烏頭屬5種植物ITS2和psbA-trnH鑒別適用性研究

朱高倩 ， 李雙良 ， 馬莉 ， 周培軍 ， 王麗 ， 符德歡

（1.云南省藥物研究所，云南昆明 650111；2.云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650111）

烏頭屬植物為我國(guó)重要的藥用植物資源，據(jù)《中華本草》記載可入藥的有60余種，具有祛風(fēng)、散寒、止痛、止痙等功效，可用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、神經(jīng)痛、四肢拘攣、半身不遂等病癥，臨床上廣泛應(yīng)用于鎮(zhèn)痛、抗炎、局部麻醉、解熱等[1]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》）2015年版收載了烏頭（A.carmichaelii）和北烏頭（A.kusnezoffii）2個(gè)種，為川烏、附子、草烏、制草烏及草烏葉5個(gè)藥材的基原植物[2]。

烏頭屬植物分布廣泛，物種豐富，生品有大毒，民間多基于經(jīng)驗(yàn)以其入藥，缺乏規(guī)范性，存在較大的安全隱患，不利于以烏頭類(lèi)藥材入藥的中成藥質(zhì)量保證。烏頭屬植物的基原鑒定主要以其植物形態(tài)、花果特征為重要分類(lèi)依據(jù)。烏頭類(lèi)的生藥學(xué)研究常采用性狀鑒別、理化鑒別、顯微鑒別進(jìn)行研究，如顯微鑒別的淀粉粒數(shù)目、大小以及石細(xì)胞壁厚鑒別烏頭屬不同物種[3-6]，但這些鑒別存在依賴經(jīng)驗(yàn)和主觀性強(qiáng)的問(wèn)題。近年來(lái)，隨著DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展，《中國(guó)藥典》2015年版[2]將“中藥材DNA條形碼指導(dǎo)原則”納入中藥材鑒別方法，其中ITS2和psbA-trnH作為植物類(lèi)中藥材DNA分子鑒定的重要鑒別位點(diǎn)。鑒于烏頭類(lèi)植物遺傳分化復(fù)雜多樣，目前烏頭類(lèi)的DNA條形碼研究還處于探索研究階段，已進(jìn)行分子研究的烏頭屬植物種類(lèi)比較有限，如郭豪杰等[7]對(duì)藏藥材榜嘎及其混偽品的DNA條形碼鑒定研究結(jié)果顯示ITS系列可作為鑒定榜嘎[船盔烏頭Aconitum naviculare（Bruhl.）Stapf或 甘 青 烏 頭Aconitum tanguticum（Maxim.）Stapf的干燥全草]及其混淆品的有效條形碼。張曉南等[8]對(duì)黃草烏、滇南草烏進(jìn)行了ITS鑒別研究。He等[9]研究的19個(gè)種134個(gè)樣品的烏頭品種可以通過(guò)psbA-trnH基因間隔片進(jìn)行鑒別。基于基原鑒定結(jié)果，本研究繼續(xù)對(duì)烏頭屬5種植物的ITS2和psbA-trnH的鑒別適用性進(jìn)行研究，以期補(bǔ)充完善烏頭類(lèi)藥材DNA條形碼信息數(shù)據(jù)，為加快烏頭類(lèi)藥材DNA條形碼應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥材 試驗(yàn)所用材料采自云南省麗江市寧蒗縣、迪慶州香格里拉市、玉龍縣等地，包括顯柱烏頭系的3個(gè)居群長(zhǎng)喙烏頭和1個(gè)居群石膏山烏頭、蔓烏頭系的3個(gè)居群瓜葉烏頭和1個(gè)居群玉龍烏頭、興安烏頭系的1個(gè)居群中甸烏頭的新鮮葉片，并用硅膠干燥，其憑證標(biāo)本由中科院華南植物園楊親二研究員鑒定。5種烏頭來(lái)源信息見(jiàn)表1。

表1 5種烏頭的來(lái)源信息Table 1 Source information of 5 species of Aconitum

1.2 主要試劑 2×Power Taq PCR Master Mix（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；引物由華大基因合成；4S Green Plus無(wú)毒核酸染料（上海生工公司）；G-10瓊脂糖（西班牙BIOWEST公司）；1×TAE緩沖液。

1.3 主要儀器 Mastercycler聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀、Centrifuge 5418高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；DYY-6C凝膠電泳儀（北京市六一儀器廠）；ZF-258全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)（上海金鵬分析儀器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 DNA提取 采用改良十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）[10]提取5種烏頭葉片材料的DNA。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 采用引物ITS2F/ITS2R對(duì)提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列同《中國(guó)藥典》2015 年版[2]。ITS2F，5’-GCGATACTTGGTGTGAA T-3’；ITS2R，5’-GACGCTTCTCCAGACTACAA T-3’。psbA，5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’；trnH，5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’。反應(yīng)體系為50 μL，其中含雙鏈DNA模板2 μL，正反引物（濃度為10 pmol/L）各 0.2 μL，2×Power Taq PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 22.6 μL。ITS2位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃4 min；進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7 min。psbA-trnH位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性4 min；進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30 s，55℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，在全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察拍照。

