不同提取時間的艷山姜揮發(fā)油組分分析及其抑菌活性研究

鄒月，黃金鳳，魏琴，單謙，沈子豪，鄧超，王芹

(1.宜賓學院 生命科學與食品工程學院 香料植物資源開發(fā)與利用四川省高校重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.西華大學 食品與生物工程學院，成都 610039)

艷山姜(AlpiniazerumbetBurtt. et Smith)為姜科山姜屬植物，廣泛分布于中國東南部至西南部各省區(qū)。除作為觀賞植物外，其果實具有重要的藥用價值，如在2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》中介紹其主治心腹冷痛、胸腹脹滿、消化不良、嘔吐腹瀉等癥狀[1]。艷山姜果實揮發(fā)油中α-蒎烯、莰烯、1,8-桉葉油醇及β-蒎烯等作為其主要活性物質(zhì)基礎[2]，具有一定的抗炎、鎮(zhèn)痛、防治心血管系統(tǒng)疾病和抑制因高糖誘導的疾病作用[3,4]。近年來，隨著種植面積擴大[5]，產(chǎn)量逐年增加，國內(nèi)學者常使用GC-MS研究其化學成分，如張成川等通過分析艷山姜各部位化學成分發(fā)現(xiàn)其中含有許多熱不穩(wěn)定物質(zhì)[6,7]，故不同提取時間所得艷山姜揮發(fā)油化學成分有所差異，簡單地以提取率為目的的提取工藝無法合理地利用此資源。而使用GC-MS僅能檢測到樣品中化學成分的種類及其含量，不能像電子鼻一樣在較短的時間從整體上無損地對樣品風味進行分析，同時艷山姜果實揮發(fā)油的抗菌活性研究較少。

故本實驗結(jié)合GC-MS和電子鼻對不同提取時間的艷山姜揮發(fā)油的化學物質(zhì)進行檢測，通過主成分分析(principal component analysis,PCA)對其成分進行分析[8]，比較分析其抗菌活性，旨在揭示不同提取時間所得化合物變化情況及其抑菌效果的差異。為進一步完善艷山姜果實揮發(fā)油提取工藝和提高其醫(yī)用等價值提供更加科學的依據(jù)，為艷山姜資源開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

艷山姜：干果，采自廣西省邕寧區(qū)，將艷山姜在干燥箱中40 ℃烘干，研磨成粉末過40目篩儲存。二氯甲烷：HPLC，成都科隆化學品有限公司；無水硫酸鈉：西隴科學股份有限公司；肉湯培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；LB培養(yǎng)基：杭州百思生物技術(shù)有限公司；其他化學試劑：均為分析純。

1.1.2 儀器

Agilent 7890A/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS) 美國安捷倫公司；ME203電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Pen3型電子鼻 德國 Airsense 公司；LRH-250恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學儀器有限公司。

1.1.3 菌種

供試病原菌菌株：金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCICC 21600)；福氏志賀氏菌(ShigellaflexneriCICC 21534)；腸炎沙門氏菌(SalmonellaenteritidisCICC 21513)；出血性大腸埃希氏菌(EscherichiacoliEHEC CICC 21530)，由北京城市學院梁寒峭課題組和北京科技大學劉洋課題組提供。

1.2 供試品溶液的制備

取40 g艷山姜粉末置于1000 mL揮發(fā)油提取器中，加水混勻，浸泡1 h，使用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油[9]，選取揮發(fā)油得率為0.385～0.438 mL的時間(2，3，4，5，7，8 h)。停止加熱后，待提取器中油水自然分層時，取出上層油狀物質(zhì)，加入適量無水硫酸鈉，靜止過夜，干燥待用。

1.3 電子鼻分析

吸取精油0.1 mL加入25 mL 旋口頂空瓶中密封，在50 ℃恒溫30 min后上樣分析。樣品的檢測參數(shù)：進樣量200 mL/min，進樣時間60 s，延滯時間300 s。當傳感器接觸到樣品揮發(fā)物后，電導率G會發(fā)生改變，且G與初始電導率G0的比值也隨之變化。響應氣體濃度越大[10]，G/G0的值越偏離1(大于或小于1)。

