復方熊膽滴眼液治療急性細菌性結(jié)膜炎作用及其機制的網(wǎng)絡藥理學分析

王珊珊黃楚龍黎芳劉巧明林憶龍方雪灣梁健欽

（1.中山大學中山眼科中心藥學部，廣東 廣州510060； 2.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西 南寧530200）

結(jié)膜炎是一種發(fā)生在結(jié)膜上的炎癥疾病，臨床上常見的有急性細菌性結(jié)膜炎和流行性角結(jié)膜炎，發(fā)病急是該病特點，伴以流淚畏光、結(jié)膜充血發(fā)紅，俗稱紅眼病［1-2］。 中醫(yī)認為該病由肝肺內(nèi)熱，內(nèi)熱壅盛上犯于目，與復感外邪（以風熱為主）所致［3］。 復方熊膽滴眼液是2015 年版《中國藥典》收載品種，由熊膽粉、天然冰片組成，方中熊膽粉平肝明目、退熱清火，冰片能通諸藥、散郁火、去翳明目［4］。 我院（中山大學中山眼科中心）收集多例急性細菌性結(jié)膜炎患者，通過研究表明復方熊膽滴眼液用于臨床治療急性細菌性結(jié)膜炎療效確切，但作用機制未明確。 網(wǎng)絡藥理學是以現(xiàn)代醫(yī)藥學數(shù)據(jù)庫為基礎，依靠網(wǎng)絡方法構(gòu)建“藥物-基因-靶點蛋白-疾病”網(wǎng)絡圖，能系統(tǒng)分析中藥復方對生物網(wǎng)絡的相互作用，具有整體性、系統(tǒng)性的特點［5］，是目前研究中藥復方作用機制的有效手段。 因此，本文采用網(wǎng)絡藥理學的方法，嘗試從整體、系統(tǒng)的角度分析復方熊膽滴眼液治療急性細菌性結(jié)膜炎的作用機制，為研究該中成藥的臨床應用提供依據(jù)。

1 軟件及數(shù)據(jù)庫

TCMSP （http：／ ／lsp. nwu. edu. cn／tcmsp. php）、DRAR-CPI（http：／ ／cpi.bio-x.cn／drar／）、ChemSpider數(shù)據(jù) 庫（http：／ ／www. chemspider. com／）、PubChem Compound 數(shù) 據(jù) 庫（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）、TTD 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／bidd.nus.edu.sg／group／cjttd／）、Drugbank 數(shù) 據(jù) 庫（version 5.1.1，https：／ ／www.drugbank.ca／）、UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.uniprot.org／）、String 數(shù)據(jù)庫（version 10.5，https：／ ／string-db.org／）、Cytoscape（version 3.7.1）。

2 方法與結(jié)果

2.1 臨床療效觀察

2.1.1 一般資料隨機選取中山大學中山眼科中心2018 年2 月—2018 年12 月就診的急性細菌性結(jié)膜炎患者80 例，隨機均分為對照組及觀察組，對照組患者為21 例女性與19 例男性，年齡18 ～40 歲，平均（29.73±4.45）歲，觀察組患者為22 例女性與18例男性，年齡20 ～41 歲，平均（31.73±3.87）歲。兩組患者一般資料差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

2.1.2 納入標準對照組及觀察組均接受眼部炎癥反應檢查排除其他眼部疾病，患者有畏光、流淚、目赤腫痛、黏膿性分泌物等，符合診斷要求［6］。

2.1.3 治療方法對照組給予左氧氟沙星滴眼液（河北創(chuàng)健藥業(yè)有限公司），滴入眼瞼內(nèi)，滴藥3 次／d，2 滴／次；觀察組給予復方熊膽滴眼液（長春普華制藥股份有限公司），滴入眼瞼內(nèi)，滴藥6 次／d，2 滴／次。 均連續(xù)用藥3 d。

2.1.4 觀察指標觀察兩組患者治療后的臨床療效，療效評價標準［7］：治愈，患者用藥后臨床癥狀及體征消失；顯效，患者用藥后臨床癥狀及體征明顯改善；有效，患者用藥后臨床癥狀及體征好轉(zhuǎn)；無效，患者用藥后臨床癥狀及體征無變化；總有效率＝（治愈＋顯效＋有效）／總例數(shù)×100%。

2.1.5 統(tǒng)計學分析選用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進行秩和檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2.1.6 結(jié)果觀察組有效率明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 作用機制的網(wǎng)絡藥理學分析

