臘八豆揮發(fā)性風味物質的研究

王嘉瑞，李青卓，胡文康，孫莉，汪超，徐寧

(湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院 湖北省食品發(fā)酵工程技術研究中心,武漢 430068)

臘八豆作為一種典型的發(fā)酵豆類食品，是中國傳統(tǒng)美食之一。多在冬至后制作,至臘月初八起食用,故稱臘八豆?，F代生產臘八豆的工藝以新鮮的黃豆為原料，輔以花椒、鹽為佐料，經過蒸煮，接種純種毛霉，密封厭氧發(fā)酵。臘八豆富含氨基酸、維生素、功能性短肽、大豆異黃酮等生理活性物質，具有很好的保健功效，又因為其味道鮮香辣，回味綿長，深受人們的喜愛。

隨著人們生活品質的提高，不管是對食品的色、香、味，還是對其營養(yǎng)物質含量均有一定的要求。對于傳統(tǒng)發(fā)酵食品，微生物菌種、底物調控和發(fā)酵工藝均是影響其風味物質的重要因素。風味物質是影響臘八豆品質的一個重要指標，大部分風味物質是微生物在發(fā)酵過程中，通過不同的代謝途徑利用原料中的脂肪、淀粉、蛋白質經微生物酶水解后產生的各類次級產物與小分子風味成分[1]。

食品中的揮發(fā)性風味物質成分往往種類多，含量低，且復雜不穩(wěn)定，提取過程中還容易受外界條件影響，所以其分析結果的準確性很大程度上取決于香氣物質的提取方式。選擇合適的研究分析方法來鑒別特征風味物質的組成，對產品的研制和生產具有重要意義，同時對于發(fā)酵豆醬類產品的后期香味調控也有一定的意義。

目前國內外對中國豆豉風味的研究很少,尤其是對曲霉豆豉風味的研究還處于起步階段。歐陽晶等用SPME-GC-MS技術對低溫發(fā)酵臘八豆揮發(fā)性成分隨時間變化做過相關研究，因為方法限制，無法得到各揮發(fā)性成分的香氣活性值，因此無法確定各組分化合物對臘八豆風味的影響[2]。對于不同的品牌和不同的提取方法檢測臘八豆風味成分的報道還比較少見。

同時蒸餾萃取法(simultaneous distillation extraction,SDE)和固相微萃取法(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)是兩種常見的香氣提取方法[3]。SDE法測定范圍較寬，可用來提取揮發(fā)性、半揮發(fā)性風味成分，但主要以高沸點化合物為主，且其部分成分可能是由于高溫導致了某些化學反應轉變而來的揮發(fā)性物質；HS-SPME法比較靈敏，無溶劑且方便易行，可縮短分析時間，但萃取頭只能選擇性吸附一部分揮發(fā)性成分。

本文采用兩種不同的揮發(fā)性物質提取方法SDE法和HS-SPME法經GC-MS檢測分析了臘八豆揮發(fā)性風味成分，比較兩種方法提取4種臘八豆揮發(fā)性成分的差異和特征，為臘八豆產品的風味物質定性提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

臘八豆樣品：湖南長沙錦程香辣臘八豆(JC)、湖南益陽辣妹子原味臘八豆(LMZ)、湖南長沙田野故事香辣臘八豆(TYGS)、湖北宜昌土道家臘八豆(TDJ)；氯化鈉、二氯甲烷、無水硫酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司。

SPME手動進樣手柄及萃取頭(CAR/PDMS) 美國Supelco公司；Agilent GC-MS 7890B-5977B氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫公司；HH-8CJ數顯磁力攪拌恒溫水浴鍋 常州市金壇友聯儀器研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

