骨骼肌心磷脂?；D(zhuǎn)移酶1的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度變化特征及其對(duì)氧化應(yīng)激和線粒體自噬的影響

徐祖杰，田振軍

氧化應(yīng)激是機(jī)體各器官組織病變發(fā)生發(fā)展的主要原因。有研究報(bào)道，衰老、糖尿病、癌癥及心力衰竭等機(jī)體骨骼肌中氧化應(yīng)激水平顯著升高，線粒體功能發(fā)生障礙（Russell et al.，2014）。線粒體是活性氧族（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，當(dāng)線粒體異常自噬無(wú)法清除受損的線粒體時(shí)，氧化應(yīng)激水平進(jìn)一步增強(qiáng)，二者相互作用加速骨骼肌損傷。文獻(xiàn)資料表明，運(yùn)動(dòng)可通過(guò)PINK1/Parkin介導(dǎo)清除受損的線粒體，抑制病理?xiàng)l件下的骨骼肌氧化應(yīng)激水平，改善線粒體功能，提高骨骼肌質(zhì)量和力量（Joseph et al.，2016）。心磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶1（acyl-CoA：lysocardiolipin acyltransferase-1，ALCAT1）是定位于線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)的心磷脂重塑酶（Li et al.，2010），分布在心臟、肝臟和骨骼肌等組織的細(xì)胞生物膜上（Cao et al.，2004）。在肥胖、心肌肥厚、非酒精性脂肪肝和帕金森等病理模型中，心磷脂發(fā)生病態(tài)重塑，ALCAT1表達(dá)顯著增加，同時(shí)氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)，線粒體呼吸功能下降（Li et al.，2010；Liu et al.，2012；Song et al.，2019；Wang et al.，2015）。ALCAT1的下游靶標(biāo)線粒體融合蛋白2（Mitofusin 2，MFN2）被PINK1磷酸化后作為Parkin的受體，參與受損線粒體的清除（Li et al.，2012；Chen et al.，2013）。ALCAT1高表達(dá)后引起線粒體腫脹、斷裂和呼吸功能紊亂，加速ROS產(chǎn)生，PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬異常導(dǎo)致受損線粒體無(wú)法清除，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激水平進(jìn)一步升高；靶向敲除ALCAT1后，氧化應(yīng)激水平降低，線粒體呼吸功能增強(qiáng)，上述病理情況明顯改善（Li et al.，2010；Liu et al.，2012；Song et al.，2019；Wang et al.，2015）。因此，ALCAT1在氧化應(yīng)激及PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體異常自噬中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

研究發(fā)現(xiàn)，去神經(jīng)誘導(dǎo)大鼠骨骼肌萎縮時(shí)ALCAT1 mRNA表達(dá)增加了290%，電刺激誘導(dǎo)大鼠骨骼肌肥大時(shí)ALCAT1 mRNA表達(dá)下降了32%（Ostojic et al.，2013），敲除小鼠骨骼肌ALCAT1后線粒體體積增大，肌纖維直徑增加（Li et al.，2010），因此，ALCAT1在骨骼肌萎縮和肥大中發(fā)揮重要作用。推測(cè)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能是抑制ALCAT1表達(dá)和心磷脂病態(tài)重塑的有效手段（劉紐等，2017）。但目前鮮見(jiàn)骨骼肌ALCAT1表達(dá)變化的強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)特征及其與氧化應(yīng)激和PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬關(guān)系的相關(guān)研究。綜上，本研究擬采用4周小鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，探討骨骼肌ALCAT1在不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中的變化特征及其對(duì)氧化應(yīng)激和PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬的影響，為運(yùn)動(dòng)抑制ALCAT1重塑的強(qiáng)度篩選和耐力訓(xùn)練誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

