuǎn)導通路，以高度保守的三級激酶級聯(lián)形式激活并在磷酸化狀態(tài)下將上游信號傳遞到下游應答分子，在基因表達調(diào)控和細胞質(zhì)功能活動中發(fā)揮重要的作用，Raf-1 即為該信號轉(zhuǎn)導通路中重要節(jié)點之一。PTEN 基因?qū)毎蛲龅恼{(diào)控是否與MAPK 信號通路中信號轉(zhuǎn)導關鍵位點Raf-1 有關尚不能確定。本研究通過改變PTEN 基因表達，檢測磷酸化Raf-1水平并抑制相關信號通路中Raf-1 的上游作用點，再對PC3 細胞凋亡進行測定，旨在探討PTEN 基因的表達對Raf-1 磷酸化的調(diào)控作用并進一步對前列腺癌PC3 細胞凋亡的影響，為PCa 的臨床診治應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

前列腺癌PC3 細胞購自中國科學院典藏委員會昆明細胞庫；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAiMAX Reagent 和Opti-MEM I Medium培養(yǎng)基購自美國Invitrogen 公司；PTEN-pCMV6 載體購自美國Origene 公司；si-PTEN RNA 購自Qiagen 公司；PTEN 抗體（GTX101025）購自美國GeneTex 公司；Caspase-8 抗體（8CSP03）、Caspase-9（96-1-23）、Caspase-3 抗體（3CSP01）購自美國CST 公司，Caspase-12 抗體（D-20）購自美國Abcam 公司；Bax 抗體（2D2）和Bcl-2 抗體（C-2）購自美國Santa Cruz 公司；β-tubulin 抗體購自美國Epitmics 公司；FTS 和MK2206 2HCl 分別購自美國Sigma 公司和Selleck 公司；MTT 試劑盒、碘化丙啶購自美國BD 公司；胎牛血清購自Gibco 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清、10 ng/mL EGF和1%青鏈霉素雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基，PC3 細胞在37℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)中培養(yǎng)，2～3 d 更換培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化傳代。取對數(shù)期細胞用于實驗。

1.3 細胞的瞬時轉(zhuǎn)染

在24 孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入500 μL 對數(shù)期細胞懸液（1×105個/孔），過夜培養(yǎng)后加入FTS（150 μmol/L）和MK2206 2HCl（3 μmol/L）作用48 h 后以Western Blot 檢測ERK 和AKT 表達程度，以空白抑制劑組作對照。8 μg PTEN-pCMV6 載體質(zhì)粒和10 μL 的Lipofectamine 2000 分別用250 μL的Opti-MEM 稀釋，放置5 min 后混勻，再室溫放置25 min 后加入到細胞培養(yǎng)板中，6 h 后換成完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h后用Western Blot 檢測PTEN 基因表達水平和磷酸化Raf-1 表達水平。光鏡下觀察PC3 細胞形態(tài)、MTT 檢測細胞活力、流式細胞儀檢測細胞凋亡率；Western Blot 檢測Bax、BCL-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12 和Caspase-3表達水平?？召|(zhì)粒做對照。

1.4 細胞的干擾

在24 孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入500 μL對數(shù)期細胞懸液（2×105個/孔），過夜培養(yǎng)后加入FTS（150 μmol/L）和MK2206 2HCl（3 μmol/L）作用48 h 后以Western Blot 檢測ERK 和AKT 表達程度，以空白抑制劑組作對照。0.7 μL 的20 μM si-PTEN RNA 及1 μL Lipofectamine RNAiMAX 分 別 用50 μL的Opti-MEM稀釋放置5 min 后混勻，在室溫放置18 分鐘后加入到24 孔板中并加200 μL 的opti-MEM，6 h 后換成含完全培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48 h 后用Western Blot 檢測PTEN 基因表達程度和磷酸化Raf-1 表達水平。光鏡下觀察PC3 細胞形態(tài)、MTT檢測細胞活力、流式細胞儀檢測細胞凋亡率；Western Blot 檢測Bax、BCL-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12 和Caspase-3 表達水平。control siRNA 做對照。

1.5 Western blot 檢測

各轉(zhuǎn)染組細胞用胰酶消化后，加入細胞裂解液裂解并離心提取蛋白質(zhì)，Bio-rad 蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。等量的總蛋白經(jīng)煮沸變性后進行SDS-PAGE 凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，5%奶粉溶液封閉2 h，一抗孵育過夜，二抗孵育4 h，滴加適量ECL 化學發(fā)光底物，顯影。采用Quantity One 軟件測定條帶灰度值。實驗重復3 次。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 ERK 和AKT 表達的測定