1.4.3 PCR產(chǎn)物序列測(cè)定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4.4 序列分析 用DNAMAN、Bioedit軟件對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析，基因區(qū)段通過(guò)NCBIBLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行確定。MEGA 5.1采用鄰接法（NJ，Neighborjoining）[11]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏頭屬5種植物的植物形態(tài)及塊根特征 烏頭屬5種植物的植物形態(tài)及塊根特征考察結(jié)果表明，5種烏頭植物形態(tài)在莖形態(tài)方面有差異，干燥塊根的形狀、斷面顏色、大小等方面不同。見(jiàn)圖1、表2。其中，長(zhǎng)喙烏頭和石膏山烏頭歸屬于顯柱烏頭系，直立莖，長(zhǎng)喙烏頭干燥塊根呈棕色、多側(cè)根、斷面深褐色，石膏山烏頭干燥塊根呈深褐色、少側(cè)根、斷面褐色；瓜葉烏頭和玉龍烏頭歸屬于蔓烏頭系，纏繞莖，干燥塊根均呈深褐色，瓜葉烏頭干燥塊根呈圓錐形、斷面灰褐色，玉龍烏頭干燥塊根呈倒圓錐形、斷面褐色；中甸烏頭歸屬于興安烏頭系，直立莖，干燥塊根呈棕色、圓錐形、斷面淡黃色。5種烏頭的大小無(wú)明顯界限。

2.2 烏頭屬5種植物ITS2和psbA-trnH的PCR擴(kuò)增和測(cè)序情況 以ITS2F/ITS2R和psbA/trnH對(duì)烏頭屬5種植物共計(jì)70個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)表3和圖2。共67個(gè)樣品成功擴(kuò)增獲得ITS2位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物，全部測(cè)序成功；共69個(gè)樣品成功擴(kuò)增獲得psbA-trnH位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物，全部測(cè)序成功。

圖1 烏頭屬5種植物的植株形態(tài)及干燥塊根Figure 1 The features of the plant morphotypes and dried roots of 5 species of Aconitum

表2 烏頭屬5種植物的植物形態(tài)及干燥塊根特征信息表Table 2 The characteristic data of plant morphotypes and dried roots of 5 species of Aconitum

表3 5種烏頭ITS2和psbA-trnH的PCR擴(kuò)增和測(cè)序情況Table 3 PCR amplification and sequencing results for ITS2 and psbA-trnH loci in 5 species of Aconitum （n/個(gè)）

2.3 烏頭屬5種植物ITS和psbA-trnH序列比對(duì)分析 5種烏頭屬植物9個(gè)居群67份樣品的ITS2序列全長(zhǎng)均為208 bp，5種烏頭種間ITS2的序列比較。結(jié)果表明，3個(gè)差異位點(diǎn)可將顯柱烏頭系的長(zhǎng)喙烏頭和石膏山烏頭、蔓烏頭系的玉龍烏頭鑒別開(kāi)，但是蔓烏頭系的瓜葉烏頭和興安烏頭系的中甸烏頭之間無(wú)差異位點(diǎn)。見(jiàn)表4。5種烏頭中，ITS2的第169、185、203 bp處，長(zhǎng)喙烏頭為T(mén)、C、T堿基，玉龍烏頭為C、A、T堿基，石膏山烏頭為C、C、C堿基，瓜葉烏頭和中甸烏頭為C、C、T堿基。

圖2 烏頭屬5種植物的ITS2和psbA-trnH位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure 2 Electrophoretogram of PCR products of ITS2 and psbA-trnH loci in 5 species of Aconitum

5種烏頭9個(gè)居群69份樣品的psbA-trnH序列比對(duì)長(zhǎng)度均為233 bp，雖有個(gè)別種內(nèi)差異，但是種間無(wú)差異位點(diǎn)。見(jiàn)表5。第164個(gè)堿基處，瓜葉烏頭有C/A堿基變異，其他4種烏頭均為C堿基，在第217個(gè)堿基處，瓜葉烏頭種內(nèi)有缺失/T堿基的變異，其他4種烏頭均為缺失。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析 以5種烏頭屬植物的9個(gè)居群的ITS2位點(diǎn)的序列，通過(guò)鄰接法建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（如圖3所示），結(jié)果顯示該位點(diǎn)上顯柱烏頭系的長(zhǎng)喙烏頭和石膏山烏頭分別位于明顯的獨(dú)立分支，而蔓烏頭系的瓜葉烏頭和玉龍烏頭、興安烏頭系的中甸烏頭位于一個(gè)大支，其中興安烏頭系的中甸烏頭與蔓烏頭系的瓜葉烏頭最為近緣。