8周齡健康雄性C57BL/6J野生型小鼠32只，購(gòu)于西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCⅩK（陜）2017-003。所有小鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由飲食進(jìn)水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為安靜對(duì)照組（C組）、60%V.O2max運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度組（SE組）、76%V.O2max運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度組（ME組）和85%V.O2max運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度組（HE組），每組8只。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案及取材

所有運(yùn)動(dòng)組小鼠進(jìn)行3天適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，速度為5 m/min，30 min/天，坡度為0°。正式運(yùn)動(dòng)方案的運(yùn)動(dòng)速度參照相關(guān)研究文獻(xiàn)制定，SE組以8 m/min（Zhang et al.，2016）、ME 組以 12 m/min（Sonobe et al.，2015）、HE 組以18 m/min（Zhang et al.，2016）進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，坡度均為 0°，60 min/天，5天/周×4周，C組不運(yùn)動(dòng)。

4周訓(xùn)練結(jié)束24 h后取材，頸椎脫臼處死小鼠，切取左側(cè)腓腸肌入液氮固定，用于RT-qPCR和試劑盒檢測(cè)；右側(cè)腓腸肌一部分用于線粒體呼吸功能測(cè)定，另一部分入液氮固定，用于Western blotting實(shí)驗(yàn)。

1.3 生化指標(biāo)測(cè)定

腓腸肌丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定，總抗氧化能力（T-AOC）含量采用比色法測(cè)定，總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 線粒體呼吸功能測(cè)定

采用Oxygraph-2k線粒體呼吸儀測(cè)定骨骼肌線粒體呼吸功能。清洗、校準(zhǔn)工作艙，稱(chēng)取2 mg腓腸肌組織，冰上研磨，制備勻漿液，轉(zhuǎn)移至工作艙。待呼吸速率平衡后，加入 5 μl丙酮酸、5 μl蘋(píng)果酸和 10 μl谷氨酸啟動(dòng)態(tài) 4 呼吸。待呼吸速率再次平衡后，加入20 μl ADP啟動(dòng)態(tài)3呼吸。儀器記錄耗氧曲線，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，分析態(tài)3呼吸速率（respiration rate state 3，ST3）和態(tài)4呼吸速率（respiration rate state 4，ST4），ST3/ST4比值即為呼吸控制率比（respiratory control rates，RCR）。

1.5 Western blotting檢測(cè)

取腓腸肌組織加入預(yù)冷RIPA蛋白裂解液，剪碎勻漿，離心取上清，BCA法蛋白定量。等量蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜 ，5%BSA 封閉 ，孵育一抗 ALCAT1（1：1 000，Abcam#ab175516）、MFN2（1：3 000，Abcam#ab124773）、PINK1（1：1 000，Bioworld#BS8731）、Parkin（1：5 000，Abcam#ab179812）、LC3（1：1 000，Abcam#ab128025）、P62（1：600，Proteintech#18420-1-AP）、SOD1（1：1 000，GeneT-ex#GTⅩ100659）、SOD2（1：1 000，GeneTex#GTⅩ116093），4℃過(guò)夜，復(fù)溫后TBST清洗5 min/次×5次，加二抗室溫孵育2 h，TBST清洗5 min/次×5次，ECL發(fā)光顯跡。內(nèi)參為GAPDH（1：5 000，天德悅#TDY042），計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參灰度值比值即為蛋白相對(duì)表達(dá)含量。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)

采用Trizol法提取腓腸肌總RNA，嚴(yán)格按照TaKaRa-RNA定量和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，內(nèi)參為GAPDH。引物序列為alcat1：F5’TGGACCGCCTAAGAGAAGGGAA 3’，R5’CGGTAACATGCAAGTTC A ATGA 3’；gapdh：F5’AATGGTGAAGGTCGGTGTG 3’，R5’GTGGAGTCATACTGGAACATGTAG 3’，退火溫度為60℃。

