宣肺調(diào)腸方對膿毒癥大鼠腸道損傷的修復(fù)作用及機(jī)制研究

章國軍， 李健

（1.廣東省廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東廣州 510800；2.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州 510120）

膿毒癥是由感染或高度可疑感染灶引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，病死率高[1]。腸道是膿毒癥時(shí)臟器損害的重要靶器官。腸道功能障礙更是膿毒癥的“始動(dòng)因素”，也是由膿毒癥發(fā)展至臟器功能障礙綜合征（multiple organs dysfunction syndrome，MODS）的重要因素之一[2]。有研究表明，磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（pAMPK）可抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，pAMPK的高低與炎癥分子表達(dá)水平的高低之間存在密切的聯(lián)系[3]。宣白承氣湯是“肺腸同治”的經(jīng)典方。已有研究表明，宣白承氣湯可有效抑制膿毒癥患者的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)[4]。本研究應(yīng)用以宣白承氣湯為基礎(chǔ)方進(jìn)行加減的宣肺調(diào)腸方治療膿毒癥大鼠，并以宣白承氣湯為陽性對照，旨在探究宣肺調(diào)腸方修復(fù)膿毒癥腸道損傷的作用及其pAMPK機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量（200±20）g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號：44002100004733。實(shí)驗(yàn)單位：廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院。給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)正常飲食，自由攝食飲水。

1.2 藥物、試劑與儀器 宣肺調(diào)腸方由生石膏30 g、生大黃10 g、杏仁10 g、瓜蔞皮15 g、枳實(shí)15 g、厚樸15 g、黃芪30 g組成。宣白承氣湯由生石膏15 g、大黃9 g、杏仁6 g、瓜蔞4.5 g組成。上述中藥材均由廣東省中醫(yī)院提供，由廣東省中醫(yī)院李健教授、馬世玉副研究員鑒定。大鼠白細(xì)胞介素6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；pAMPK（Thr172）抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）活性試劑盒（南京建成生物工程研究所）；內(nèi)毒素（LPS）（美國Sigma公司）。JS-Power300電泳儀（上海培清公司）；Multiskan Mk3酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；UV-754型分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）。

1.3 分組、模型復(fù)制與給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，將大鼠按體質(zhì)量編號根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為正常組，模型組，宣肺調(diào)腸方高、中、低劑量組，宣白承氣湯組，每組6只。宣肺調(diào)腸方高、中、低劑量組及宣白承氣湯組在造模開始前連續(xù)3 d給予大鼠相應(yīng)的藥物灌胃，正常組、模型組給予等體積蒸餾水灌胃。每只大鼠灌胃體積均按10 mL/kg（體質(zhì)量）計(jì)算。宣肺調(diào)腸方成人（按60 kg體質(zhì)量計(jì)算）給藥劑量是125 g，大鼠給藥劑量按成人與大鼠體表面積法[5]進(jìn)行換算，為12 g·kg-1·d-1（中劑量），高、低劑量分別為中劑量的2倍和1/2倍 ， 即 24、 6 g·kg-1·d-1。按相同的方法[5]換算，宣白承氣湯組大鼠給藥劑量為3.5 g·kg-1·d-1。參照Yeh等[6]設(shè)計(jì)的方法復(fù)制膿毒癥模型。操作步驟：取100 mg LPS用體積分?jǐn)?shù)0.9%無菌生理鹽水6.67 mL充分混勻，即可得濃度為15 mg/mL的LPS溶液，于4℃冰箱中儲存。造模開始時(shí)，將大鼠固定，用酒精擦拭大鼠尾部至尾靜脈清晰可見，用1 mL注射器吸取LPS溶液（吸取量按1 mL/kg大鼠體質(zhì)量計(jì)算），將注射器針尖插入大鼠尾靜脈，先回抽至針管中可見紅色靜脈血，再將LPS溶液注入血管中，退針，用無菌棉簽輕輕按壓進(jìn)針部位2 min至未見出血，則造模完成。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 標(biāo)本取材及處理 造模后3 h各組動(dòng)物無菌條件下麻醉、開腹，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，離心20 min，分離血清，放入-20℃冰箱中保存。取近回盲端回腸組織2～3 cm，放入4℃等滲生理鹽水中沖洗，留取標(biāo)本2份。一份用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定，另一份立即進(jìn)行組織勻漿。

1.4.2 采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清IL-6水平 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。簡要步驟：將標(biāo)準(zhǔn)品按倍比稀釋原則稀釋放入EP管中，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在96孔板加樣后于37℃條件下溫育2 h，反復(fù)洗滌5次后，加酶封閉溫育，加入底物，避光顯色15～30 min。加入終止液50 μL，待液體顏色變成黃色，靜置混勻5 min。將已終止反應(yīng)的96孔板放入酶標(biāo)儀中，在450 nm波長處檢測各孔吸光度值，再計(jì)算樣品IL-6質(zhì)量濃度。