2.2.1 化合物篩選及其作用靶點預測通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP）檢索冰片的化合物（化合物篩選標準：OB ≥30%、DL ≥0.18 或符合Lipinski 類藥性五原則均納入），共得到α-蒎烯、齊墩果酸、異龍腦等31 種化合物。 通過NCBI 數(shù)據(jù)庫、ChemSpider 數(shù)據(jù)庫檢索［8-14］，得到熊膽粉中含有的?；切苋パ跄懰?、?；侨パ跄懰?、熊去氧膽酸等11 個化合物。 然后，通過PubChem Compound 數(shù)據(jù)庫檢索，獲得上述42 個化合物的3D 結(jié)構(gòu)，并保存為SDF 格式文件，導入DRAR-CPI 數(shù)據(jù)庫預測靶點，并以對接分數(shù)Z′-score＜-1.5（Z′-score＜-0.5 時化合物與靶點潛在結(jié)合的可能性，值越小的化合物和靶點的結(jié)合牢固）對靶點進行篩選，去除重復靶點，最終獲得192 個化合物靶點，最后通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫以校正192 個化合物靶點的名稱為官方名稱。

2.2.2 疾病相關靶點的篩選、發(fā)病機制分析通過TTD 和Drugbank 數(shù)據(jù)庫預測結(jié)膜炎的疾病靶點，關鍵 詞 有 “ conjunctivitis ”， “ epidemic keratoconjunctivitis”，“acute bacterial conjunctivitis”，并以來源于人（Homo sapiens）為條件篩選疾病靶點，去除重復靶點后得到85 個結(jié)膜炎的疾病靶點，同法校正靶點名稱。 將85 個靶點導入String 數(shù)據(jù)庫，隱藏網(wǎng)絡中無相互作用的靶點，進行蛋白互作分析，然后保存TSV 文件格式，最后導入Cytoscape 構(gòu)建互作網(wǎng)絡圖（如圖1）。 Degree 值越大則表示該靶點是疾病的關鍵靶點，與疾病密切相關，提示人們可尋找或開發(fā)該靶點的抑制劑，以達到緩解甚至治愈疾病的新藥。 按Degree 值由大到小排序前35 個疾病靶點如下（括號內(nèi)為該蛋白的Degree 值，下同）：IL6（43），TLR4（32），NFKB1（32），TLR2（30），ICAM1（30）， STAT3 （26）， RELA （25）， IKBKB （24），HSP90AA1（23），CHUK （22），MTOR （21），SYK（18），LYN（18），PRKCA（17），TBK1（15），HMGB1（15）， NFKB2 （14）， NOD2 （14）， CXCR4 （14），PRKCZ（13），PRKCB（12），IL12B（12），PRKCD（12），PRKCE（12），IL23A（11），LY96（11），PRKCQ（11），CD14（11），MUC1（11），CRP （11），ITIH4（10），RIPK2（9），HSPA8（9），IL6R（8），KRT5（8）。GO 和KEGG 分析顯示，急性細菌性結(jié)膜炎的發(fā)病涉及免疫系統(tǒng)過程的調(diào)節(jié)、對細菌防御反應及對外部刺激、細菌來源分子反應等714 個生物過程，涉及病毒受體、信號傳感、蛋白激酶等的活性和蛋白質(zhì)結(jié)合、小分子結(jié)合等共38 個分子功能，并由囊泡、膜結(jié)合泡、胞外間隙、白細胞介素-6 受體復合物及免疫突觸等47 個細胞成分條目參與。 該病與甲型流感、病毒感染、PI3K-Akt 信號通路、單純皰疹病毒感染、炎癥介質(zhì)對色氨基酸通道調(diào)節(jié)作用及血管平滑肌收縮等104 條信號通路異常相關。

表1 兩組患者治療后的臨床療效Table 1 Clinical efficacy of the two groups after treatment ［n （%）］