1.4 GC-MS分析

1.4.1 樣品制備

將7個時間提取的揮發(fā)油經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，加適量二氯甲烷稀釋樣品溶液，經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾，進行成分分析。

1.4.2 GC條件

HP-5MS毛細管色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣(He)；流速1 mL/min，不分流進樣，進樣口溫度220 ℃；柱溫60 ℃用于0 min，然后以10 ℃/min 升溫到 190 ℃，保持 2 min；再以5 ℃/min升溫到 210 ℃。保持2 min；然后以10 ℃/min升溫到220 ℃，保持8 min，運行30 min。

1.4.3 MS條件

接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；電子電離源；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍45～300 amu。

1.5 抑菌實驗

1.5.1 樣品制備1.5.1.1 菌液制備

將金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌于肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)2代后配制成1×108CFU/mL菌懸液，備用。

1.5.1.2 抗菌液制備

取提取時間為2，3，4，5，6，7，8 h的揮發(fā)油各0.1 mL用二甲基亞砜(DMSO)稀釋10倍，配制成100 μL/mL揮發(fā)油抗菌液。

1.5.2 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)[11]

將96 孔培養(yǎng)板用體積分數(shù)95%乙醇溶液浸泡1 h后晾干，備用。配制1×103CFU/mL的4 種菌液，備用。在96孔培養(yǎng)板中用二倍稀釋法配制11個濃度梯度[12]。用移液槍往孔中分別注入11個濃度梯度抗菌液50 μL，肉湯培養(yǎng)基130 μL，4種菌液20 μL，得11個抗菌液濃度梯度25～0.024 μL/mL培養(yǎng)液，每個梯度重復3次，以空白培養(yǎng)基和DMSO作為對照。接種后，放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后取出觀察，將用肉眼看小孔內(nèi)澄清即在小孔內(nèi)完全抑制細菌生長的最低藥物濃度記作MIC。從完全無菌生長的孔內(nèi)移取50 μL液體涂板，做3個重復，然后將培養(yǎng)皿放入37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，平板完全沒有菌生長出的最低濃度記作MBC。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻實驗結(jié)果分析

若某個傳感器響應值越遠離1，它在樣品風味形成中占據(jù)越重要的地位，反之，若越接近1則它在樣品風味形成中占據(jù)的地位越低。檢測到的各個時間段揮發(fā)油氣味數(shù)據(jù)見圖1。

圖1 電子鼻艷山姜揮發(fā)油氣味響應曲線(a為2 h，b為8 h)Fig.1 Response curves of flavor of volatile oils fromAlpinia zerumbet by e-nose

注：a為2 h，b為8 h。

在該電子鼻所有的10根金屬氧化物傳感器中[13]，艷山姜揮發(fā)油在W1S出現(xiàn)最高的響應值，該傳感器對甲烷敏感，W2S、W5S上出現(xiàn)較高的響應值，兩種傳感器分別對醇類和氮氧化合物靈敏，故推測甲基類、醇類、氮氧化合物等物質(zhì)為該揮發(fā)油的主要化合物。由該結(jié)果可知，揮發(fā)油中可能存在部分GC-MS未檢測出的氮氧化合物和硫化物，具體情況還需做進一步研究。

圖2 艷山姜揮發(fā)油電子鼻PCA的得分圖(a)和載荷圖(b)Fig.2 Scoring plot (a) and loading plot (b) of volatile oils from Alpinia zerumbet byelectronic nose and PCA

