鹽度調(diào)節(jié)方式對(duì)培養(yǎng)海水養(yǎng)殖生物絮凝系統(tǒng)的影響

吳慧芳 ，羅國(guó)芝,2,3，譚洪新,2,3，蒙浩焱

( 1.上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306； 2.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心， 上海 201306； 3.水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306 )

隨著人們對(duì)水產(chǎn)品需求的不斷增長(zhǎng)，海水養(yǎng)殖迅猛發(fā)展[1]，取得了較高經(jīng)濟(jì)產(chǎn)值，也帶來(lái)了環(huán)境污染等問(wèn)題。生物絮凝技術(shù)是解決水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展所面臨的環(huán)境污染和降低飼料成本的有效替代技術(shù)[2]。該技術(shù)是基于城市污水處理的活性污泥法，利用細(xì)菌的同化將養(yǎng)殖水體的顆粒有機(jī)物、溶解有機(jī)物和無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化為細(xì)菌生物量的處理技術(shù)，主要通過(guò)調(diào)控養(yǎng)殖水體的碳氮比、溶解氧、pH等建立絮凝劑所適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，將有機(jī)廢物同化為微生物[3-4]。該技術(shù)可應(yīng)用在封閉式循環(huán)水養(yǎng)殖模式，以減少投喂量和養(yǎng)殖尾水的排放，降低周邊水域環(huán)境污染。

相對(duì)于淡水生物絮凝系統(tǒng)，海水生物絮凝系統(tǒng)主要受鹽度的影響。鹽度使絮團(tuán)成熟的時(shí)間明顯滯后，一般淡水生物絮團(tuán)成熟需約1個(gè)月時(shí)間[5]，而高鹽度的海水生物絮團(tuán)培養(yǎng)往往需要約2個(gè)月時(shí)間[6]，所需時(shí)間比淡水長(zhǎng)。面對(duì)高鹽環(huán)境，微生物會(huì)出現(xiàn)單細(xì)胞聚集以及內(nèi)源性呼吸加速的現(xiàn)象，通過(guò)分泌和細(xì)胞自溶釋放細(xì)胞有機(jī)組成成分，嚴(yán)重影響其生理功能[7-9]。在海水生物絮團(tuán)培養(yǎng)期間，常出現(xiàn)亞硝酸鹽氮累積現(xiàn)象[10-12]。在好氧顆粒序批式反應(yīng)器中，Cl-由0.2 g/L逐漸增至20 g/L時(shí)，對(duì)氨氧化進(jìn)程無(wú)明顯作用，但明顯抑制亞硝酸鹽氮氧化進(jìn)程[13]。面對(duì)海水生物絮團(tuán)培養(yǎng)過(guò)程中鹽脅迫造成的培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，尤其是亞硝酸鹽氮長(zhǎng)期積累的現(xiàn)象，需探索出合理的鹽度調(diào)節(jié)方式，以縮短海水生物絮團(tuán)的培養(yǎng)周期。

面對(duì)鹽度造成海水生物絮團(tuán)構(gòu)建耗時(shí)較長(zhǎng)的問(wèn)題，筆者采取了3種不同的鹽度調(diào)節(jié)方式構(gòu)建海水養(yǎng)殖生物絮凝系統(tǒng)，首先采用了鹽度直接調(diào)節(jié)的方式和鹽度緩慢調(diào)節(jié)的方式培養(yǎng)生物絮凝系統(tǒng)，其次由于淡水生物絮團(tuán)構(gòu)建時(shí)間明顯較海水生物絮團(tuán)構(gòu)建所需時(shí)間短，故以先培養(yǎng)淡水生物絮團(tuán)，再緩慢調(diào)節(jié)鹽度馴化成海水絮團(tuán)的淡水馴化的方式培養(yǎng)生物絮凝系統(tǒng)，旨在探索出海水生物絮團(tuán)培養(yǎng)的最佳鹽添加策略，以縮短培養(yǎng)周期。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置及材料

