白藜蘆醇調(diào)控Hedgehog信號(hào)通路抑制肝星狀細(xì)胞活化的研究

周薏， 闕任燁， 李勇， 朱樑

（1.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200003；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院脾胃病科，上海 200082）

肝纖維化是肝硬化發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，迄今沒有滿意的治療方法。目前國內(nèi)外絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）激活是肝纖維化形成的關(guān)鍵，抑制HSC的激活對(duì)肝纖維化的防治具有重要價(jià)值[1]。有研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號(hào)通路與HSC的活化密切相關(guān)，有效干預(yù)Hedgehog信號(hào)通路可抑制肝纖維化進(jìn)展[2]。白藜蘆醇是存在于中藥藜蘆、虎杖中的一種多酚類化合物，具有廣泛的藥理作用，且無毒副作用及致癌性報(bào)道[3]，抗肝纖維化是白藜蘆醇的重要應(yīng)用領(lǐng)域之一[4-6]。目前，關(guān)于白藜蘆醇抗肝纖維化的作用機(jī)制尚不完全明確，而又有多項(xiàng)研究[7-9]報(bào)道白藜蘆醇可調(diào)控Hedgehog信號(hào)通路發(fā)揮作用，故本研究旨在觀察白藜蘆醇抑制HSC-T6細(xì)胞活化的機(jī)制是否與調(diào)控Hedgehog信號(hào)通路有關(guān)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6由上海第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院消化科惠贈(zèng)，其表型為活化的HSC。

1.2 藥物、試劑與儀器 白藜蘆醇購于中國藥品生物制品檢定所，純度＞99%，批號(hào)：111535-201703；環(huán)耙明（cyclopamine）購自美國Cayman公司，批號(hào)：11321。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）（兔抗大鼠IgG多克隆抗體）購自美國Santa Cruz公司，批號(hào)：k1814；電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒購自美國Millipore公司，批號(hào)：1115702；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Thermo Scientific公司，批號(hào)：NZH1209；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自奧地利PAA公司，批號(hào)：A10106-0455；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自美國Amresco公司，批號(hào)：201705；蛋白質(zhì)分子量預(yù)染Marker購自美國Pierce公司，批號(hào)：27681；山羊抗兔HRP標(biāo)記二抗購自美國Cell Signaling公司產(chǎn)品 ， 批 號(hào) ： 8176； Shh、 Smo、 Patched、 Gli1、Cyclin D1、Cyclin D2、Bcl-2引物由生工生物公司合成；Trizol Reagent購自美國Sigma公司，批號(hào)：BCBN5665V；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser購自日本Takara公司，批號(hào)：AK2301；SYBR?Green Realtime PCR Master Mix購自日本Takara公司，批號(hào)：AK5005。ChemiDocTMXRS+凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）；PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)[10]與分組 HSC-T6細(xì)胞用含有體積分?jǐn)?shù)10%熱滅活胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、完全飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每48 h更換培養(yǎng)基，細(xì)胞生長鋪滿培養(yǎng)瓶底80%后，用0.25%胰蛋白酶聯(lián)合0.02%EDTA消化傳代。實(shí)驗(yàn)選用處于對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞接種于合適的細(xì)胞板中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行干預(yù)處理。白藜蘆醇組分別加入終濃度為4、8、16 μmol/L的白藜蘆醇，環(huán)耙明組加入終濃度為100 μmol/L的環(huán)耙明，空白組及模型組加入等量培養(yǎng)基溶液。預(yù)處理30 min后，模型組及各藥物處理組加入終濃度為100 ng/mL的瘦素誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞活化，空白組加入等量培養(yǎng)基溶液。24 h后收集樣本進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.4 四甲基偶氮唑鹽（MTT）檢測細(xì)胞增殖情況[10]取對(duì)數(shù)生長期的大鼠HSC-T6細(xì)胞，常規(guī)消化、制備單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔1×104個(gè)/100 μL，另設(shè)細(xì)胞空白組及單純培養(yǎng)液本底組。細(xì)胞鋪板24 h后，每孔加入完全培養(yǎng)基配制的藥物，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，空白組加入等體積的三聯(lián)液。分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入5 mg/mL的MTT試劑，每孔10 μL，37℃孵育4 h。棄孔內(nèi)上清，加入二甲基亞砜（DMSO）溶劑，每孔150 μL。37℃恒溫?fù)u床中震蕩10 min，使沉淀充分溶解后，置于酶標(biāo)儀上測定490 nm波長的吸光度（OD）值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-本底組OD值）/（空白組OD值-本底組OD值）×100%。

