反復(fù)發(fā)作抑郁癥與5-羥色胺1A和5-羥色胺2A受體基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性研究☆

姚靜 龐劍月 何瑾 馮婷婷 張淑綺 李恒芬

遺傳是重性抑郁癥（major depressive disorder，MDD）發(fā)病的因素之一，但至今仍缺乏MDD相關(guān)功能基因突變的定位或可用于臨床的分子遺傳學(xué)標(biāo)記[1-3]。究其原因，除與影響功能基因蛋白表達(dá)的因素有關(guān)外，還與MDD表型異質(zhì)性及遺傳數(shù)據(jù)分析方法等有關(guān)[4-5]。既往研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)發(fā)作抑郁癥 （recurrent major depressive disorder，RMDD）患者似乎存在更高的遺傳傾向及復(fù)雜的臨床表征[6-7]。5-羥色胺 1A 受體（5-hydroxytryptamine 1A receptor，5-HTR1A）和 5-羥色胺 2A受體（5-hydroxtryptamine 2A receptor，5-HTR2A）相關(guān)藥物臨床效應(yīng)已揭示其與MDD關(guān)系密切，但有關(guān)兩者基因多態(tài)性研究的結(jié)果多不一致[8-9]。標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性（tagging single nucleotide polymorphisms，tagSNPs）是第三代遺傳學(xué)標(biāo)記，利用tagSNPs探討基因與疾病的關(guān)系，可大大縮小具有功能意義基因區(qū)域的尋找范圍[10]。本研究納入RMDD患者，結(jié)合有關(guān)5-HTR1A和5-HTR2A基因的文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫，選取高連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）值傾向的tagSNPs位點，探討RMDD與其關(guān)系，尋找RMDD的分子遺傳學(xué)標(biāo)記。

1 對象與方法

1.1 研究對象 病例組來自2005年11月至2017年5月（隨訪截點）鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院和新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院門診或住院的RMDD患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，F(xiàn)ourth Edition，DSM-IV）中重性抑郁障礙，反復(fù)發(fā)作的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②24項漢密爾頓抑郁量表 （24-item Hamilton depression rating scale，HAMD-24）總分≥21分；③漢族；④年齡 18～65歲，性別不限；⑤隨訪3年以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有腦器質(zhì)性精神障礙或其他精神障礙病史；②有遺傳性疾病家族史；③有精神發(fā)育遲滯或癡呆者；④有精神活性物質(zhì)濫用史。共納入1030例患者。

對照組來自2005年11月至2017年5月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院、新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院和河南科技學(xué)院校醫(yī)院體檢科的健康體檢者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①無精神障礙病史；②HAMD-24總分＜7分；③漢族；④年齡18～65歲，性別不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有遺傳性疾病家族史；②有精神發(fā)育遲滯或癡呆者；③有精神活性物質(zhì)濫用史。共納入851名對照。

本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 采用自編人口學(xué)資料問卷收集受試者社會人口學(xué)資料，包括姓名、性別、年齡、民族、婚姻狀況、工作狀況、受教育程度等。病例組診斷由接受過DSM-Ⅳ疾病結(jié)構(gòu)式臨床訪談[11]（Structured Clinical Interview for the DSM-Ⅳ AxisⅠ Disorders，SCID-I）培訓(xùn)的2名高年資精神科醫(yī)師 （主任醫(yī)師或副主任醫(yī)師）做出。入組受試者HAMD-24評估由2名研究員共同完成，先后共8名研究員，均接受過量表培訓(xùn)，并通過一致性檢驗（Kappa為0.87～0.95）。采用面談和電話相結(jié)合的方式進(jìn)行跟蹤隨訪，隨訪內(nèi)容包括病情變化、年發(fā)作頻次、用藥情況以及療效等，每年隨訪4次以上，隨訪3年以上診斷仍未變更者納入本研究病例組。

1.2.2 DNA樣本采集 所有受試者入組后采集靜脈血5 mL于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，-70℃保存待測。使用TIANGEN公司的DP348-3全血基因組DNA純化試劑盒成批提取受試者DNA，于-20℃中保存。