圖1 疾病靶點的網(wǎng)絡PPI 圖Figure 1 PPI map of disease target

2.2.3 化合物靶點及其作用機制分析將192 個化合物靶點與85 個疾病靶點，導入String 數(shù)據(jù)庫，去除無相互作用的靶點，最后得到一個由215 個節(jié)點和1 945 條邊組成的網(wǎng)絡，平均節(jié)點度為18.1，網(wǎng)絡密度為0.54。 選取combined score＞0.9 的邊（edge，即蛋白的作用關系），共篩選出由36 個化合物作用靶點［分別是SRC（34），MAPK3（33），MAPK1（32），TP53（32），EGFR（31），PIK3R1（30），IL4（30），JUN（30），VEGFA（30），IL1B（29），TNF（29），JAK2（26），MAPK14（29），PIK3CG（28），MAPK8（28），HGF（27），HRAS（25），APP（25），PLG（24），CCL2（24），RHOA（23），VCAM1（22），LCK（21），JAK3（18）， SELE （16）， CHRM1 （12）， HTR2A （10），ADRA1B（9），GHR（9），CHRM3（9），BTK（9），ADRA1A（9），ADRA1D（8），CSF2RB（7），B4GALT1（2），B4GALT4（2）］和15 個疾病靶點［（分別是STAT3（29），ICAM1（26），SYK（20），IL6R（14），LGALS3（12），PTAFR（12），HRH1（10），TIMP3（9），KRT8（8）， LUM （7）， ORM2 （6）， ORM1 （6），MAPKAPK2（6），KRT5（4），MKL1（1）］組成的關鍵靶點集。 將上述51 個靶點組成的靶點集導入String數(shù)據(jù)庫，得到一個由51 個節(jié)點、461 條邊組成的網(wǎng)絡，平均節(jié)點度為18.1，網(wǎng)絡密度為0.801，網(wǎng)絡密度增加，說明該網(wǎng)絡較之前的大網(wǎng)絡（網(wǎng)絡密度為0.54）更重要。 對該網(wǎng)絡進行GO、KEGG 富集分析，GO 分析結(jié)果顯示，該復方熊膽滴眼液調(diào)控了包括轉(zhuǎn)運、細胞遷移、白細胞遷移、細胞或亞細胞成分的運動、對有機氮化合物的反應、先天免疫反應、細胞定位、防御反應、對有機物的反應、細胞表面受體信號通路等789 個生物過程，以及影響蛋白質(zhì)結(jié)合、G 蛋白偶聯(lián)受體活性、受體結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性、信號傳感器活動、酶結(jié)合、α1-腎上腺素能受體活性、MAP 激酶活性、磷酸酶結(jié)合等55 個分子功能。 KEGG 分析顯示，51 個關鍵靶點主要富集的KEGG 通路如表2 所示，信號通路為按出錯率（false discovery rate，F(xiàn)DR）由小到大排列，前10 位的通路見表2，提示復方熊膽滴眼液治療結(jié)膜炎與調(diào)控Proteoglycans in cancer、TNF signaling pathway、Fc epsilon RI signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway 等多條信號通路有關。

2.2.4 “藥材-化合物-作用靶點-信號通路”網(wǎng)絡的構(gòu)建將藥材與其對應的化合物、化合物對應的靶點以及實驗所篩選出的關鍵靶點導入Cytoscape 構(gòu)建網(wǎng)絡，結(jié)果見圖2。 可見，復方熊膽滴眼液通過多靶點作用及多條信號通路的調(diào)節(jié)發(fā)揮治療結(jié)膜炎的作用，其中熊膽粉化合物的靶點發(fā)揮了主要作用。

表2 復方熊膽滴眼液KEGG 富集分析結(jié)果Table 2 KEGG enrichment analysis of FuFang Xiongdan Diyanye

圖2 藥材-化合物-作用靶點-信號通路網(wǎng)絡圖Figure 2 Network diagram of drug-compound-target-signal pathway

3 討論

3.1 復方熊膽滴眼液可能作用于STAT 3、ICAM1、HRH1 等靶點

前房炎癥破壞了角膜內(nèi)皮細胞的屏障功能，嚴重可導致視力喪失，是造成失明的主要原因之一。STAT 3（信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3）信號的激活通過炎癥調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的各種反應，介導屏障功能標志ZO-1 的表達。 磷酸化STAT3 水平會隨著炎癥發(fā)生時LIF、IL-6 和IFN-γ 等細胞因子水平的升高而升高，從而降低ZO-1 蛋白表達，進而降低跨內(nèi)皮細胞電阻，并誘導細胞凋亡。 STAT 3 的轉(zhuǎn)錄激活直接調(diào)控ZO-1 啟動子區(qū)，調(diào)節(jié)屏障功能，可見，STAT 3 能保護角膜內(nèi)皮細胞對多種炎癥因子的損害和對角膜內(nèi)皮細胞環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要性［15］。 STAT3 可增強NA組細胞增殖能力，對視網(wǎng)膜色素上皮細胞抗氧化應激有保護作用［16］。 本文研究發(fā)現(xiàn)，STAT3 靶點與結(jié)膜炎的病程密切相關，是該疾病的重要靶點，且“核心化合物靶點-核心疾病靶點”網(wǎng)絡結(jié)果也顯示復方熊膽滴眼液的化合物多個靶點（JAK2、SRC、EGFR、JAK3、LCK、CSF2RB、VEGFA、JUN、MAPK8）均直接作用于STAT3，提示復方熊膽滴眼液通過化合物靶點直接作用于STAT3 發(fā)揮治療作用。