1.5 Western Blot檢測[11]將藥物處理后的細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞3次后，加入150 μL細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑1∶100），置于搖床上30 min（冰上）。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下后，將細(xì)胞懸液移入EP管內(nèi)，以12 000 r/min離心20 min，取上清。按照1∶4體積比加入5×loading buffer，100℃水浴10 min，使蛋白變性。分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲剖榛蛩徕c（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）膠，分離膠的濃度為8%，積層膠為5%。上樣10 μL預(yù)染Marker，以確定所檢測蛋白帶的位置。初始電壓為80 V，溴酚藍(lán)電泳至積層膠和分離膠分界面后加大至120 V，至凝膠底部時(shí)停止電泳。將蛋白從SDS-PAGE膠上轉(zhuǎn)移至相同大小的NC膜上，轉(zhuǎn)膜條件為電壓100 V，90 min。使用50 g/L的脫脂奶粉封閉1～2 h后，加入按比例稀釋的一抗（α-SMA 1∶1 000，β-actin 1∶1 000），4℃過夜。使用TBST洗膜以后，加入二抗，即1∶1 000稀釋的山羊抗小鼠或兔抗體，室溫慢搖1 h。TBST洗膜后，在條帶上滴加100 μL的熒光液。使用ChemiDocTMXRS+凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，以積分光密度（IOD）值表示，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平（p）。

1.6 RT-PCR方法[10]（1）提取總RNA：取6孔板培養(yǎng)的各組細(xì)胞，向每孔加入0.5 mL Trizol溶液，充分吹打。加入200 μL氯仿劇烈振蕩15 s，冰上靜置10 min。于4℃以12 000 r/min離心20 min，吸取上層液體，轉(zhuǎn)移到新的EP管中。加入等體積異丙醇，混勻，冰上靜置10 min，于4℃以12 000 r/min離心20 min。棄上清，沉淀體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗滌2遍。常溫下以7 500 r/min離心5 min，棄上清，沉淀干燥然后用20 μL DEPC水溶解得到RNA原液，測各樣本RNA濃度。（2）兩步法實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)：①第1步逆轉(zhuǎn)錄：在無核酸酶的離心管中每個(gè)樣本加入總RNA 4 μg，5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL，RNase free H2O補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)條件：25℃10 min，42℃30 min，85℃10 min。cDNA將得到的樣品-20℃短期保存。②第2步PCR反應(yīng)：各引物見表1。SyberGreen預(yù)混Taq酶10 μL，加上下游引物至總濃度10 μmol/L，加入第1步得到的cDNA模板5 μL（稀釋10倍后），以DEPC-dd H2O補(bǔ)足至20 μL，混勻，實(shí)時(shí)上機(jī)檢測。反應(yīng)條件為95℃3 min預(yù)變性，95℃10 s變性，60℃30 s退火，同時(shí)收集熒光，40個(gè)循環(huán)。由軟件自動(dòng)生成擴(kuò)增曲線和熔解曲線判斷其擴(kuò)增效率，根據(jù)目標(biāo)基因與GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物的2-△△CT比值來分析計(jì)算各目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)瘦素誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞增殖與活化的影響 圖1結(jié)果顯示：經(jīng)瘦素誘導(dǎo)后，HSCT6細(xì)胞增殖率明顯升高，活化表型α-SMA蛋白表達(dá)明顯增多，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；白藜蘆醇呈劑量依賴性抑制瘦素誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞的增殖與活化，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，環(huán)耙明組亦具有顯著的抑制瘦素誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞增殖的作用（P＜0.01）。