本試驗(yàn)共用9個(gè)容積為100 L的圓柱形養(yǎng)殖水桶，每3個(gè)桶用兩臺(tái)充氣泵。培養(yǎng)絮體所用的原料為鰻魚(yú)飼料(水分≤10.0%，粗蛋白≥48.0%，賴(lài)氨酸≥2.5%，粗脂肪≥4.0%，粗纖維≤3.0%，粗灰分≤17.0%，1.0%≥總磷≥2.8%)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將9個(gè)桶分為鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組3組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)桶加70 L自來(lái)水，曝氣3 d后每個(gè)桶加35 g鰻魚(yú)飼料，將溫度控制在約25 ℃，隨后進(jìn)行3組鹽度30的生物絮凝系統(tǒng)的啟動(dòng)，試驗(yàn)進(jìn)行到3個(gè)系統(tǒng)成熟為止。鹽度直接調(diào)節(jié)組是試驗(yàn)初期一次性直接加鹽使鹽度為30，悶曝(絮體培養(yǎng)前3 d悶曝72 h：曝氣8 h、停止曝氣16 h，依次循環(huán)3 d為止)結(jié)束后進(jìn)行絮體培養(yǎng)。鹽度緩慢調(diào)節(jié)組是悶曝結(jié)束后，每日鹽度增加5(9：00開(kāi)始，每隔3 h增加1)，至鹽度30為止。淡水馴化組是在悶曝后先進(jìn)行淡水絮體培養(yǎng)，待淡水絮體培養(yǎng)好后，按鹽度緩慢調(diào)節(jié)組的方式調(diào)控鹽度。生物絮團(tuán)啟動(dòng)階段，通過(guò)添加碳酸氫鈉使堿度保持在約250 mg/L(以碳酸鈣計(jì))[14]，用葡萄糖(古阜豐生物科技有限公司，內(nèi)蒙古)補(bǔ)充所需碳源，使碳氮比(氮為氨氮形式)為15，通過(guò)測(cè)鹽度來(lái)添加因蒸發(fā)而損失的水分。啟動(dòng)完成后，監(jiān)測(cè)3個(gè)處理組對(duì)10 mg/L的氨氮(10 mg/L的氨氮采用每升絮體中加3.82 mg氯化銨來(lái)調(diào)控)的去除效果。

1.3 試驗(yàn)指標(biāo)與測(cè)定方法

1.3.1 水質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

每隔1 d檢測(cè)水體的溫度、pH、溶解氧(WTW Multi 3430，德國(guó))并測(cè)定總氮、氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、溶解性有機(jī)碳和堿度[15]?？偟捎眠^(guò)硫酸鉀氧化—紫外分光光度法(型號(hào)UV20上海尤尼柯)測(cè)定。水樣經(jīng)0.45 μm濾膜抽濾后測(cè)定三態(tài)氮及溶解性有機(jī)碳，其中亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮和氨氮含量分別采用重氮—偶氮法、鋅鎘還原法和次溴酸鈉氧化法測(cè)定，溶解性有機(jī)碳含量使用多功能碳氮比分析儀(Multi N/C 2100，德國(guó))測(cè)定,堿度采用酸堿滴定指示法測(cè)定。

1.3.2 絮體成分指標(biāo)的測(cè)定

每20 d進(jìn)行生物絮體指標(biāo)測(cè)定?？偣腆w懸浮顆粒物采用稱(chēng)量質(zhì)量法測(cè)定，5 min和15 min的絮體沉降體積用英霍夫式錐形管測(cè)定。

1.3.3 生物絮體微生物樣品的采集與測(cè)序

生物絮體菌樣的采集：鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組在75 d取樣，淡水馴化組在75 d和39 d分別取樣。每次取50 mL水樣經(jīng)0.22 μm的濾膜抽濾后，冰箱-80 ℃保存，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，用Excel 軟件統(tǒng)計(jì)結(jié)果并繪制相關(guān)圖表。用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，用 LSD 進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)系統(tǒng)啟動(dòng)階段