黏附分子1（ICAM1）是在細胞表面表達的一類能夠介導細胞間或細胞與細胞外基質(zhì)相互作用的糖蛋白，分布在活化的淋巴細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、各種上皮細胞及成纖維細胞的表面，可與多種細胞的表面成分結(jié)合，形成網(wǎng)絡，參與細胞調(diào)控功能，在炎癥、免疫反應及創(chuàng)傷修復等過程中發(fā)揮關鍵的作用。 ICAM1 與白細胞表面的淋巴細胞功能相關抗原-1 結(jié)合，并介導白細胞與血管內(nèi)皮黏連及穿過血管內(nèi)皮移行到炎癥組織和創(chuàng)傷部位，促進炎癥的發(fā)生與發(fā)展，從而導致免疫介導的視網(wǎng)膜組織的損傷［17］。 由本文的結(jié)果可推測，SELE、TNF、VCAM1等多個化合物靶點直接作用ICAM1 以減輕結(jié)膜炎的炎癥反應。

組胺受體H1（HRH1）是發(fā)現(xiàn)最早的一類炎癥介質(zhì)，主要分布在肥大細胞及嗜堿性粒細胞中，介導平滑肌收縮、炎癥反應和調(diào)節(jié)血管的收縮與通透性；末梢靜脈收縮導致毛細血管通透性增加；參與過敏反應、胃酸分泌、血管調(diào)節(jié)等過程。 肥大細胞被活化后釋放組胺進而促進眼眶成纖維細胞產(chǎn)生IL-6、IL-8 等炎癥因子，間接影響炎癥的發(fā)展［18］。 HRH1 可舒張血管，降低毛細血管的通透性，導致人體出現(xiàn)充血、水腫的癥狀；使人淚腺分泌增加出現(xiàn)流淚現(xiàn)象；還可刺激神經(jīng)末梢誘發(fā)瘙癢感，目前被公認為引起瘙癢的介質(zhì)［19］。 從上述組胺的功能作用發(fā)現(xiàn)，HRH1 引發(fā)的現(xiàn)象與結(jié)膜炎出現(xiàn)的癥狀均吻合，提示它與結(jié)膜炎的發(fā)生與發(fā)展密切相關。 通過本文結(jié)果分析，認為復方熊膽滴眼液可能是CHRM1、APP、PIK3R1、ADRA1D 等8 個化合物靶點作用于HRH1，從而緩解結(jié)膜炎引起充血、流淚、瘙癢等癥狀。

3.2 復方熊膽滴眼液可能參與調(diào)控PI3K-Akt、Influenza A 等多條信號通路

病毒感染后，在細胞內(nèi)病毒蛋白合成和病毒附著而激活PI3K／Akt 信號通路，然后通過干擾促凋亡信號反應，維持細胞活力和增殖，進而激活下游轉(zhuǎn)錄因子，促進病毒復制，表明PI3K 支持病毒的進入和萌發(fā)等生命周期［20-21］。 SYK、JAK2 等化合物靶點介導Influenza A、PI3K／Akt 信號通路，參與細胞增殖和存活、血管生成、細胞因子調(diào)控、病毒蛋白表達、巨噬細胞趨化作用等生物功能，調(diào)控著IL-6、ICAM1等疾病因子的表達。 本文通過構(gòu)建關鍵的化合物-疾病的靶點PPI 網(wǎng)絡，并借助數(shù)據(jù)庫進行GO、KEGG 富集分析，GO 功能富集分析結(jié)果提示關鍵靶點主要參與了多種細胞調(diào)控、白細胞遷移、增殖、凋亡等生物學過程和分子功能，KEGG 富集分析結(jié)果顯示這些關鍵靶點主要富集到與炎癥、皰疹病毒感染、流感以及腫瘤等與結(jié)膜炎相關通路上。

本文采用網(wǎng)絡藥理學方法對復方熊膽滴眼液及急性細菌性結(jié)膜炎的靶點進行預測，構(gòu)建“化合物-靶點-信號通路”網(wǎng)絡及蛋白互作分析，初步闡明了復方熊膽滴眼液治療急性細菌性結(jié)膜炎的作用機制，進一步可以虛擬篩選有效成分及核心疾病靶點，從分子水平探討復方熊膽滴眼液治療結(jié)膜炎的作用機制。