結(jié)腸癌T-cadherin表達(dá)水平分析與5-Aza-CdR對(duì)其表達(dá)和結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的影響

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤外科，福建 泉州，362000

結(jié)腸癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤之一，2018年全球約有110萬(wàn)新發(fā)病例，死亡人數(shù)約為55萬(wàn)多人［1］。而在中國(guó)結(jié)腸癌也是最常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤［2］。盡管結(jié)腸癌的總體療效有所改善，但預(yù)后仍然不能令人滿意。近年來(lái)，隨著全基因組及全外顯子測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，新的癌癥基因或抑癌基因不斷被發(fā)現(xiàn)，并由此衍生出新的基因治療方案，改善了患者的療效及預(yù)后。但由于基因組學(xué)的復(fù)雜性及多樣性，目前仍無(wú)法完全揭示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。因此發(fā)現(xiàn)新的腫瘤調(diào)節(jié)因子并揭示其內(nèi)在的機(jī)制，在腫瘤治療的研究中仍尤為重要。

T鈣黏蛋白（T-cadherin），也稱(chēng)鈣黏蛋白13（CDH13），是cadherin超家族的一個(gè)非典型成員，它通過(guò)糖基磷脂酰肌醇錨定在細(xì)胞膜上［3］。其常在各種類(lèi)型的癌癥中低表達(dá)，包括胃癌［4］、乳腺癌［5］、肺癌［6］、結(jié)腸癌［7］、皮膚鱗狀細(xì)胞癌［8］和其他類(lèi)型的癌癥［9］。大量研究提示，T-cadherin作為一種抑癌蛋白具有潛在的意義，因此揭示其在結(jié)腸癌中的作用，有助于發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌治療的新靶點(diǎn)。故本研究通過(guò)收集臨床樣本，在mRNA表達(dá)和蛋白水平上，分析T-cadherin的表達(dá)變化及其與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，進(jìn)而利用藥物5-Aza-CdR處理人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29，分析其對(duì)T-cadherin表達(dá)和HT-29細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，初步闡明T-cadherin在結(jié)腸癌中的調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本和細(xì)胞系

收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2015—2016年40例手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織及癌旁組織新鮮樣本，并經(jīng)過(guò)病理學(xué)檢查驗(yàn)證?；颊甙ɡ?1例男性和9例女性，手術(shù)前均未接受放療或者化療。所有患者均被告知樣本的用途并同意。取下的組織用PBS緩沖液沖洗2遍，立刻放置于液氮中保存及運(yùn)輸，用于總RNA提取及蛋白提取。HT-29細(xì)胞系購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%雙抗）（美國(guó)Thermo公司），在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為未處理組和5-Aza-CdR藥物處理組。細(xì)胞藥物處理：采用0.25%的胰酶消化HT-29細(xì)胞，結(jié)合移液器吸嘴吹打，使細(xì)胞充分懸浮，加入含血清培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞分裝至6個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入DMEM完全培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，換液，向其中3瓶加入5 μmol/L 5-Aza-CdR（美國(guó)Sigma公司），以不加藥物者為對(duì)照組，每天換液，藥物處理3 d后收集細(xì)胞。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

TRIzol試劑購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，參照其說(shuō)明書(shū)，提取組織及細(xì)胞的總RNA。通過(guò)ND-1000分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）檢測(cè)RNA的濃度和純度，確保D260nm/D280nm＞2.0，D230nm/D260nm＞1.8。采用RevertAid逆轉(zhuǎn)錄酶（美國(guó)Thermo公司）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照2×SGExcel FastSYBR Mixture［生工生物工程（上海）有限公司］說(shuō)明書(shū)，配制RTFQ-PCR反應(yīng)體系（25μL2×SGExcel FastSYBR Mixture+1 μL 上游引物+1 μL下游引物+1 μL cDNA，加入超純水補(bǔ)齊至50 μL），上機(jī)檢測(cè)（StepOnePlus?RTFQ-PCR儀，美國(guó)ABI公司），反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃，20 s；變性95 ℃，3 s；退火/延伸60 ℃，30 s；35個(gè)循環(huán)。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。T-cadherin上游引物為5'-GATGTTGGCAAGGTAGTCGAT-3'，下游引物為5'-GCTCCCTGTGTTCTCATTGAT-3'。以GAPDH作為內(nèi)參。GAPDH上游引物為5'-ACGGGAAGCTTGTCATCAATGG-3'，下游引物為5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTGG-3'。根據(jù)2-ΔΔCT計(jì)算T-cadherin的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)