1.4.3 采用黃嘌呤氧化酶法檢測血清MDA、SOD活性 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。簡要步驟：取各組樣本血清25 μL加入測定管，用旋渦混勻器充分混勻，置37℃恒溫水浴40 min，加入顯色劑，混勻，室溫放置10 min。于波長550 nm處，用1 cm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，比色，測吸光度值，計(jì)算血清MDA、SOD含量。

1.4.4 蘇木素—伊紅（HE）染色觀察回腸組織形態(tài)學(xué)改變 將回腸組織從體積分?jǐn)?shù)10%甲醛取出后切成1 cm×0.8 cm×0.2 cm大小的組織塊，再固定2 h后使用濃度遞增的酒精脫水，酒精濃度依次為70%、80%、90%、95%、無水酒精，二甲苯透明，石蠟包埋。以石蠟包埋塊切片，厚度為5 μm，切片后將石蠟切片置于二甲苯中溶解石蠟。再使用濃度遞減酒精水化，酒精濃度依次為無水酒精、95%、90%、80%、70%，蒸餾水沖洗后進(jìn)行常規(guī)HE染色。光鏡下觀察各組大鼠回腸組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）方法檢測回腸組織pAMPK、AMPK的表達(dá)水平 使用蛋白提取試劑盒提取回腸勻漿總蛋白，蛋白標(biāo)本與蛋白上樣緩沖液混合后經(jīng)熱變性處理，樣品經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白。一抗pAMPK、AMPK稀釋濃度為1∶1 000，二抗?jié)舛葹?∶30 000。以GAPDH作為內(nèi)參照，計(jì)算pAMPK、AMPK蛋白的相對表達(dá)量（p）。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，不同組間比較，若方差齊，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若方差不齊則用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模情況 模型大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少，攝食減少，不合群，嗜睡，蜷縮，豎毛，腹脹，腹瀉，眼角出現(xiàn)分泌物等。解剖后可觀察到大鼠腹腔大量血膿性物滲出，小腸腸管明顯擴(kuò)張、水腫，肝臟表面可見瘀點(diǎn)，肺臟充血明顯。證明膿毒癥模型制備成功。

2.2 各組大鼠血清IL-6、MDA、SOD水平比較 表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組血清IL-6含量、MDA活性明顯升高，SOD活性明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，宣肺調(diào)腸方高、中劑量組血清IL-6含量、MDA活性明顯降低，宣肺調(diào)腸方高劑量組SOD活性明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且宣肺調(diào)腸方高、中、低劑量組對血清IL-6含量、MDA活性的降低作用和對SOD活性的升高作用具有劑量依賴性。

表1 各組大鼠血清IL-6、MDA、SOD水平比較Table 1 Comparison of the serum IL-6，MDA and SOD levels in various groups （）

表1 各組大鼠血清IL-6、MDA、SOD水平比較Table 1 Comparison of the serum IL-6，MDA and SOD levels in various groups （）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組宣肺調(diào)腸方高劑量組宣肺調(diào)腸方中劑量組宣肺調(diào)腸方低劑量組宣白承氣湯組SOD[J/（U·mL-1）]144.309 5±6.149 103.949 2±4.234①116.519 9± 6.038①②114.980 1±4.769①110.615 1±7.573①109.932 5±9.143①N/只6 6 6 6 6 6 IL-6[ρ/（μg·mL-1）]1.108±0.487 2.779±0.655①1.208±0.537②1.219±0.828②1.425±0.948 1.577±0.871 MDA[c/（nmol·mL-1）]10.374±1.079 17.294±1.108①13.089± 0.886①②14.649± 1.481①②15.912±0.982①15.975±1.004①

2.3 光鏡下各組大鼠回腸組織形態(tài)學(xué)變化比較 圖1結(jié)果顯示：正常組大鼠回腸組織結(jié)構(gòu)正常，腸絨毛排列整齊，絨毛結(jié)構(gòu)清晰，無變性壞死，未見炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠腸絨毛明顯水腫、伴充血、壞死，有炎癥細(xì)胞浸潤，腸腔可見大量炎癥細(xì)胞；各治療組大鼠回腸組織結(jié)構(gòu)基本正常，腸絨毛見不同程度水腫和間質(zhì)炎癥。

2.4 各組大鼠回腸組織pAMPK、AMPK蛋白表達(dá)比較 圖2、表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠回腸組織pAMPK蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，宣肺調(diào)腸方高、中、低劑量組pAMPK蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），且升高作用呈劑量依賴性。各組AMPK蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

本研究按Yeh等[6]造模方法復(fù)制膿毒癥大鼠模型的結(jié)果顯示，與正常組比較，光鏡下觀察模型組大鼠回腸組織明顯充血水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤，表明膿毒癥大鼠模型制備成功。