1.7 圖像采集與數(shù)據(jù)處理

利用Image Lab 5.2軟件采集Western blotting結(jié)果，GraphPad Prism 6.0 Demo軟件作圖，所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件處理，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示，采用單因素方差分析，顯著性水平選擇P＜0.05和P＜0.01。

2 研究結(jié)果

2.1 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌ALCAT1表達(dá)的影響

RT-qPCR和Western blotting結(jié)果顯示，與C組比較，SE、ME和HE組小鼠骨骼肌ALCAT1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.01）；與ME組比較，HE組小鼠骨骼肌ALCAT1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01，圖1）。

圖1 骨骼肌ALCAT1基因和蛋白表達(dá)結(jié)果Figure 1. Expression ofALCAT1 Gene and Protein in Skeletal Muscle

2.2 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌氧化應(yīng)激水平的影響

試劑盒測(cè)定結(jié)果顯示，骨骼肌MDA含量：與C組比較，SE、ME和HE組均顯著升高（P＜0.01），與HE組比較，SE、ME組均顯著降低（P＜0.01）。T-AOC含量：與C組比較，SE、ME組均顯著升高（P＜0.01），HE組無(wú)顯著變化；與ME組比較，HE組顯著降低（P＜0.01）。T-SOD活性：與C組比較，SE、ME組均顯著升高（P＜0.01），HE組無(wú)顯著變化；與ME組比較，HE組顯著降低（P＜0.01，圖2）。

Western blotting結(jié)果顯示，骨骼肌SOD1蛋白表達(dá)：與C組比較，SE、ME組均顯著升高（P＜0.01），HE組無(wú)顯著變化；與ME組比較，SE、HE組均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。SOD2蛋白表達(dá)：與C組比較，SE、ME組均顯著升高（P＜0.01），HE組無(wú)顯著變化；與ME組比較，HE組顯著降低（P＜0.01，圖3）。

2.3 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌線粒體自噬相關(guān)信號(hào)通路的影響

Western blotting結(jié)果顯示，骨骼肌MFN2蛋白表達(dá)：與C組比較，SE、ME和HE組均顯著升高（P＜0.01）；與HE組比較，SE、ME組均顯著降低（P＜0.01）。PINK1和Parkin蛋白表達(dá)：與C組比較，SE、ME組均顯著升高（P＜0.01），HE組無(wú)顯著變化；與ME組比較，SE、HE組均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，圖 4）。提示，60%V.O2max和76%V.O2max運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度能顯著提高骨骼肌PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬水平，且76%V.O2max運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度促進(jìn)效應(yīng)顯著優(yōu)于60%V.O2max運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。

圖2 骨骼肌MDA含量、T-AOC含量和T-SOD活性測(cè)定結(jié)果Figure 2. Determination of MDAContent，T-AOC Content and T-SODActivity in Skeletal Muscle

圖3 骨骼肌SOD1和SOD2蛋白表達(dá)結(jié)果Figure 3. Expression of SOD1 and SOD2 Protein in Skeletal Muscle

Western blotting結(jié)果顯示，與C組比較，SE、ME和HE組骨骼肌LC3-Ⅱ/I比值均顯著升高（P＜0.01）。與C組比較，SE、ME和HE組P62蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.01），與HE組比較，SE、ME組P62蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.01，圖5）。提示，不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)均可上調(diào)小鼠骨骼肌自噬流。

2.4 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌線粒體呼吸功能的影響

線粒體呼吸儀測(cè)定結(jié)果顯示，骨骼肌ST3和RCR：與C組比較，SE、ME和HE組均顯著升高（P＜0.01）；與ME組比較，SE、HE組均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。各組之間ST4沒(méi)有顯著差異（圖6）。提示，不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)均可顯著提高小鼠骨骼肌線粒體呼吸功能，其中，76%V.O2max運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度更為顯著。