用紗布將臘八豆的油過濾除去，用研缽將臘八豆研碎，作為待測試樣。

1.2.2 SDE法條件

稱取臘八豆研碎樣100 g置于同時蒸餾萃取裝置的500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL去離子水，加入沸石，用電熱套加熱。另一側在250 mL圓底燒瓶中加入二氯甲烷50 mL，用45 ℃水浴加熱，置于同時蒸餾萃取裝置重相一端。兩邊同時微沸開始計時，保持沸騰2 h。停止加熱后，取下裝有二氯甲烷的燒瓶緩緩打開旋塞回收裝置中的二氯甲烷。置于-20 ℃冰箱中冷凍過夜脫水，用濾紙過濾，并繼續(xù)用無水硫酸鈉過濾除水。隨后用韋氏分餾柱濃縮，55 ℃水浴加熱，控制分流比約30滴/min，待瓶內的液體少于5 mL時，停止加熱，靜置使柱內溶劑滴下來，轉入10 mL離心管，用氮吹儀氮吹濃縮除去大部分二氯甲烷溶劑至2 mL，再過膜轉入溶劑瓶中，供GC-MS分析鑒定。

1.2.3 HS-SPME法條件

將固相微萃取頭在氣相色譜儀的進樣口經270 ℃老化1 h備用；稱取1.2.1中的研碎樣品5 g，放入20 mL頂空瓶中，加入5 mL去離子水和1 g NaCl，加入磁力攪拌轉子，密封瓶口；將其置于60 ℃的恒溫水浴鍋內磁力攪拌平衡30 min；然后將老化好的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，推出萃取頭離液面1 cm處，吸附30 min后取出，隨即插入儀器的進樣口，于270 ℃解吸3 min，進行數據采集分析。

1.2.4 GC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱DB-35 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣(純度>99.999%)，進樣口溫度270 ℃，柱流速1 mL/min，不分流進樣；升溫程序：起始溫度為40 ℃,保持5 min，以6 ℃/min升到85 ℃，保持1.5 min，再以2.5 ℃/min升到150 ℃，保持1 min，最后按20 ℃/min升到280 ℃，保持1 min。質譜條件：離子源EI；離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，電子轟擊能量70 eV，質量掃描范圍25～450 amu。

2 結果與分析

發(fā)酵大豆制品的原材料、發(fā)酵工藝[4]和接種微生物[5]均能對其產品風味產生很大影響。在微生物生長的過程中分泌大量的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶酶系，能夠將原料中的營養(yǎng)物質水解成脂肪酸、短肽、氨基酸等,進而生產大量相應雜環(huán)類、醛類、酮類等風味化合物。其次臘八豆后發(fā)酵過程中加入的生姜中所含的莰烯、α-姜黃烯等揮發(fā)性成分[6]，以及大蒜中的含硫化合物等也是臘八豆風味的重要成分[7]。

2.1 兩種揮發(fā)性物質提取方法的比較

本試驗通過SDE法和HS-SPME法兩種方法對4種品牌臘八豆樣品進行揮發(fā)性風味成分的檢測和分析，相對峰面積≥1%的揮發(fā)性風味物質檢測結果見表1，總共鑒定出115種物質，其中SDE法共檢測出98種物質，HS-SPME法共檢測出73種物質，這些化合物主要分為10類，包括醇類12種，醛類15種，酮類6種，醚類7種，酚類5種，酸類4種，酯類17種，烷烴類40種，含硫類4種和雜環(huán)類5種。

表1 兩種不同提取方法檢測四種不同品牌臘八豆的揮發(fā)性風味物質相對含量Table 1 Two different extraction methods for detecting the relative content of volatile flavor compounds in four different brands of fermented soybeans

續(xù) 表

續(xù) 表

續(xù) 表

SDE法鑒定出4種臘八豆樣品中各類化合物的相對含量見圖1，這些香氣成分分別占總峰面積的94.4%、87.51%、89.64%、84.52%。共鑒定出物質98種，包括醇類12種，醛類13種，酮類5種，醚類6種，酚類3種，酸類3種，酯類14種，烷烴類34種，含硫類3種和雜環(huán)類5種。