離心收集細(xì)胞，采用1×RIPA裂解液（美國(guó)Sigma公司）裂解細(xì)胞，利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒［生工生物工程（上海）有限公司］對(duì)蛋白定量。取50 μg蛋白樣品與凝膠緩沖液混合，煮沸10 min，之后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（美國(guó)Millipore公司）上。非特異性抗體采用含有5%脫脂牛奶的1×Tris緩沖液封閉，室溫下溫育2 h。在4 ℃下，膜與T-cadherin抗體或GAPDH抗體（美國(guó)OmnimAbs公司）在含有5%脫脂牛奶的1×TBS緩沖液中溫育過(guò)夜。采用1×TBS洗滌3次后，膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔IgG抗體（美國(guó)OmnimAbs公司）在室溫下溫育2 h。在Fluor Chem Systems下（美國(guó)ProteinSimple公司）觀察結(jié)果，采用系統(tǒng)自帶的軟件（Alpha View Software）分析目標(biāo)蛋白的相對(duì)水平。

1.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）分析細(xì)胞增殖

采用CCK-8試劑盒［東仁化學(xué)科技（上海）有限公司］分析細(xì)胞的增殖。在96孔板中，在每孔中接種5×103個(gè)細(xì)胞，總培養(yǎng)液體積為100 μL，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。在鋪板后的1、2、3和4 d共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別向細(xì)胞中加入10%的CCK-8試劑，放置于37 ℃中溫育2 h。將96孔板放在ELx808酶標(biāo)儀（無(wú)錫百泰克生物技術(shù)有限公司）中進(jìn)行檢測(cè)。讀取并記錄每孔在450 nm的吸光度（D）值。

1.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

采用Transwell小室（美國(guó)Corning公司）分析細(xì)胞的侵襲，首先采用Matrigel基質(zhì)膠（美國(guó)BD公司）包被小室。采用OPTI-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取1×105個(gè)細(xì)胞加入上室，補(bǔ)齊OPTI-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基至終體積為200 μL，下室加入700 μL含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)板放在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。次日，取出上室，去除培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，移入含800 μL甲醇的孔中固定30 min。去除固定液，加入0.1%結(jié)晶紫染色20 min。PBS沖洗小室后將其放在顯微鏡下觀察，隨機(jī)取9個(gè)視野，拍照。

1.6 細(xì)胞凋亡

采用購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司的AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒分析細(xì)胞凋亡。胰酶消化懸浮不同處理組的細(xì)胞，300×g離心5 min收集細(xì)胞。將細(xì)胞與PI與AnnexinⅤ試劑在室溫下避光溫育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)（Guava easyCyteTM，美國(guó)Millipore公司）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)t檢驗(yàn)分析不同組別之間的差異。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3遍。結(jié)果以表示。用t檢驗(yàn)和單因素方差分析評(píng)估T-cadherin表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T-cadherin在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