2.5 骨骼肌ALCAT1蛋白表達(dá)與氧化應(yīng)激和線粒體自噬相關(guān)分析

相關(guān)性分析顯示，骨骼肌ALCAT1蛋白表達(dá)與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)（Pearson=-0.804，P＜0.01）；與SOD1蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（Pearson=-0.878，P＜0.01），與SOD2蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（Pearson=-0.892，P＜0.01），與PINK1蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（Pearson=-0.840，P＜0.01），與Parkin蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（Pearson=-0.858，P＜0.01），與 RCR 呈 顯 著 負(fù) 相 關(guān)（Pearson=-0.917，P＜0.01，表1）。表明，骨骼肌ALCAT1蛋白表達(dá)與氧化應(yīng)激和PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬關(guān)系密切。

3 分析與討論

ALCAT1是參與心磷脂病理性重塑的?；D(zhuǎn)移酶，目前只對(duì)該酶的生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究。文獻(xiàn)表明，ALCAT1能調(diào)控線粒體呼吸功能（Li et al.，2012；Song et al.，2019）、氧化應(yīng)激（Li et al.，2010；Liu et al.，2012；Wang et al.，2015；）和磷酸肌醇水平（Bone et al.，2017）。在肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝和帕金森等疾病模型中，ALCAT1表達(dá)顯著升高，誘導(dǎo)線粒體呼吸功能紊亂、胰島素抵抗和氧化應(yīng)激損傷（Li et al.，2010；Liu et al.，2012；Song et al.，2019；Wang et al.，2015）。在 ALCAT1 過(guò)表達(dá)的C2C12細(xì)胞系中，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量顯著增加，編碼氧化應(yīng)激的基因NADPH氧化酶4（NOⅩ4）的mRNA表達(dá)顯著升高，而編碼抗氧化酶的基因如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPⅩ）、過(guò)氧化還原酶（PRDⅩ）、硫氧還蛋白還原酶（TⅩNRD）和超氧化物歧化酶（SOD）的mRNA表達(dá)顯著降低；使用H2O2處理小鼠分離的原代骨骼肌細(xì)胞后，ALCAT1表達(dá)顯著增加（Li et al.，2010）。以上研究提示，ALCAT1和氧化應(yīng)激存在互作關(guān)系（Shi，2010）。有研究表明，ALCAT1低表達(dá)或敲除能減輕病理?xiàng)l件下氧化應(yīng)激水平，上調(diào)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，改善線粒體呼吸功能（Li et al.，2010；Liu et al.，2012；Song et al.，2019；Wang et al.，2015）。Li等（2010）提出，抑制ALCAT1表達(dá)可能成為肥胖和其他代謝疾病的潛在治療靶點(diǎn)。有研究認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能是抑制ALCAT1表達(dá)的有效手段（劉紐等，2017），但缺乏相關(guān)實(shí)驗(yàn)支持。因此，本研究采取不同強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)，探討骨骼肌ALCAT1在不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中的變化特征。

圖4 骨骼肌MFN2、PINK1和Parkin蛋白表達(dá)結(jié)果Figure 4. Expression of MFN2，PINK1 and Parkin Protein in Skeletal Muscle

圖5 骨骼肌LC3和P62蛋白表達(dá)結(jié)果Figure 5. Expression of LC3 and P62 Protein in Skeletal Muscle