Ras 抑制劑FTS（150 μmol/L）和AKT 抑制劑MK2206 2HCl（3 μmol/L）作 用PC3 細 胞48 h，Western Blot 檢測ERK 和AKT 表達量分別較空白抑制劑對照組減低49.80%（P＜0.01）和51.62%（P＜0.001），見圖1C-圖C。

圖1 ERK 和AKT 表達的測定Fig.1 The expression of ERK and AKT

2.2 PTEN 基因表達和Raf-1、磷酸化Raf-1 表達的測定

以載體質(zhì)粒PTEN-pCMV6 經(jīng)Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染PC3 細胞，48 h 后進行Western Blot 檢測，PTEN 基因表達量較對照組顯著增加（P＜0.01）；磷酸化Raf-1 表達量Raf-1 顯著降低（P＜0.01）；Raf-1 表達量與對照組無明顯差異（P=0.95），見圖2。

以 si-PTEN 干 擾 RNA 經(jīng) Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染PC3 細胞，48 h 后進行Western Blot 檢測，PTEN 基因表達量分別較對照組顯著減少（P＜0.05）；磷酸化Raf-1 表達量顯著增加Raf-1（P＜0.01）；Raf-1 表達量與對照組無明顯差異（P=0.34），見圖3。

2.3 PTEN 基因表達變化對PC3 細胞凋亡的影響

FTS（150 μmol/L）和 MK2206 2HCl（3 μmol/L）作用PC3 細胞，經(jīng)轉(zhuǎn)染過表達和干擾48 h 后對PC3 細胞凋亡的相關指標進行檢測。

2.3.1 PC3 細胞光鏡下形態(tài)變化 PTEN 過表達后，光鏡下見PC3 細胞出現(xiàn)凋亡的改變，表現(xiàn)為細胞變形，體積縮小，細胞核固縮。干擾PTEN 表達減少后，光鏡下PC3 細胞形態(tài)、數(shù)目以及體積、細胞核形態(tài)的變化無顯著差異，見圖4。

圖2 PTEN 過表達時Raf-1 和磷酸化Raf-1 的表達Fig.2 The expression of Raf-1 and phosphorylated Raf-1 when PTEN was overexpressed

圖3 PTEN 干擾時Raf-1 和磷酸化Raf-1 的表達Fig.3 The expression of Raf-1and phosphorylated Raf-1 when PTEN was silenced

圖4 PTEN 基因表達變化PC3 細胞凋亡的光鏡下表現(xiàn)（×200）Fig.4 The apoptosis of PC3 when PTEN's expression was changed（×200）

2.3.2 MTT 測定PC3 細胞OD 值和細胞活力PTEN 過表達和干擾時，MTT 測定PC3 細胞OD 值分別為（0.354±0.048）和（0.690±0.084），計算細胞活力分別為（41.42±2.88）%和（95.36±7.75）%。與各對照組相比較，PTEN 基因過表達時PC3 細胞活力減低（P＜0.01），PTEN 基因干擾時PC3 細胞活力變化無顯著差異（P=0.41）。

2.3.3 Annexin V-FITC 和PI 雙染色流式細胞儀檢測PC3 細胞凋亡率 PTEN 過表達時，PC3 細胞凋亡率為（22.10±2.29）%，較對照組（6.37±0.76）%增高（P＜0.01）。PTEN 干擾時，PC3 細胞凋亡率為（7.47±0.74）%，與對照組（6.57±0.78）%比較無顯著差異（P=0.22），見圖5。

2.3.4 Western blot 測 定 Bax、Bcl-2、caspase-8、caspase-9、caspase-12 和caspase-3的表達水平 PTEN 過表達時，促凋亡蛋白Bax 以及凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12 和Caspase-3 的表達量較對照組增高（P＜0.01），而抗凋亡蛋白Bcl-2 表達水平較對照組減低（P＜0.01）。PTEN 基因干擾時，促凋亡蛋白Bax 以及凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12 和Caspase-3 的表達量較對照組減低（P＜0.01），而抗凋亡蛋白Bcl-2 表達水平較對照組增高（P＜0.01），見圖6。

圖5 PTEN 基因表達變化流式細胞儀檢測PC3 細胞凋亡率Fig.5 The apoptosis rate of PC3 by flow cytometer when PTEN's expression was changed

圖6 PTEN 基因表達變化相關凋亡蛋白及Bax/Bcl-2 蛋白表達Fig.6 The expression of caspase and Bax/Bcl-2 when PTEN'expression was changed