1.2.3 tagSNPs篩選及檢測 根據(jù)NCBI和NHGRI聯(lián)合構(gòu)建的dbSNP數(shù)據(jù)庫（Hapmap Data Rel28PhaseⅡ+Ⅲ，August10，onNCBI B36 assembly，dbSNPb126-CHB+JPT數(shù)據(jù)）初步選擇tagSNPs位點，設(shè)置條件為r2＞0.8，最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.001，最終選擇 5-HTR1A（rs878567） 和 5-HTR2A（rs1328683、rs17068986、rs9534495）的4個 tagSNPs。在 384孔板中用Sequenom質(zhì)譜分析（北京京虹匯盛科技有限公司質(zhì)譜儀）進(jìn)行tagSNPs位點基因分型檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0對一般資料進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用檢驗進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡（H-W平衡）檢驗。利用SHEsis軟件，采用檢驗對基因型和等位基因頻率分布進(jìn)行組間比較，計算比值比（odds ratio，OR）和95%可信區(qū)間（confidence intervals，CI）。采用 SNPstats 軟件，使用非條件logistic回歸分析單位點基因型與疾病關(guān)聯(lián)，根據(jù)阿凱克信息準(zhǔn)則 （Akaike information criteria，AIC）選擇最佳模型，即AIC值越小模型越準(zhǔn)確，統(tǒng)計結(jié)果均采用Bonferroni校正，檢驗水準(zhǔn)α=0.0125（0.05/4）。采用廣義多因子降維法（generalized multifactor dimensionality reduction，GMDR）BetaV0.7軟件包分析基因—基因交互作用。校正年齡和性別兩個協(xié)變量后，基于交叉驗證一致性和檢驗精確度選擇最佳基因—基因交互模型。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 社會人口學(xué)資料及臨床特征 病例組1030例患者，男性 422例（41.0%），女性 608例（59.0%）；年齡 18～65 歲，平均（39.1±13.6）歲；已婚 793 例（77.0%），未婚（含離異和喪偶）237 例（23.0%）；有工作 600例（58.3%），無工作 430例（41.7%）；高中及以下教育程度732例 （71.1%），本科及以上298例（28.9%）。對照組851名健康體檢者，男性468名（55.0%），女性 383名（45.0%）；年齡 18～65歲，平均（35.9±12.9）歲；已婚 630 名（74.0%），未婚 221名（26.0%）；有工作 470名（55.2%），無工作381名 （44.8%）；高中及以下教育程度600名（70.5%），本科及以上 251名（29.5%）。病例組和對照組性別構(gòu)成具有統(tǒng)計學(xué)差異 （=36.761，P＜0.001），其他資料組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。病例組初入組時 HAMD-24總分 （28.9±8.5）分；至本研究隨訪截點，病例組發(fā)作次數(shù)2～9次，中位數(shù)（上下四分位數(shù)）為 3（2，5）次。

2.2 H-W平衡檢驗 病例組和對照組4個tagSNPs的基因型和等位基因分布均符合H-W平衡定律（P＞0.05）。

2.3 基因型及等位基因頻率分布 病例組與對照組比較，5-HTR2A rs17068986基因型 （=8.727，P=0.013）及等位基因（=4.955，P=0.025）頻率分布差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，病例組T等位基因頻率高于對照組（OR=1.158，95%CI:1.018～1.318）。其他tagSNPs（rs878567、rs1328683、rs9534495）基因型及等位基因頻率在兩組間分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表 1）。

2.4 4個tagSNPs在不同遺傳模型中基因型分布5-HTR2A rs17068986基因型分布符合共顯性 （P=0.011，AIC=2519.7）、顯性（P=0.003，AIC=2517.9）和加性（P=0.036，AIC=2522.3）遺傳模型，其中顯性遺傳模型為最佳模型（AIC值最?。?，經(jīng)Bonferroni校正，該模型中基因型分布差異仍具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0125），該模型中病例組TT+TC基因型頻率高于對照組 （81.0%vs.75.4%，OR=1.410，95%CI:1.120～1.760）。其他 tagSNPs（rs878567、rs1328683、rs9534495）在不同遺傳模型中的基因型分布均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表 2）。

2.5 5-HTR1A與5-HTR2A基因交互作用 校正性別和年齡后，GMDR結(jié)果顯示一階、三階和四階模型均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。比較交叉驗證一致性及檢驗精確度，四階模型為最優(yōu)模型，該模型經(jīng)過1000次置換檢驗具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001），交叉驗證一致性為10/10，檢驗精確度為0.534。二階模型無統(tǒng)計學(xué)意義 （1000次置換檢驗P＞0.05）（表 3）。