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)4周不同強(qiáng)度的耐力訓(xùn)練，小鼠骨骼肌ALCAT1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低。同時(shí)，與ME組比較，SE組小鼠ALCAT1的mRNA和蛋白表達(dá)雖有降低趨勢(shì)但無(wú)顯著性，HE組小鼠ALCAT1mRNA和蛋白表達(dá)卻顯著增加。表明，骨骼肌ALCAT1表達(dá)變化呈現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度特征，抑制ALCAT1表達(dá)的最佳運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度可能在76%～85%V.O2max。本研究還發(fā)現(xiàn)，4周60%、76%V.O2max運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練能顯著增加小鼠骨骼肌MDA含量、T-AOC含量、T-SOD活性、SOD1和SOD2蛋白表達(dá)；但在85%V.O2max運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度組中，以上抗氧化能力指標(biāo)無(wú)顯著變化，MDA含量卻異常升高。表明，適宜強(qiáng)度的耐力運(yùn)動(dòng)能刺激骨骼肌氧化產(chǎn)物和抗氧化酶的生成，激活氧化-抗氧化系統(tǒng)，而大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)則會(huì)顯著提高氧化應(yīng)激水平，對(duì)抗氧化能力無(wú)顯著影響。值得關(guān)注的是，有研究顯示，病理?xiàng)l件下ALCAT1與MDA相互調(diào)節(jié)（Li et al.，2010；Liu et al.，2012；Song et al.，2019；Wang et al.，2015）。本研究結(jié)果表明，4周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后骨骼肌ALCAT1蛋白水平與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)，提示，運(yùn)動(dòng)調(diào)控ALCAT1表達(dá)與氧化應(yīng)激水平關(guān)系密切，運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的有益生理效應(yīng)與病理?xiàng)l件下應(yīng)激反應(yīng)的差異性可能是造成這一結(jié)果的主要原因，其具體生物學(xué)分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。線粒體生物能學(xué)結(jié)果顯示，不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后骨骼肌ST3和RCR均顯著升高，ST4無(wú)顯著差異。但與ME組比較，HE組小鼠ST3和RCR卻顯著下降，其趨勢(shì)與ALCAT1表達(dá)一致。推測(cè)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體質(zhì)子漏和呼吸鏈解偶聯(lián)，線粒體呼吸功能有所下降。

線粒體是能量轉(zhuǎn)換和生物氧化的主要場(chǎng)所，有細(xì)胞“能量工廠”之稱(chēng)。線粒體在氧化磷酸化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生ROS等副產(chǎn)物，引發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激；過(guò)度累積的ROS又會(huì)將線粒體作為攻擊靶標(biāo)，損傷線粒體結(jié)構(gòu)和功能（Hara et al.，2018）。與此同時(shí)，ROS能激活線粒體自噬以清除受損的線粒體，降低氧化應(yīng)激水平，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)（Zhao et al.，2018）。心磷脂是線粒體氧化磷酸化的關(guān)鍵磷脂，ROS能氧化心磷脂的雙鍵結(jié)構(gòu)，引起心磷脂病理性重塑，導(dǎo)致線粒體功能紊亂（Paradies et al.，2014）。ALCAT1催化心磷脂的病理性重塑，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙。文獻(xiàn)報(bào)道，MFN2為ALCAT1介導(dǎo)的線粒體功能障礙的下游靶標(biāo)，在去極化的線粒體中PINK1磷酸化MFN2，吸引并結(jié)合Parkin促進(jìn)線粒體自噬以清除受損的線粒體（Chen et al.，2013；Li et al.，2012）。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3）是反映自噬體形成的特異性標(biāo)記物，它在細(xì)胞中有兩種相互轉(zhuǎn)化的形式即LC3-I和LC3-Ⅱ，目前研究中多利用LC3-Ⅱ/I比值反映自噬體的數(shù)量。P62（Protein 62）作為選擇性自噬受體，能介導(dǎo)LC3-Ⅱ與自噬體膜的連接，并通過(guò)自噬降解。因此，當(dāng)LC3-Ⅱ/I比值與P62的降低具有一致性時(shí)，表明自噬流通暢，自噬流是評(píng)價(jià)自噬水平的可靠指標(biāo)（Parousis et al.，2018）。有研究比較了久坐不動(dòng)和經(jīng)過(guò)耐力訓(xùn)練的健康受試者股外側(cè)肌線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，耐力訓(xùn)練后MFN2、PINK1、Parkin和LC3蛋白表達(dá)顯著升高，P62表達(dá)沒(méi)有顯著變化，骨骼肌代謝和線粒體功能增強(qiáng)（Tarpey et al.，2017）。長(zhǎng)跑運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行一次極限耐力運(yùn)動(dòng)后，肌肉活檢結(jié)果顯示，骨骼肌LC3-II表達(dá)顯著增加，PINK1和Parkin表達(dá)沒(méi)有顯著變化（Jamart et al.，2012）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，一次大強(qiáng)度離心運(yùn)動(dòng)后，大鼠骨骼肌有大量自噬體形成，PINK1、Parkin和LC3蛋白表達(dá)均顯著升高，提示，PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷中發(fā)揮重要作用（尚畫(huà)雨等，2018）。6周耐力訓(xùn)練可顯著上調(diào)肥胖小鼠腓腸肌PINK1 mRNA和蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/I比值，下調(diào)P62蛋白表達(dá)，從而提高骨骼肌線粒體數(shù)量，改善線粒體功能（崔迪等，2014）。然而另有研究報(bào)道，8周游泳耐力訓(xùn)練后，雖然小鼠骨骼肌MFN2蛋白表達(dá)顯著升高，但PINK1、Parkin蛋白表達(dá)以及LC3-Ⅱ/I比值均無(wú)顯著變化，P62蛋白表達(dá)顯著下降（Ju et al.，2016）。由此可見(jiàn)，運(yùn)動(dòng)調(diào)控骨骼肌PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬可能受運(yùn)動(dòng)形式和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的影響。