2.1.1 三態(tài)氮的動(dòng)態(tài)變化

試驗(yàn)期間，3個(gè)處理組中pH、溶解氧、溫度、溶解性有機(jī)碳等水質(zhì)指標(biāo)見(jiàn)表1，均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組的堿度均值分別為(250.18±27.74) mg/L、(224.40±20.07) mg/L和(188.19±54.54) mg/L，有明顯差異(P<0.05)，淡水馴化組堿度明顯低于其他兩組。

表1 啟動(dòng)階段3個(gè)處理組中各水質(zhì)指標(biāo)的平均值、最小值和最大值Tab.1 Mean，min and max values of water quality parameters in three different treatment groups during start-up phase

(續(xù)表1)

指標(biāo)Index組別 Group直接鹽度調(diào)節(jié)組Direct salinity regulation group鹽度緩慢調(diào)節(jié)組Salinity slowly regulated group淡水馴化組Freshwater domestication group亞硝酸鹽氮/mg·L-1NO2--N平均值 Mean11.97±13.93a4.97±5.99b3.67±6.54b最大值 Max34.17±2.3516.33±0.4622.83±0.85最小值 Min0.01±0.010.02±0.000.01±0.01硝酸鹽氮/mg·L-1NO3--N平均值 Mean9.19±13.92b13.82±0.14.68ab19.72±16.77a最大值 Max38.22±1.2338.99±0.2440.54±0.71最小值 Min0.00±0.000.00±0.000.00±0.00總氨氮/mg·L-1NH4+-N平均值 Mean2.76±3.83a2.67±4.16a2.81±4.47a最大值 Max10.83±1.5315.16±1.4517.89±2.74最小值 Min0.01±0.000.00±0.000.00±0.00總氮/mg·L-1TN平均值 Mean57.01±3.00a55.01±4.14a58.50±5.43a最大值 Max62.34±0.5567.08±0.9967.67±3.64最小值 Min49.38±1.1947.83±0.6147.87±0.46溶解性有機(jī)碳/mg·L-1DOC平均值 Mean22.29±8.47a19.25±7.14a20.54±6.84a最大值 Max45.38±2.6837.81±4.1438.89±9.14最小值 Min7.41±1.143.61±1.1310.55±2.29堿度/mg·L-1Alk平均值 Mean250.18±27.74a224.40±20.07b188.19±54.54c最大值 Max281.67± 1.11261.66±9.63264.80±5.08最小值 Min194.97±5.87181.42±5.4781.59±6.39

注：同行數(shù)據(jù)上標(biāo)不同字母的平均值間存在顯著差異(P<0.05).

Note: means with different superscripts in the same line are significantly different (P<0.05).