3 討論

PCa 是近年老年男性發(fā)病率最高的癌癥之一，它具有與雄激素相關的特性，激素剝奪治療被認為是有效的治療手段，但大多數(shù)病例后期治療效果極為有限并最終導致內(nèi)分泌治療抵抗而預后不佳，因此對PCa 發(fā)病機制及其治療手段研究成為腫瘤研究領域的熱點。

激素非依賴性前列腺癌（androgen independent prostate cancer，AIPC）包括雄激素非依賴性前列腺癌和激素抵抗性前列腺癌，雖經(jīng)過內(nèi)分泌治療仍出現(xiàn)復發(fā)和進展[5]。除雄激素受體（androgen receptor，AR）表達異常、配體、共調(diào)節(jié)因子等作用機制外，細胞信號轉(zhuǎn)導通路憑借其重要的生物學功能在AIPC 的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用[6]。目前磷脂酰肌醇3 激酶/ 絲蘇氨酸激酶（PI3K/AKT）和絲裂原激活蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MAPK/ERK）信號轉(zhuǎn)導通路在AIPC 發(fā)生機制中的作用研究較為深入，前者主要與細胞的存活有關，可調(diào)控AR 的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定性進而相互協(xié)同促進AIPC 的發(fā)生與發(fā)展[7]，后者主要在細胞增殖、分化、周期調(diào)控以及細胞凋亡等方面導致AIPC 的轉(zhuǎn)化[8]。MAPK/ERK 信號轉(zhuǎn)導通路中，Raf分為A-Raf、B-Raf 和C-Raf（Raf-1），被啟動信號Ras 磷酸化的Raf-1 具有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性，通過激活下游因子MAPK 激酶（MEK1/2）和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）進而影響胞漿蛋白磷酸化、細胞骨架成分磷酸化以及胞核轉(zhuǎn)錄因子、核蛋白磷酸化等生物學過程。該信號轉(zhuǎn)導通路中自分泌和旁分泌生長因子所導致的Ras 和Raf 激活可推進AIPC 的病程進展并在PCa 的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用[9]。除Ras 外，Raf-1 也可能被其他上游信號蛋白甚至是PI3K/AKT 通路中的AKT所調(diào)控，Raf-1 是PI3K/AKT 和MAPK/ERK 信號通路間相互作用的交匯點之一[10]。

抑癌基因PTEN 具有雙重特異性磷酸酶活性，主要通過細胞凋亡、細胞周期阻滯、細胞遷移等環(huán)節(jié)發(fā)揮抑癌功能，PI3K/AKT 和MAPK/ERK 信號轉(zhuǎn)導通路的平衡是其調(diào)控作用的關鍵[11]。PTEN 可特異性誘導細胞周期素依賴激酶（CDKs）抑制因子p21、p27 和p51 參與細胞周期的調(diào)控[12]。PTEN 基因表達的缺失普遍存在于PCa 并增強AR 的激活和表達而可能成為AIPC 進展的關鍵原因之一[7，13]。

本研究表明，PC3 細胞分離自人前列腺癌骨轉(zhuǎn)移腫瘤，分化程度低，具有AIPC 的特性，當使用FTS（Farnesylthiosalicy acid）選擇性抑制Ras 法尼?；D(zhuǎn)移酶活性、MK2206 2HCl 高度選擇性抑制AKT 活性以排除Ras 和AKT 對Raf-1 的干擾，PTEN 基因過表達時PC3 細胞的Raf-1 活性出現(xiàn)抑制（即磷酸化Raf-1 表達減低），PTEN 基因表達減低后PC3 細胞Raf-1 的活化增加（即磷酸化Raf-1 表達增加），而非磷酸化Raf-1 的水平與PTEN 基因的表達變化無相關性。提示在MAPK/ERK 信號轉(zhuǎn)導通路中除Ras 外，PTEN 基因可對Raf-1 的活化進行負調(diào)控。Raf-1 作為PI3K/AKT 和MAPK/ERK 信號轉(zhuǎn)導通路之間重要的交匯點之一，除接受Ras 和AKT 信號蛋白的激活外也能被PTEN 基因所調(diào)控，成為PTEN 基因在MAPK/ERK 信號轉(zhuǎn)導通路中除Ras 外新的作用位點。PTEN 基因?qū)af-1 負調(diào)控作用有助于揭示AIPC 的發(fā)生機制，并可為針對PTEN、Ras、Raf-1等信號通路中關鍵因子進行靶點治療提供重要的分子生物學理論基礎。