選取平穩(wěn)時間段55～57 s的數(shù)據(jù)進行主成分分析，將數(shù)據(jù)導入SIMCA 14-1軟件中進行PCA分析。由圖2可知，PCA將數(shù)據(jù)降維后第一主成分貢獻率為48.4%，第二主成分貢獻率為30.2%，第一主成分和第二主成分總貢獻率為78.6%，能代表大部分揮發(fā)油電子特征信息。在PCA分析中將7個樣品分為3類：第一類：2 h，第二類：3～7 h，第三類：8 h。Loading圖表示每個傳感器在區(qū)分樣品時的相對重要性。在第一主成分上，因W5S、W1S、W1W在載荷圖上貢獻值較大，即可知氮氧化合物、甲烷、硫化物可能為樣品區(qū)分為3類的主要差異物質(zhì)，在第二成分上5 h，6～8 h存在差異，主要是W2W、W2S、W6S貢獻值不同，即有機硫化物、乙醇、氫氣含量不同所致。

2.2 GC-MS實驗結(jié)果分析

GC-MS 共分離出38個化合物，通過 NIST 質(zhì)譜庫檢索結(jié)合相關(guān)文獻[14,15]，確定化合物名稱，用色譜峰面積歸一化法計算揮發(fā)油成分的相對質(zhì)量分數(shù)，總共鑒定出36種化合物，均占揮發(fā)油總量的97.9%以上，結(jié)果見表1。

表1 不同提取時間艷山姜揮發(fā)油成分分析Table 1 Composition analysis of volatile oils from Alpinia zerumbet at different extraction time

續(xù) 表

艷山姜揮發(fā)油主要由單帖類(C10Hn)和倍半萜類(C15Hn)組成[16]，其中單帖類9種(18.44%～33.92%)，倍半萜24種(63.33%～78.63%)，其他物質(zhì)僅有3種(1.62%～2.25%)。其中(-)-β-杜松烯、α-畢橙茄醇、tau-Muurolol、1,8-桉葉油醇、β-蒎烯、石竹烯為艷山姜果實揮發(fā)油主要的化學成分。4 h前沸點的高低會對化合物提取造成影響，低沸點的單帖類在2 h和3 h時含量高于其他時間，高沸點的倍半萜類在2 h和3 h時含量低于其他時間，故可認為不同時間提取的艷山姜果實揮發(fā)油的差異主要表現(xiàn)在單帖類和倍半萜的相對含量不同。

圖3 艷山姜揮發(fā)油化合物PCA得分圖Fig.3 PCA scoring plot of volatile oil compounds from Alpinia zerumbet

對7個時間提取揮發(fā)油的GC-MS數(shù)據(jù)進行PCA分析，由圖3可知，第一主成分(PC-1)方差貢獻率為67.9%，第二主成分(PC-2)方差貢獻率為12.0%，累計貢獻率為79.9%，包含了樣品大部分信息。7個時間所提取的揮發(fā)油因化合物成分不同而區(qū)分開，可將此分為4類，分別為2 h，3 h，4～7 h，8 h。

表2 GC-MS 特征向量矩陣Table 2 GC-MS eigenvector matrix

續(xù) 表

由表2可知，4-萜烯醇(0.200)、1,8-桉葉油醇(0.200)、(-)-α-依蘭油烯(-0.199)，β-蒎烯(0.198)在第一主成分具有較大載荷，其中1,8-桉葉油醇含量在7.39%～14.9%之間，β-蒎烯含量在4.82%～11.65%之間，在區(qū)分2 h與其他時間氣味差異時起重要作用，2-異丙基-5-甲基-9-亞甲基雙環(huán)[4.4.0]DEC-1-烯(0.436)，α-依蘭油烯(-0.350)在第二主成分具有較大載荷，在區(qū)分8 h，3 h與4～7 h上起到重要作用。

2.3 揮發(fā)油抑菌結(jié)果分析

植物揮發(fā)油富含萜類化合物，可通過破壞其細胞膜對微生物產(chǎn)生抑制作用[17]。本研究中，艷山姜揮發(fā)油中含有的大量萜烯和萜醇[18]，如1,8-桉葉油醇、β-蒎烯、石竹烯、橙花叔醇等具有一定的抑菌活性。不同時間提取的艷山姜揮發(fā)油對各致病菌的MIC，MBC濃度見表3。

表3 艷山姜揮發(fā)油抑菌實驗結(jié)果Table 3 Bacteriostatic test results of volatile oils from Alpinia zerumbet μL/mL