3個(gè)處理組中，三態(tài)氮和總氮含量隨鹽度添加方式的動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖1。3個(gè)處理組中氨氮含量的變化無(wú)顯著差異(P>0.05)，均先升后降，其中鹽度直接調(diào)節(jié)組氨氮含量在第9 d達(dá)峰值(10.83±1.53) mg/L，第39 d降至(0.01±0.00) mg/L；鹽度緩慢調(diào)節(jié)組在第9 d達(dá)峰值(15.16±1.45) mg/L，第19 d降至(0.30±0.36) mg/L；淡水馴化組在第5 d達(dá)到峰值(17.90±2.74) mg/L，第23 d降至(0.45±0.26) mg/L(圖1a)。雖然淡水馴化組氨氮含量先升高至峰值，但鹽度緩慢調(diào)節(jié)組先于鹽度直接調(diào)節(jié)組和淡水馴化組降至低含量水平。后期淡水馴化組氨氮含量有所波動(dòng)，第55 d時(shí)升至(1.18±0.87) mg/L。3個(gè)處理組中亞硝酸鹽氮的變化趨勢(shì)隨氨氮含量的降低均先升后降(圖1b)。其中鹽度緩慢調(diào)節(jié)組分別在第13、17 d開(kāi)始上升，鹽度直接調(diào)節(jié)組第23 d才開(kāi)始上升。鹽度直接調(diào)節(jié)組亞硝酸鹽氮含量峰值達(dá)(34.17±2.35) mg/L，鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組峰值分別為(16.33±0.45) mg/L、(22.83±0.85) mg/L，鹽度直接調(diào)節(jié)組峰值顯著高于鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組兩組(P<0.05)。雖然鹽度緩慢調(diào)節(jié)組亞硝酸鹽氮含量先升高，但淡水馴化組先于鹽度緩慢調(diào)節(jié)組在第37 d降至(0.20±0.14) mg/L，鹽度緩慢調(diào)節(jié)組在第49 d時(shí)降至(0.10±0.06) mg/L，鹽度直接調(diào)節(jié)組直到63 d時(shí)降至(0.02±0.01) mg/L。后期除淡水馴化組亞硝酸鹽氮含量在57 d升至(4.04±0.31) mg/L，有所波動(dòng)外，3個(gè)處理組亞硝酸鹽氮含量均低于0.50 mg/L。3個(gè)處理組中硝酸鹽氮含量的變化總趨勢(shì)是先維持較低含量水平，后期逐漸升高(圖1c)。淡水馴化組在25 d時(shí)開(kāi)始上升，在41 d時(shí)達(dá)到(37.99±1.57) mg/L，鹽度直接調(diào)節(jié)組硝酸鹽氮含量的變化與淡水馴化組有顯著差異(P<0.05)，第49 d時(shí)才開(kāi)始上升，第61 d達(dá)到(34.75±0.54) mg/L。鹽度緩慢調(diào)節(jié)組硝酸鹽氮含量變化與鹽度直接調(diào)節(jié)組、淡水馴化組無(wú)顯著差異(P>0.05)，第33 d開(kāi)始上升，在55 d達(dá)到(30.94±0.85) mg/L。3個(gè)處理組中總氮含量差異不顯著(P>0.05)，在(47.83±0.61) mg/L和(67.67±3.64) mg/L之間波動(dòng)(圖1d)。

圖1 3個(gè)處理組中氨氮(a)、亞硝酸鹽氮(b)、硝酸鹽氮(c)及總氮(d)的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamics of total ammonia-N(a), nitrite-N(b), nitrate-N(c) and total nitrogen(d) in the three different groups

2.1.2 絮體沉降體積與總固體懸浮物含量

3個(gè)處理組中5 min的絮體沉降體積波動(dòng)幅度較大且差異顯著(P<0.05)。鹽度直接調(diào)節(jié)組第7 d 時(shí)，5 min的絮體沉降體積達(dá)到最大值(60.00±0.00) mL/L，第9 d開(kāi)始降至(0.00±0.00) mL/L，第43 d開(kāi)始上升，至最高值(12.33±1.25) mL/L；鹽度緩慢調(diào)節(jié)組5 min的絮體沉降體積在前57 d先上升后，維持在40.00～65.00 mL/L，在第59 d時(shí)突降至(0.00±0.00) mL/L，而第65 d時(shí)又升至(80.67±14.82) mL/L，最后維持在約60.00 mL/L；淡水馴化組5 min的絮體沉降體積先升高，第15 d達(dá)到最大值(106.67±36.82) mL/L，后又降低，在第47 d時(shí)降至(2.00±0.00) mL/L，后期在(6.00±1.63) mL/L至(44.00±9.09) mL/L之間波動(dòng)(圖2a)。3個(gè)處理組15 min的絮體沉降體積變化趨勢(shì)中，鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組較為一致，鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩調(diào)節(jié)組差異顯著(P<0.05)。其中鹽度直接調(diào)節(jié)組和淡水馴化組15 min的絮體沉降體積先升高，分別在第19 d和13 d達(dá)峰值(103.33±1.63) mL/L和(76.67±12.47) mL/L，后逐漸降低，分別在第45 d和47 d后維持在2.00～18.00 mL/L和18.00～53.00 mL/L。鹽度緩慢調(diào)節(jié)組試驗(yàn)期間15 min的絮體沉降體積變化不大，自試驗(yàn)開(kāi)始后升至(30.33±5.56) mL/L，維持在30.00～50.00 mL/L，試驗(yàn)后期稍上升，但上升幅度不大(圖2b)。

鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組總固體懸浮顆粒物含量變化一致，無(wú)明顯差別(P>0.05)，其中鹽度直接調(diào)節(jié)組總固體懸浮顆粒物含量為1400～2000 mg/L；鹽度緩慢調(diào)節(jié)組總固體懸浮顆粒物含量為950～2000 mg/L；淡水馴化組總固體懸浮顆粒物含量先維持在350～550 mg/L，后迅速升至1300～1800 mg/L，較鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組有顯著性差異(P<0.05)(圖3)。

2.1.3 3個(gè)處理組生物絮凝系統(tǒng)中微生物多樣性

對(duì)3個(gè)處理組淡水組(淡水馴化組前期淡水啟動(dòng)完成組)和海水啟動(dòng)完成組(鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組)4組生物絮團(tuán)進(jìn)行了以下方面的多樣性分析。

2.1.3.1 微生物多樣性及豐度

對(duì)樣本序列在97 %的相似水平下進(jìn)行聚類(lèi)分析，得到微生物運(yùn)算分類(lèi)單元水平的物種韋恩圖(圖4)。鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組、淡水組中運(yùn)算分類(lèi)單元分別為421、459、505和436個(gè)，4組共有的運(yùn)算分類(lèi)單元為93個(gè)，占4組總數(shù)的11.44%，鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組和淡水馴化組共有的運(yùn)算分類(lèi)單元為256個(gè)，占3組總數(shù)的44.83%，淡水組獨(dú)有的運(yùn)算分類(lèi)單元為242個(gè)，占淡水組的55.51%，淡水組和淡水馴化組共有的運(yùn)算分類(lèi)單元為62個(gè)，明顯較淡水組和鹽度直接調(diào)節(jié)組以及淡水組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組共有的運(yùn)算分類(lèi)單元多(淡水組與鹽度直接調(diào)節(jié)組和淡水組與鹽度緩慢調(diào)節(jié)組分別共有的運(yùn)算分類(lèi)單元分別為4個(gè)和9個(gè))。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組3組的物種運(yùn)算分類(lèi)單元無(wú)明顯差異，但是，淡水組與其他3組運(yùn)算分類(lèi)單元有顯著性差異。

圖2 3個(gè)處理組中絮體沉降體積5 min(a)和15 min(b)的動(dòng)態(tài)變化Fig. 2 Dynamic changes in flocs volume of FV-5 min(a) and FV-15 min(b) in the three different groups

圖3 3個(gè)處理組中總固體懸浮物含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamics of total suspended solids in the three different groups

圖4 3個(gè)處理組的物種韋恩圖Fig.4 Species Venn diagram of the three different groups

通過(guò)對(duì)單樣本的Alpha多樣性分析可以反映微生物群落的多樣性和豐度。反映群落多樣性的常用指數(shù)有：香農(nóng)指數(shù)(香農(nóng)指數(shù)值越大，群落多樣性越高)和辛普森指數(shù)(辛普森指數(shù)值越大，群落多樣性越低)。反映群落豐度的常用指數(shù)有Chao和Ace指數(shù)。除淡水組多樣性略高于其他3組，鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組多樣性無(wú)明顯差異；結(jié)合各組的運(yùn)算分類(lèi)單元值，以及Chao、Ace指數(shù)，發(fā)現(xiàn)鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組和淡水組微生物物種的豐度均低于淡水馴化組(表2)。