圖1 SDE提取臘八豆揮發(fā)性風味物質相對含量Fig.1 The relative content of volatile flavor compounds extracted from fermented soybeans by SDE

HS-SPME法鑒定出4種臘八豆樣品中各類化合物的相對含量見圖2，這些香氣成分分別占總峰面積的75.22%、76.41%、77.02%、77.15%。共鑒定出物質73種，包括醇類8種，醛類5種，酮類3種，醚類6種，酚類4種，酸類2種，酯類7種，烷烴類31種，含硫類3種和雜環(huán)類4種。分析結果表明，SDE法比HS-SPME法能較好地檢測出臘八豆中的揮發(fā)性風味物質，特別是醇類、醛類和酯類物質。

圖2 HS-SPME提取臘八豆揮發(fā)性風味物質相對含量Fig.2 The relative content of volatile flavor compounds extracted from fermented soybeans by HS-SPME

大多數揮發(fā)物質在兩種方法(SDE法和HS-SPME法)中都能檢測到，但是某些物質只被其中一種方法檢測到，如正己醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、棕櫚酸、十四酸乙酯、亞油酸乙酯、硬脂酸乙酯、姜烯、(S)-β-紅沒藥烯、β-倍半水芹烯等物質僅在SDE法中被檢測到；丁香酚、4-異丙基環(huán)己烷-1,3-二烯甲醛、(+)-γ-古蕓烯、二十二烷、二十八烷等物質僅在HS-SPME法中被檢測到。兩種方法結合能夠更好地檢測出臘八豆中揮發(fā)性風味物質。

2.2 臘八豆中主要揮發(fā)性風味物質

4種臘八豆樣品中，JC樣品、LMZ樣品、TYGS樣品、TDJ樣品分別鑒定出73種、66種、77種和77種揮發(fā)性物質，檢出次數較多且含量較豐富的物質有芳樟醇、2-茨醇、1-辛烯-3-醇、檸檬醛、甲基庚烯酮、茴香腦、乙基麥芽酚、棕櫚酸乙酯、蒎烯、莰烯、檜烯、α-姜黃烯、正二十烷、正二十一烷、烯丙基二硫等。JC樣品的SDE法檢測出了較高的醇類物質，主要是芳樟醇含量很高；HS-SPME法檢測出的乙基麥芽酚含量很高，未檢測出酯類物質。LMZ樣品在4種樣品中烷烴類物質和酯類物質占比最大，用SDE法未鑒定出醚類。TYGS樣品相對于其他樣品含有較多的含硫類物質和雜環(huán)類物質。TDJ樣品中雜環(huán)類物質較其他樣品含量最多，且用HS-SPME法檢測出的酯類物質和烷烴類物質較其他樣品均較少。

2.2.1 醇類化合物

不飽和醇的閾值相對于直鏈飽和醇的閾值相對較低，對風味的形成有較大的貢獻作用[8]。1-辛烯-3-醇天然存在于蘑菇、甜瓜、茶葉、麥芽中[9]，具有草藥味和蘑菇香；2-茨醇又被稱為冰片，有類似樟腦氣味；桉葉油醇具有樟腦氣息和清涼的草藥味道；香茅醇具有玫瑰樣氣味等；芳樟醇具有花香與木香；4-萜烯醇呈暖的胡椒香、較淡的泥土香和陳腐的木材氣息；α-松油醇具似海桐花的清香，甜的紫丁香、鈴蘭氣息[10]，各種醇香相互調和，賦予了臘八豆特有的風味特征[11]。醇類對其他物質還具有調香作用，如與酸反應生成酯類。醇是形成多種物質的前體物質，同時醇也可以使產品具備微甜醇厚的風味，是極為重要的風味物質與風味前體物質之一[12]。