圖1 白藜蘆醇對(duì)瘦素誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞增殖與活化的影響Figure 1 The effects of resveratrol on the proliferation and activation of HSC-T6 cells induced by leptin

2.2 白藜蘆醇對(duì)活化的HSC-T6細(xì)胞中Hedgehog信號(hào)通路的影響 圖2結(jié)果顯示，經(jīng)瘦素誘導(dǎo)后，HSC-T6細(xì)胞內(nèi)Hedgehog信號(hào)通路成員Shh、Smo、Patched、Gli1 mRNA表達(dá)水平明顯升高，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；白藜蘆醇呈劑量依賴性抑制活化HSC-T6細(xì)胞內(nèi)Shh、Smo、Patched、Gli1 mRNA的表達(dá)，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；環(huán)耙明組與模型組比較亦具有顯著的抑制Shh、Smo、Patched、Gli1 mRNA表達(dá)的作用（P ＜0.01）。

2.3 白藜蘆醇對(duì)活化的HSC-T6細(xì)胞中Gli1靶基因表達(dá)的影響 圖3結(jié)果顯示：經(jīng)瘦素誘導(dǎo)后，HSC-T6細(xì)胞內(nèi)Gli1靶基因Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin D2 mRNA表達(dá)明顯升高，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；白藜蘆醇呈劑量依賴性抑制活化HSC-T6細(xì)胞內(nèi)Gli1靶基因Shh、Smo、Patched、Gli1 mRNA的表達(dá)，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，環(huán)耙明組亦具有顯著的抑制HSC-T6細(xì)胞Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin D2 mRNA表達(dá)的作用（P ＜ 0.01）。

3 討論

肝纖維化是肝硬化過程中一種可逆的病理改變。隨著肝纖維化病理機(jī)制研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號(hào)通路的活化與HSC細(xì)胞的激活密切相關(guān)，該通路可能是一個(gè)很有前途的藥物干預(yù)靶標(biāo)[2，12-14]。

Hedgehog信號(hào)通路是主要的調(diào)節(jié)昆蟲和哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的經(jīng)典通路之一，其對(duì)細(xì)胞命運(yùn)的決定是通過調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄因子Gli的表達(dá)來完成的。Hedgehog通路決定著胚胎干細(xì)胞的分化發(fā)育，HSC可能是定向分化的干細(xì)胞，在異常使動(dòng)因素的作用下，向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變。Hedgehog信號(hào)通路在多種損傷組織的重塑中起重要作用，共同促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合[15-16]，如Shh能加速血管生成[17]、心臟修復(fù)[18]、神經(jīng)和皮膚再生[19]、骨骼重塑、定向造血干細(xì)胞的分化；而HSC的異常活化則是對(duì)受損的肝組織的修復(fù)。

圖2 白藜蘆醇對(duì)瘦素誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞中Hedgehog信號(hào)通路的影響Figure 2 The effects of resveratrol on Hedgehog signaling pathway in HSC-T6 cells induced by leptin