圖6 骨骼肌線粒體呼吸功能測(cè)定結(jié)果Figure 6. Measurement of Mitochondrial Respiration Function in Skeletal Muscle

表1 ALCAT1蛋白表達(dá)與氧化應(yīng)激和線粒體自噬相關(guān)分析Table 1 Correlation Analysis of ALCAT1 Protein Expression with Oxidative Stress and Mitochondrial Autophag n=16

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4周60%V.O2max和76%V.O2max運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度耐力訓(xùn)練可顯著提高小鼠骨骼肌MFN2、PINK1和Parkin蛋白表達(dá)以及LC3-Ⅱ/I比值，降低P62表達(dá)，表明，適宜強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)能促進(jìn)骨骼肌PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬。值得關(guān)注的是，經(jīng)過(guò)85%V.O2max運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的耐力訓(xùn)練后，骨骼肌MFN2表達(dá)以及LC3-Ⅱ/I比值升高，P62表達(dá)降低，提示自噬流通暢，但PINK1和Parkin的蛋白表達(dá)卻無(wú)顯著變化，表明，85%V.O2max運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的耐力訓(xùn)練對(duì)骨骼肌PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬無(wú)顯著影響。原因分析：1）85%V.O2max強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)提高了骨骼肌線粒體功能適應(yīng)性，線粒體自噬水平趨于穩(wěn)定；2）85%V.O2max強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的線粒體自噬可能不依賴(lài)于PINK1/Parkin通路，其他線粒體自噬途徑如NIⅩ/BNIP3通路可能參與了此過(guò)程的線粒體自噬（Dun et al.，2017），但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外，本研究結(jié)果顯示，骨骼肌ALCAT1蛋白水平與PINK1、Parkin和RCR呈顯著負(fù)相關(guān)，推測(cè)運(yùn)動(dòng)抑制骨骼肌ALCAT1重塑可能與PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬有關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確。進(jìn)一步采用ALCAT1敲除及過(guò)表達(dá)動(dòng)物模型，探討ALCAT1在不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)調(diào)控骨骼肌氧化應(yīng)激和PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬中的作用及其具體機(jī)制，將為運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)骨骼肌功能穩(wěn)態(tài)提供新的視角和依據(jù)。

4 結(jié)論

骨骼肌ALCAT1表達(dá)變化呈現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度特征，4周不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)均可抑制骨骼肌ALCAT1表達(dá)，提高線粒體呼吸功能，其中76%V.O2max運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度效果更顯著。