2.2.2 醛、酮類化合物

醛類的閾值較低，給予食物清香和果香的芳香特質，微量的醛可在香氣中起到調和的作用。在發(fā)酵過程中，醛類化合物可以通過脂質過氧化和降解產生[13]，也可以通過氨基酸的Strecker降解產生，也有部分是醛酸途徑的產物。在臘八豆樣品中含量較高的有糠醛、苯乙醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、橙花醛、檸檬醛等?？啡?、苯甲醛有特殊的杏仁氣味，苯乙醛具有風信子香氣，可用于調配草莓和櫻桃等香精，也能夠賦予醬甜香和水果樣的香氣。直鏈醛類化合物主要是由脂肪氧化降解產生的，具有6個碳原子以上的醛類是脂肪氧化的典型產物[14]。4-異丙基苯甲醛可用作香料，少量用于金合歡、紫羅蘭、風倍子、紫丁香、鈴蘭等香型的香精中；(E,E)-2,4-庚二烯醛是典型的亞油酸氧化產物，有桔子和甜橙的香氣，帶有脂肪氣息[15]，主要用于配制雞肉香精及土豆片、柑橘、油炸品和香辛型食品。

酮類物質大多是脂肪氧化和Maillard反應的產物，一般認為酮類物質具有清香味、奶油氣味和果香味。本實驗檢測出的酮類物質共有6種，3-乙酰基-4-羥基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮含量較高，甲基庚烯酮具有檸檬草的香氣，在大多數樣品中都能檢測到。酮類物質閾值較醛類物質高，且檢測出的酮類物質含量和種類均較少，對臘八豆的貢獻可能相對較小。

2.2.3 醚、酚類化合物

雖然醚類化合物的相對含量比較低，但其對臘八豆香味成分的貢獻不容忽略。其中，含量相對較高的烯丙基甲基二硫醚有茴香和草香香氣，有增加香味的效果。二烯丙基三硫醚具有大蒜味與沖鼻氣味。

發(fā)酵豆制品中的酚類物質雖然含量極微，但作為香氣成分作用十分明顯，很容易被察覺[16]。檢出的酚類如乙基麥芽酚具有持久的焦糖和水果香氣，是一種食品添加劑，丁香酚有像丁香的氣味，2,4-二叔丁基苯酚是一種增塑劑。

2.2.4 酸類化合物

在臘八豆樣品中共檢測出4種酸類，分別是2-氨基-5-甲基苯甲酸、脫氫乙酸、棕櫚酸和亞油酸。脫氫乙酸可能是由乙酸脫氫生成，乙酸還可以合成乙酸酯類物質，增加臘八豆香氣，有機酸可以調節(jié)食物味道，使整體味道更加柔和[17]。微生物生長分泌的酶可以將大豆中油脂分解成長鏈脂肪酸，脂肪酸本身氧化降解和氨基酸降解后經氧化或還原作用可以生成低級酸類物質，酸類物質具有刺激性氣味，能調和臘八豆的風味[18]。

2.2.5 酯類化合物

酯類化合物是傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬香氣不可缺少的重要組成部分。酯類化合物多數由細菌產生的有機酸和酵母產生的醇在酯化酶的催化下形成[19]。如乳酸乙酯、己酸乙酯等，呈現出微帶果香的酒香，是構成醬香味的主體成分，可以由酵母酶催化生成，也可以通過有機酸和醇的酯化反應生成。豆類發(fā)酵食品中還含有亞油酸乙酯、十六酸乙酯、棕櫚酸乙酯、硬脂酸乙酯等酯類成分，可使臘八豆的香氣更豐富[20]。同時酯類還可以緩沖發(fā)酵豆制品中鹽分的咸味。

2.2.6 烷烴類化合物

檢測出的風味物質中，烷烴類的種類和含量都相對較高,包括C12～C28的烷烴以及一些支鏈烯烴等，其中有25種烷烴類在兩種檢測方法中均存在，另外SDE法檢測出單獨的10種，HS-SPME法檢測出單獨的6種，SDE法在提取過程中長時間的高溫蒸餾可能得到較多的長鏈烴[21]。