采用RTFQ-PCR技術(shù)分析T-cadherin在結(jié)腸癌組織中的mRNA表達(dá)水平。如圖1和表1所示，T-cadherin在結(jié)腸癌組織中mRNA的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織（t=12.61，P＜0.000 1）。Western blot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步表明，T-cadherin蛋白在結(jié)腸癌組織中的水平也明顯下降（t=4.602，P＜0.05，圖2）。T-cadherin的mRNA表達(dá)和結(jié)腸癌患者臨床病理學(xué)特征關(guān)系分析顯示，其mRNA表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（F=5.316，P=0.009 3）及分化程度（F=5.807，P=0.006 4）明顯相關(guān)，而與其余病理變量（包括性別、年齡、腫瘤大小和腫瘤浸潤(rùn)深度）無(wú)明顯相關(guān)（表2）。

圖1 結(jié)腸癌組織及癌旁組織中T-cadherin mRNA的表達(dá)分析Fig.1 Analysis of T-cadherin mRNA expression in colon cancer tissues and paracancerous tissues

表1 T-cadherin在結(jié)腸癌組織和癌旁組織的mRNA表達(dá)Tab.1 The mRNA expression of T-cadherin in colon cancer tissues and paracancerous tissues

圖2 結(jié)腸癌組織及癌旁組織中T-cadherin 蛋白水平的分析Fig.2 Analysis of T-cadherin protein level in colon cancer tissues and paracancerous tissues

表2 T-cadherin mRNA表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between T-cadherin mRNA expression and clinicopathological features of patients with colon cancer

2.2 5-Aza-CdR對(duì)T-cadherin表達(dá)的影響

采用甲基化抑制劑處理細(xì)胞后，分別通過(guò)RTFQ-PCR和Western blot檢測(cè)T-cadherin在細(xì)胞中的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制甲基化后，T-cadherin在轉(zhuǎn)錄水平（圖3）和翻譯水平上（圖4）的表達(dá)均發(fā)生明顯上調(diào)。

2.3 T-cadherin與HT-29細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡之間的關(guān)系

CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，與空白對(duì)照組相比，藥物處理后，HT-29細(xì)胞增殖受到明顯的抑制（圖5）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5-Aza-CdR干預(yù)組的細(xì)胞侵襲能力明顯下降（圖6）。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-Aza-CdR處理可以明顯提高腫瘤細(xì)胞的凋亡，凋亡率可以達(dá)到30%（圖7）。

圖3 5-Aza-CdR處理后細(xì)胞T-cadherin mRNA表達(dá)變化Fig.3 Changes of T-cadherin mRNA expression in cells treated with 5-Aza-CdR

圖4 5-Aza-CdR處理后，細(xì)胞T-cadherin 蛋白表達(dá)變化甲基化抑制劑處理后，細(xì)胞中T-cadherin 蛋白水平明顯上調(diào)Fig.4 Change of T-cadherin protein expression in cells treated with 5-Aza-CdR

圖5 CCK-8分析5-Aza-CdR對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響Fig.5 CCK-8 assay the effect of methylation inhibitor on the proliferation of HT-29 cells

圖6 Tranwell分析5-Aza-CdR對(duì)HT-29細(xì)胞侵襲的影響Fig.6 Tranwell assay showed the effect of 5-Aza-CdR on the invasion of HT-29 cells

圖7 流式細(xì)胞術(shù)分析5-Aza-CdR對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 Flow cytometry was used to analyze the effect of 5-Aza-CdR on the apoptosis of HT-29 cells

3 討 論

結(jié)腸癌是常見(jiàn)惡性腫瘤之一，死亡率居所有癌癥第五位［1］，揭示其內(nèi)在的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制對(duì)于結(jié)腸癌患者的治療意義重大。近年來(lái)基因組學(xué)的快速發(fā)展，已經(jīng)逐漸成為癌癥研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。因此發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌新突變基因，將有助于機(jī)制的探討及治療的改變。