以5種烏頭屬植物的9個(gè)居群的psbA-trnH位點(diǎn)的序列通過(guò)鄰接法建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（如圖4所示），結(jié)果顯示瓜葉烏頭的其中部分樣品位于一獨(dú)立分支，而其他烏頭樣品均位于一個(gè)大支內(nèi)。

表4 5種烏頭ITS2序列差異位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)Table 4 Comparison of the specific loci of ITS2 sequence in 5 species of Aconitum

表5 7種烏頭psbA-trnH序列差異位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)Table 5 Comparison of the specific loci of psbA-trnH sequence in 5 species of Aconitum

3 討論

3.1 烏頭屬植物傳統(tǒng)分類(lèi)與ITS2分子鑒定有機(jī)平衡 分子標(biāo)記技術(shù)是研究或運(yùn)用能反映生物個(gè)體間、種群間、物種間等分類(lèi)單位的基因組中某種DNA片段差異的技術(shù)[12]。ITS序列是近年來(lái)用于探討植物種間變異和種內(nèi)變異以及近緣屬間系統(tǒng)關(guān)系的重要分子標(biāo)記，在植物分類(lèi)中廣泛應(yīng)用[13-16]。前人研究也表明ITS序列在烏頭屬內(nèi)部分物種也有一定的鑒別能力[17]。在本研究中ITS2對(duì)烏頭屬植物有一定的鑒別能力，可鑒別顯柱烏頭系的長(zhǎng)喙烏頭和石膏山烏頭、蔓烏頭系的玉龍烏頭，但不能鑒別蔓烏頭系的瓜葉烏頭和興安烏頭系的中甸烏頭，二者在ITS2位點(diǎn)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上處于極為近緣的關(guān)系，表明蔓烏頭系的瓜葉烏頭和玉龍烏頭之間的遺傳距離大于蔓烏頭系的瓜葉烏頭與興安烏頭系中甸烏頭之間的遺傳距離，說(shuō)明蔓烏頭系與興安烏頭系可能存在分類(lèi)交叉。此結(jié)果與肖培根等[18]基于二萜生物堿進(jìn)行的烏頭屬化學(xué)分類(lèi)不謀而合，即蔓烏頭系可能是顯柱烏頭系和興安烏頭系的中間類(lèi)群。而本研究中基于傳統(tǒng)分類(lèi)鑒定法的形態(tài)特征結(jié)果表明，蔓烏頭系的瓜葉烏頭為纏繞莖，興安烏頭系的中甸烏頭為直立莖，具有明顯的差異特征，與ITS2分子鑒定結(jié)果不同。因此，我們認(rèn)為雖然ITS2對(duì)烏頭屬很多種有很好的鑒定能力，但是分子鑒定方法是基于傳統(tǒng)分類(lèi)鑒定結(jié)果建立的便捷方法，在其鑒定過(guò)程中應(yīng)注意中間類(lèi)群客觀存在的同異問(wèn)題，有機(jī)平衡傳統(tǒng)分類(lèi)和分子鑒定進(jìn)行綜合判定其類(lèi)群位置。

3.2psbA-trnH對(duì)烏頭屬植物分子鑒別的局限性空psbA-trnH在《中國(guó)藥典》2015年版中作為ITS2的輔助鑒定序列，在很多植物物種鑒定中確實(shí)具有很強(qiáng)的鑒定力以及保守性[19-20]。前人研究中該位點(diǎn)在烏頭屬的部分物種中也有一定的鑒定力，其中瓜葉烏頭與其他烏頭可很好地進(jìn)行鑒別[9]，但是本研究中psbA-trnH對(duì)5個(gè)種的烏頭鑒別均不理想，說(shuō)明psbA-trnH對(duì)烏頭屬的鑒別具有一定的局限性，psbA-trnH序列不能鑒別顯柱烏頭系的長(zhǎng)喙烏頭和石膏山烏頭、蔓烏頭系的瓜葉烏頭和玉龍烏頭、興安烏頭系的中甸烏頭等5種烏頭屬植物。原因可能是本研究中的5種烏頭均產(chǎn)自云南麗江、迪慶等地，地理生態(tài)及其起源進(jìn)化相對(duì)較近。

綜上所述，ITS2、psbA-trnH單獨(dú)使用或結(jié)合使用對(duì)烏頭屬的鑒別都有一定的局限性，應(yīng)結(jié)合其他位點(diǎn)或其他技術(shù)領(lǐng)域進(jìn)行綜合判定。

圖3 5種烏頭屬植物9個(gè)居群ITS2位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 3 Phylogenetic tree for ITS2 loci in 9 population from 5 species of Aconitum

圖4 5種烏頭屬植物9個(gè)居群psbA-trnH位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 4 Phylogenetic tree for psbA-trnH loci in 9 population from 5 species of Aconitum