表1 病例組與對照組基因型及等位基因頻率分布

表2 4個tagSNPs在不同遺傳模型中的基因型分布

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，5-HTR2A rs17068986位點等位基因頻率及基因型分布在兩組間存在統(tǒng)計學(xué)差異，TT+TC基因型攜帶者相對于CC基因型攜帶者患病風(fēng)險增加（OR=1.410），提示該位點可能為中國漢族RMDD患者的易感基因位點。全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association studies，GWAS）證實抑郁癥與精神分裂癥具有共同的遺傳風(fēng)險背景[12]，BANI-FATEMI等[13]發(fā)現(xiàn) rs17068986 位點與精神分裂癥患者自殺企圖密切相關(guān)，推測該位點與抑郁癥也可能存在關(guān)聯(lián)。rs17068986位于13號染色體，屬于內(nèi)含子區(qū)域的tagSNP。tagSNPs是在高度連鎖不平衡的基因組區(qū)域中具有代表性的SNPs，可代表其所在單體型區(qū)域的單體型（haplotype）信息。既往多項研究發(fā)現(xiàn)5-HTR2A基因的rs7997012位點與抑郁癥相關(guān)[14]，而rs17068986位點與該位點僅相距4 kb的距離，因此rs17068986位點極有可能連鎖該致病位點，在5-HTR2A基因的表達(dá)路徑上發(fā)揮一定作用，進(jìn)而增加RMDD的易感風(fēng)險。目前國內(nèi)外尚無其他關(guān)于RMDD與rs17068986位點的研究，因此該位點研究結(jié)果的可復(fù)制性及功能意義需要后續(xù)研究進(jìn)一步證實。

表3 5-HTR1A與5-HTR2A基因交互模型

一項包括日本人、白種人、德國人和意大利人的大樣本meta分析顯示5-HTR1A的rs878567位點與抑郁癥有關(guān)[15]，有研究顯示rs6295與抑郁癥發(fā)病有關(guān)，且rs878567與rs6295之間存在強連鎖不平衡[16]。國內(nèi)一項針對漢族人群5-HTR1A基因rs878567位點的研究則未見其與抑郁癥存在關(guān)聯(lián)[17]。本研究再次在中國漢族人群中探討rs878567、rs1328683和rs9534495與RMDD的關(guān)系，仍未找到關(guān)聯(lián)的證據(jù)，提示除種族因素外，不同的診斷亞型可能也是影響因素之一。rs878567位點位于5-HTR1A基因的3′非翻譯區(qū)，與rs6295位點僅相距2 kb距離，可能同屬一個單倍型，但本研究的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果未能證實其與RMDD有關(guān)，推測與其遺傳效應(yīng)過低有關(guān)。

抑郁癥屬多基因遺傳病，多個微效基因作用疊加是目前公認(rèn)的假說[18]，5-HTR1A和5-HTR2A基因也存在相互影響[19]。GMDR是目前分子遺傳領(lǐng)域常用的數(shù)據(jù)處理方法，可以獲得兩個以上基因是否存在交互作用的數(shù)據(jù)信息[20]。本研究采用GMDR方法發(fā)現(xiàn)，校正性別、年齡后，5-HTR1A（rs87856） 和 5-HTR2A （rs1328683、rs17068986、rs9534495）基因存在交互作用，提示5-HTR1A和5-HTR2A基因突變可產(chǎn)生交互作用，增加個體的RMDD易感風(fēng)險?！?-HT受體不平衡假說”認(rèn)為5-HTR1A和5-HTR2A的效應(yīng)相互影響或相互拮抗，目前國內(nèi)外研究也驗證了這一假說[21-22]，因此5-HTR1A和5-HTR2A基因交互作用對RMDD的影響從生物學(xué)角度也可以解釋。

本研究以RMDD患者為研究對象，目的是盡可能排除亞組異質(zhì)性，但仍不能完全排除其他亞型的患者，例如伴精神病性癥狀的抑郁癥患者。另外，SNP只是點突變，是否影響下游蛋白表達(dá)，以及其與其他低頻突變或罕見變異的關(guān)系等，均需后續(xù)研究加以證實。

致謝：衷心感謝新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院王新友主任及河南科技學(xué)院校醫(yī)院何茶葉院長在前期樣本收集過程中提供的幫助。