Hedgehog信號(hào)通路主要由信號(hào)分子Shh，膜受體Patched、Smoothened（Smo），一些中間傳遞分子和轉(zhuǎn)錄因子Glis組成。在無配體激活的情況下，Patched經(jīng)VitD3與Smo結(jié)合并抑制Smo的活性；當(dāng)Hedgehog通路配體Shh與Patched結(jié)合后，就解除了對(duì)Smo的抑制，進(jìn)而激活下游Gli家族轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[20]。研究[21]表明，Hedgehog通路的大部分靶基因可以由Gli1轉(zhuǎn)錄激活，如調(diào)控細(xì)胞增殖、控制細(xì)胞命運(yùn)的基因包括Cyclin D1、Cyclin D2、Bcl-2等。Bcl-2是第一個(gè)被確認(rèn)具有抑制凋亡作用的Gli1下游靶基因，其高表達(dá)能阻抑多種凋亡誘導(dǎo)因素（如射線、化學(xué)藥物等）所引發(fā)的細(xì)胞凋亡[21-22]。Bcl-2的轉(zhuǎn)錄是由于Gli的鋅指結(jié)構(gòu)域與位于Bcl-2轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的Gli結(jié)合位點(diǎn)相互結(jié)合所引起的[21]。Zarnara等[23]的研究也證實(shí)了Bcl-2在維持人HSC的持續(xù)激活中發(fā)揮了重要作用。因此，提示Hedgehog通路可通過Gli介導(dǎo)Bcl-2，激活HSC。

在各種生理或病理狀態(tài)下，Hedgehog通路以旁分泌和自分泌的方式作用于Hedgehog敏感細(xì)胞。在慢性肝病的細(xì)胞微環(huán)境中，受損的肝細(xì)胞和活化的HSC大量分泌Hedgehog配體至胞外環(huán)境中，與Hedgehog敏感的HSC的相應(yīng)受體結(jié)合，進(jìn)而活化Hedgehog通路調(diào)控HSC的生物學(xué)行為[24]。研究[25-28]發(fā)現(xiàn)，多種活化的HSC均表達(dá)Hedgehog配體和 Hedgehog通路 Shh、Patch、Smo和 Gli等多重組分。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog通路的激活是靜息性HSC（Q-HSC）轉(zhuǎn)變成肌成纖維樣HSC（MF-HSC）所需要的，尤其是可促進(jìn)上皮到間質(zhì)轉(zhuǎn)換[29]；Hedgehog信號(hào)通路通過Gli調(diào)控相關(guān)靶基因，促進(jìn)HSC不斷地活化[30]。用Hedgehog通路抑制劑—環(huán)耙明作用后，肝損傷明顯降低，并通過調(diào)節(jié)HSC激活后基因表達(dá)的改變，控制細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，改善肝纖維化[31]。

圖3 白藜蘆醇對(duì)瘦素誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞中Gli1靶基因的影響Figure 3 The effects of resveratrol on Gli1 target genes in HSC-T6 cells induced by leptin

中醫(yī)藥在抗肝纖維化方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。大量的臨床實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)研究表明，一些中藥復(fù)方、單味中藥及中藥單體已經(jīng)被證實(shí)有抗纖維化作用，療效肯定，副作用少。白藜蘆醇具有顯著的抗氧化應(yīng)激作用[32]，且在體內(nèi)外均具有明顯的抗肝纖維化作用[33]。但目前對(duì)其抗纖維化作用機(jī)制及靶點(diǎn)的仍不明確。有文獻(xiàn)[7-9]報(bào)道，白藜蘆醇能夠通過下調(diào)Hedgehog信號(hào)通路抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而在治療胰腺癌轉(zhuǎn)移、腎纖維化、肺纖維化等疾病中發(fā)揮重要作用。故本研究將白藜蘆醇調(diào)控Hedgehog信號(hào)通路這一機(jī)制引入肝纖維化這一疾病進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探索。本次研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠通過抑制Hedgehog信號(hào)通路活化及其下游靶基因表達(dá)，從而達(dá)到抑制HSC細(xì)胞激活的作用。由于Hedgehog信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種肝纖維化病理機(jī)制，我們推測其抑制纖維化作用可能是通過促進(jìn)HSC凋亡，抑制上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化等途徑發(fā)揮其藥理作用，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究結(jié)果不僅對(duì)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇新的藥理作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)具有積極的作用，也為中藥新藥的開發(fā)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，可為白藜蘆醇臨床應(yīng)用于治療各種急慢性肝臟疾病提供一定的理論支持。