細胞凋亡是由基因調(diào)控、程序性死亡的過程，在維持細胞增殖的動態(tài)平衡以及促進腫瘤細胞的異常增殖方面具有重要的作用。參與細胞凋亡的三個主要通路包括死亡受體通路、線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Crysteiny aspartate-specific proteinases，caspase）的激活是細胞凋亡的關鍵步驟[14]，不同的Caspase家族成員所發(fā)揮作用不盡相同，其中Caspase-2、Caspase-8 和Caspase-9 在自我活化的同時能識別激活下游信號分子而具有凋亡啟動功能[15-16]，Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7 發(fā)揮推進和執(zhí)行凋亡過程的作用，Caspase-3 的活化推動細胞凋亡的不可逆性[17-18]，而caspase-12 則是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路誘導細胞凋亡的重要標志[19]。參與細胞凋亡的不同通路存在多個交匯點，如Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3 以及Bax/Bcl-2，形成細胞凋亡復雜而重要的網(wǎng)絡作用機制。細胞凋亡受多種因素的調(diào)控和影響，其中MAPK 相關信號轉(zhuǎn)導通路對細胞凋亡具有重要的調(diào)控作用[20]。

原癌基因Bcl-2 的表達產(chǎn)物具有抑制細胞凋亡的作用，Bax 基因編碼的蛋白位于細胞漿并與Bcl-2 存在21%的同源性，轉(zhuǎn)移至線粒體的Bax 分子中BH3 能與Bcl-2 形成雜二聚體對抗Bcl-2 的凋亡抑制作用進而發(fā)揮促凋亡功能[21]。Bax/Bcl-2蛋白間競爭性二聚化作用決定細胞在接受凋亡信號刺激時是否發(fā)生凋亡，如Bax 和Bcl-2 均衡表達、Bax/Bcl-2 異二聚體占優(yōu)勢時表現(xiàn)為細胞存活期正常，若Bax 或Bcl-2 任意一方過表達所形成的Bax/Bax 或Bcl-2/Bcl-2 同二聚體占優(yōu)勢則出現(xiàn)誘導細胞凋亡或抑制細胞凋亡的效應[22]。Bax 和Bcl-2是細胞凋亡的重要影響因素，二者的平衡直接關系到細胞凋亡的關鍵調(diào)控[23]。

本研究顯示，F(xiàn)TS 和MK2206 2HCl 作用后的PC3 細胞在PTEN 基因過表達、Raf-1 活性抑制時，PC3 細胞光鏡下凋亡的改變明顯增加，同時細胞活力降低、細胞凋亡率增加，凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Caspase-3 以及促凋亡蛋白Bax 表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2 則呈低表達；而PTEN 基因干擾低表達、Raf-1 活性增高后，凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12、Caspase-3 以及促凋亡蛋白Bax 表達減低，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達增加，提示PTEN 基因在負調(diào)控Raf-1磷酸化的同時，誘導并促進PC3 細胞的凋亡，并且在此過程中死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑均有可能參與其中，進一步預示PTEN 基因可能通過對Raf-1 的調(diào)控實現(xiàn)MAPK/ERK 信號轉(zhuǎn)導通路活性的抑制以及促凋亡和抗凋亡因素平衡的調(diào)整以誘導并促進PC3 細胞的凋亡。本研究中PTEN 基因干擾后其表達減低，在光鏡下未觀察到PC3 細胞形態(tài)的明顯變化，同時PC3 細胞活力測定值和細胞凋亡率與對照組比較無顯著變化，提示PTEN 基因干擾表達減低時雖有促凋亡的因素減少和抗凋亡的因素的增多，但決定PC3 細胞出現(xiàn)凋亡抑制效應是否還存在Bax/Bcl-2 表達比例以及其他相關的影響因素，有待于進一步深入研究。

本研究結(jié)果提示PTEN 基因?qū)APK/ERK 信號轉(zhuǎn)導通路中Raf-1 具有負調(diào)控作用并進一步影響PC3 細胞的凋亡過程。針對包括Raf-1 在內(nèi)的MAPK/ERK 信號轉(zhuǎn)導通路的關鍵信號蛋白以及Caspase 家族、Bax/Bcl-2 等凋亡因子，可為PCa 和AIPC 診治新靶點的研究提供理論基礎。盡管本研究根據(jù)細胞凋亡信號因子作用的相關順序和作用模式可對PC3 細胞凋亡的機制進行一定的推斷，但細胞信號轉(zhuǎn)導通路內(nèi)部和通路之間存在交匯和重疊，凋亡因子之間也存在復雜的交互作用，MAPK/ERK 信號轉(zhuǎn)導通路中MEK/ERK 等其他重要信號蛋白是否參與PC3 細胞的凋亡，PC3 細胞凋亡的誘導和進程中各關鍵因子全面、精準的作用模式和作用位點有待進一步完善研究。