腸功能障礙是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要因素。腸功能障礙的機(jī)制極其復(fù)雜，目前認(rèn)為主要與以下因素有關(guān)：腸黏膜屏障的損傷[7]，細(xì)菌/內(nèi)毒素易位[8]，胃腸激素的影響，谷氨酰胺的缺乏[9]，其中細(xì)菌/內(nèi)毒素易位是其重要機(jī)制之一。腸道內(nèi)細(xì)菌/內(nèi)毒素易位時(shí)，可導(dǎo)致各種炎性介質(zhì)大量釋放及補(bǔ)體激活。同時(shí)，在全身炎癥反應(yīng)及應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體產(chǎn)生大量的氧自由基，可直接導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡，而氧自由基與炎癥應(yīng)答之間形成互相活化、反饋放大的機(jī)制，從而互相增強(qiáng)，進(jìn)而造成全身組織和器官損害，發(fā)生MODS[10]。炎癥因子IL-6主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生，是機(jī)體炎癥反應(yīng)強(qiáng)弱的重要檢測指標(biāo)[11]。MDA是氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)的一個(gè)重要指標(biāo)，它與氧化應(yīng)激反應(yīng)的嚴(yán)重程度直接相關(guān)；SOD是一種重要的抗氧化金屬酶，其活性可衡量體內(nèi)酶類抗氧化系統(tǒng)防御自由基損傷的能力，亦可反應(yīng)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的嚴(yán)重程度。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是高度保守的蛋白激酶，在真核生物細(xì)胞中廣泛存在，具有調(diào)控細(xì)胞組織代謝和能量作用[12]，被稱為“細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器”[13]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可通過AICAR激活A(yù)MPK抑制炎癥反應(yīng)[14]。

圖1 各組大鼠回腸組織形態(tài)學(xué)變化比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the morphological changes of ileum tissue in various groups（by HE staining，×200）

圖2 各組大鼠回腸組織pAMPK、AMPK蛋白Western Blot電泳條帶Figure 2 The Western Blot electrophoresis strips of pAMPK and AMPK in ileum tissue of various groups

目前治療膿毒癥無特效藥，而中醫(yī)藥治療膿毒癥已成為重要的手段。前期研究[15]發(fā)現(xiàn)宣白承氣湯治療腸源性膿毒癥有一定的療效。本研究所用宣肺調(diào)腸方，是廣東省中醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科通過多年膿毒癥的臨床研究，將傳統(tǒng)方劑宣白承氣湯中的杏仁、石膏、瓜蔞、大黃的用量加大，再加入具有行滯消積作用的枳實(shí)、厚樸，益氣補(bǔ)虛的黃芪。該方具有清肺臟之熱邪，瀉大腸之穢濁，補(bǔ)臟腑之虛的功效，諸藥合用，共奏通腑瀉下、清熱解毒、益氣扶正、涼血活血之功。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，宣肺調(diào)腸方組回腸組織水腫充血癥狀減輕，IL-6含量降低，SOD活性增強(qiáng)，pAMPK蛋白表達(dá)增多，提示宣肺調(diào)腸方具有保護(hù)腸道損傷的作用。推測其作用機(jī)制可能是宣肺調(diào)腸方激活了AMPK通路，從而達(dá)到抑制膿毒癥炎癥反應(yīng)，加強(qiáng)抗氧化應(yīng)激的作用。

表2 各組大鼠回腸組織pAMPK、AMPK蛋白表達(dá)比較Table 2 Comparison of the expression levels of pAMPK and AMPK in ileum tissue of various groups（，p）

表2 各組大鼠回腸組織pAMPK、AMPK蛋白表達(dá)比較Table 2 Comparison of the expression levels of pAMPK and AMPK in ileum tissue of various groups（，p）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組宣肺調(diào)腸方高劑量組宣肺調(diào)腸方中劑量組宣肺調(diào)腸方低劑量組宣白承氣湯組AMPK/GAPDH 0.742 7±0.354 3 0.542 2±0.231 7 0.805 7±0.252 8 0.696 4±0.047 5 0.626 7±0.066 5 0.542 2±0.113 1 N/只3 3 3 3 3 3 pAMPK/GAPDH 0.775 7±0.018 5②0.367 2±0.104 8①0.741 6±0.047 2②0.642 2±0.112 8②0.577 2± 0.043 4①②0.564 5±0.195 3

本研究因后期經(jīng)費(fèi)不足，從各組大鼠中隨機(jī)選擇了3只進(jìn)行Western Blot法檢測蛋白表達(dá)。本研究收集的樣本較少，望在以后的研究中加大樣本量、增加設(shè)置不同時(shí)間點(diǎn)、增加不同臟器組織的檢測，以進(jìn)一步闡明宣肺調(diào)腸方的腸道保護(hù)作用，為此方在臨床應(yīng)用的有效性提供理論依據(jù)。