兩個對照培養(yǎng)基中均有菌種生長，排除了DMSO的抑菌影響。由表3可知，艷山姜揮發(fā)油對所試3種陰性菌MIC的濃度(6.25～12.5 μL/mL)明顯高于金黃色葡萄球菌的MIC濃度(0.024～0.781 μL/mL)，說明艷山姜揮發(fā)油對4種供試菌均表現(xiàn)出抑菌活性，且對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最佳。喬明鋒等[19]在研究花椒揮發(fā)油時發(fā)現(xiàn)其對陽性菌的抑制作用明顯，對陰性菌的抑菌活性較小，故可推測艷山姜果實揮發(fā)油對陽性菌的抑制效果優(yōu)于陰性菌。陳建煙在探究其葉片揮發(fā)油的抑菌活性時發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的抑菌活性與大腸桿菌相同，故可推測艷山姜果實與葉的抑菌效果可能不同，可對此做進一步研究。

比較各時間所得揮發(fā)油的抑菌效果可得，2 h的揮發(fā)油對志賀氏菌的抑制效果最佳，MIC=6.25 μL/mL，MBC≤6.25 μL/mL，而此時1,8-桉葉油醇、β-蒎烯的濃度與其他提取時間相比最高，故1,8-桉葉油醇、β-蒎烯可能是艷山姜揮發(fā)油對志賀氏菌發(fā)生抑菌活性的主要化合物；6 h的揮發(fā)油對沙門氏菌的抑制效果最佳，MIC=12.5 μL/mL，MBC≤12.5 μL/mL；除2，7 h的揮發(fā)油抑菌效果較差外，其余時間所提取的揮發(fā)油對大腸桿菌的抑制效果均為MIC=12.5 μL/mL，MBC≤25 μL/mL；提取8 h的揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的抑制效果最佳，MIC=0.024 μL/mL，MBC≤0.024 μL/mL，而此時1,8-桉葉油醇、β-蒎烯的濃度與其他提取時間相比最低，故1,8-桉葉油醇、β-蒎烯是艷山姜揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌發(fā)生抑菌作用的過程中不發(fā)揮主要作用的主要化合物。8 h的揮發(fā)油抑菌效果略優(yōu)于其他組，不同時間提取的揮發(fā)油抑菌效果存在差異，可能是其中化合物含量不同導致的。

3 結(jié)論

由本實驗電子鼻結(jié)果可知艷山姜揮發(fā)油在傳感器W1S、W2S、W5S出現(xiàn)較高的響應值，說明甲基類、醇類、氮氧化合物等物質(zhì)是該揮發(fā)油的主要化合物。結(jié)合PCA可將7個樣品分為三類：第一類2 h，第二類3～7 h，第三類8 h。

利用GC-MS從艷山姜揮發(fā)油中共鑒定出36種揮發(fā)性物質(zhì)。在分析不同時間提取的艷山姜果實揮發(fā)油的差異時，主要表現(xiàn)在單帖類和倍半萜的相對含量不同。結(jié)合PCA對樣品做進一步分析，可將樣品分為四類，分別為2 h，3 h，4～7 h，8 h，較電子鼻的分類更具體，可能是電子鼻對風味較接近的樣品分類效果沒有GC-MS靈敏所致。

抗菌實驗表明艷山姜揮發(fā)油對4種供試菌均有抑菌活性。不同時間提取所得揮發(fā)油對不同細菌的抑制效果不同，提取8 h的揮發(fā)油抑菌效果略優(yōu)于其他組。

本研究通過結(jié)合電子鼻的無損檢測方法、GC-MS、抑菌實驗探索不同時間提取的艷山姜揮發(fā)油的差異，并進行了定性定量的差異描述，發(fā)現(xiàn)電子鼻在區(qū)分差異較大的樣品時擁有無損、快速、簡單等優(yōu)勢，后續(xù)可通過結(jié)合GC-MS去改進電子鼻檢測方法，以達到準確、快速區(qū)分不同樣品的目的。