蒎烯、莰烯、水芹烯、檜烯、萜品油烯、β-欖香烯、順式-β-金合歡烯、(-)-α-蓽澄茄油烯、α-姜黃烯、姜烯、(S)-β-紅沒藥烯、β-倍半水芹烯等含量較高的烯烴在SDE法中幾乎都檢測到，其中α-姜黃烯在HS-SPME法中也都能檢測到。α-蒎烯是無色透明液體，有松節(jié)油氣味，是各種萜烯類合成香料的主要起始原料；α-姜黃烯存在于白肋煙葉中；水芹烯有黑胡椒、薄荷香氣。烯烴化合物閾值較低，對臘八豆風味的貢獻相對較大，也是一類主要的揮發(fā)性風味物質，而烷烴類化合物閾值較高，對臘八豆的風味貢獻較小[22]，但可能有助于提高臘八豆的整體風味。它們主要來源于脂肪酸烷氧自由基的均裂，正構烷烴可能來自脂肪的自動氧化，支鏈烷烴可能來自支鏈脂肪酸的氧化[23]。檢測出的烷類物質主要包括正十六烷、正十八烷、3-甲基十八烷、正二十烷、正二十一烷、正二十七烷等。正二十七烷主要存在于烤煙、白肋煙、香料煙煙葉和煙氣中[24]。烷烴類物質一般是合成大分子物質的基礎成分，也是合成某些香料的重要原料。

2.2.7 含硫、雜環(huán)類化合物

含硫化合物主要來源于含硫氨基酸的分解[25]。一般而言，含硫香料化合物是各類香料化合物中閾值最低的一類，在濃度很低時就可以產生令人愉快的食品香味，它們對食品的特征香味有很大的影響[26]。

雜環(huán)化合物是典型的呈香化合物，對發(fā)酵豆制品的風味影響也很大。雜環(huán)化合物來源于氨基酸和還原糖的Maillard反應，以及氨基酸的熱分解等[27]。含量較高的有3,4-二甲基噻吩、含硫雜環(huán)化合物等。在發(fā)酵豆制品中含量雖然不高，但仍與微生物的生長代謝息息相關，也是臘八豆風味成分中不可或缺的物質。

3 結論

本研究采用SDE法和HS-SPME法與GC-MS聯用分析4種臘八豆的揮發(fā)性風味成分，結果表明，兩種不同的提取方式檢測到的物質的種類與含量均不同，SDE法比HS-SPME法能較好地檢測出醇類、醛類和酯類物質，且SDE法檢出的物質相對峰面積均高于SPME法，但也有一部分物質只能被SDE法或HS-SPME法檢測到，兩種方法結合可以更好地檢測出臘八豆中揮發(fā)性風味物質。

不同品牌的臘八豆因為原料、菌種、生產工藝的不同，其相關的風味指標也有差異，JC樣品中醇類物質含量較高，LMZ樣品中酯類物質含量較高，TYGS樣品中含硫類和雜環(huán)類物質含量較高，TDJ樣品中雜環(huán)類物質含量較高，但4種樣品中烷烴類物質含量都很高。主要的揮發(fā)性風味物質在4種樣品中幾乎都能檢測到。1-辛烯-3-醇、桉葉油醇、芳樟醇、2-茨醇、α-松油醇、糠醛、苯乙醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、橙花醛、檸檬醛、甲基庚烯酮、烯丙基甲基二硫醚、乙基麥芽酚、丁香酚、棕櫚酸乙酯、蒎烯、莰烯、檜烯、α-姜黃烯、正二十烷、正二十一烷等物質對臘八豆的風味有重要貢獻作用，為進一步確定臘八豆風味成分的研究提供了基礎。