鈣黏蛋白是細(xì)胞表面跨膜蛋白的一個(gè)超家族，傳統(tǒng)上分為經(jīng)典鈣黏蛋白和非經(jīng)典鈣黏蛋白［10］。早有研究報(bào)道了鈣黏蛋白在腫瘤中的作用，如E-cadherin，是腫瘤中潛在的抑制因子［11］。然而，某些鈣黏蛋白也被認(rèn)為是促癌蛋白，如P-cadherin［12］和N-cadherin［13］。T-cadherin是鈣黏蛋白超家族的一個(gè)非典型成員，是目前已知的唯一一種通過(guò)GPI錨定而非跨膜結(jié)構(gòu)域膜錨定的鈣黏蛋白［14］。人類(lèi)T-cadherin的基因在幾種類(lèi)型的癌癥中均發(fā)生沉默，長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為具有抗癌作用［15］。已有研究表明，T-cadherin可能抑制腫瘤的發(fā)展，包括腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和微血管生成，這一過(guò)程涉及多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括Akt和SET7/9-p53信號(hào)通路［16-17］。但T-cadherin在結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制中的作用研究尚少，因此，揭示T-cadherin在結(jié)腸癌中的作用具有重要意義。

鈣黏蛋白已被鑒定為多種癌癥中的腫瘤抑制基因。Wang等［18］研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自前列腺癌轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系DU145中T-cadherin的外源性表達(dá)降低了致瘤性，而來(lái)自良性前列腺增生的BPH1中T-cadherin轉(zhuǎn)錄的敲低促進(jìn)了腫瘤發(fā)生；Wei等［19］研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)T-cadherin的表達(dá)可能有助于胃癌進(jìn)展；Kong等［5］研究發(fā)現(xiàn)T-cadherin低表達(dá)的腋窩淋巴結(jié)陽(yáng)性乳腺癌患者的預(yù)后較差。在本研究中，我們對(duì)40例結(jié)腸癌樣本進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)T-cadherin在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁正常組織，其表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度明顯相關(guān)，提示T-cadherin異常表達(dá)在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌作用。

T-cadherin的表達(dá)變化也與T-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平有關(guān)。DNA甲基化是真核生物關(guān)鍵的表觀遺傳修飾之一，參與了microRNAs表達(dá)的調(diào)控［20］和基因選擇性剪接［21］。異常DNA甲基化常使T-cadherin在癌癥中呈現(xiàn)低表達(dá)，并且促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，如肺癌［22］、膀胱癌［23］、鼻竇癌［24］、食管癌［25］。異常DNA甲基化在結(jié)直腸癌的發(fā)生過(guò)程中起著重要的作用［26］。最近一項(xiàng)Meta分析結(jié)果表明，T-cadherin基因甲基化在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［27］。5-Aza-CdR可在體內(nèi)外重新上調(diào)因高甲基化狀態(tài)而沉默的抑癌基因，導(dǎo)致細(xì)胞分化和凋亡，從而抑制腫瘤進(jìn)展［28］。本研究采用甲基化抑制劑5-Aza-CdR成功上調(diào)T-cadherin的表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)行為觀察發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR藥物處理與結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲的抑制及誘導(dǎo)凋亡密切相關(guān)，提示5-Aza-CdR可通過(guò)抑制T-cadherin甲基化逆轉(zhuǎn)T-cadherin表達(dá)下調(diào)，并抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和抗凋亡。相關(guān)研究已報(bào)道了T-cadherin水平上調(diào)對(duì)癌細(xì)胞行為的影響，如T-cadherin的重新表達(dá)減少了人類(lèi)前列腺癌［18］、黑色素瘤［29］、乳腺癌［30］和肝細(xì)胞癌細(xì)胞系［31］的惡性特性等。但T-cadherin去甲基化影響結(jié)腸癌發(fā)展的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果證實(shí)，T-cadherin在結(jié)腸癌組織中呈低表達(dá)，甲基化抑制劑處理可上調(diào)T-cadherin表達(dá)，并且抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示，T-cadherin在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌基因作用，并且可能是結(jié)腸癌患者使用DNA甲基化抑制劑進(jìn)行治療的靶點(diǎn)。