2.1.3.2 微生物門(mén)水平和綱水平的群落結(jié)構(gòu)

在門(mén)水平上，鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組的主要優(yōu)勢(shì)菌群為擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)，前者占鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組菌群的37.77%和38.77%，后者占27.34%和27.23%，放線菌門(mén)豐度也較高，分別占鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組的15.18%和14.55%；放線菌門(mén)為淡水馴化組和淡水組的主要優(yōu)勢(shì)菌群，豐度分別為33.22%和 34.18%。除放線菌門(mén)外，淡水馴化組主要優(yōu)勢(shì)菌群還有擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)，豐度分別為36.37%和17.51%，淡水組主要優(yōu)勢(shì)菌群還有變形菌門(mén)，豐度占淡水組菌群的40.71%(圖5a)。鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組3組擬桿菌門(mén)的豐度明顯高于淡水組(P<0.05)，淡水馴化組、淡水組放線菌門(mén)明顯較鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組高(P<0.05)，淡水組變形菌門(mén)明顯高于其他3組(P<0.05)。綠彎菌門(mén)、浮霉菌門(mén)和Parcubacteria在4組中豐度也較高，但差異不顯著(P>0.05)(圖6a)。

表2 3個(gè)處理組物種的豐度和多樣性Tab.2 The abundance and diversity of species in three different groups

在綱水平上，鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組中優(yōu)勢(shì)菌群有黃桿菌綱(其豐度分別占鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組的25.13%和21.91%)、放線菌綱(15.18%、14.55%)、α-變形菌綱(14.36%、17.56%)和鞘脂桿菌綱(11.25%、15.69%)，其中γ-變形菌綱和暖繩菌綱豐度也較高；淡水馴化組主要優(yōu)勢(shì)菌群有黃桿菌綱(31.69%)和放線菌綱(33.22%)(圖5b)。α-變形菌綱在淡水馴化組中也有較高豐度，占12.12%；淡水組主要優(yōu)勢(shì)菌綱為放線菌綱(34.18%)和α-變形菌綱(27.05%)，此外γ-變形菌綱和暖繩菌綱在淡水組中豐度所占比例也較高(圖5b)。淡水馴化組、淡水組中放線菌綱豐度明顯較鹽度直接調(diào)節(jié)組和鹽度緩慢調(diào)節(jié)組高(P<0.05)，淡水組黃桿菌綱和α-變形菌綱豐度與其他3組有明顯差異(P<0.05)，淡水組γ-變形菌綱和暖繩菌綱的豐度明顯較淡水馴化組高(圖6b)。

圖5 3個(gè)處理組優(yōu)勢(shì)菌群在門(mén)水平(a)和綱水平(b)上的分布Fig.5 Predominant bacterial community at phylum level(a)and class level(b)in the three different groups

圖6 3個(gè)處理組中優(yōu)勢(shì)菌群在門(mén)水平(a)和綱水平(b)分布的差異性Fig.6 The differences in predominant bacterial community at phylum level(a) and class level(b) in the three different groups

2.1.3.3 微生物屬水平上物種的組成

對(duì)4組樣本的菌群進(jìn)行了群落屬水平物種組成heatmap圖和樣本聚類(lèi)樹(shù)分析(圖7)。淡水組優(yōu)勢(shì)菌屬與鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組3組優(yōu)勢(shì)菌屬組成存在顯著差異，而鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組和淡水馴化組3組優(yōu)勢(shì)菌屬組成及豐度差異不顯著。鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組3組的主要優(yōu)勢(shì)菌屬為L(zhǎng)eptobactrium(在鹽度直接調(diào)節(jié)組、鹽度緩慢調(diào)節(jié)組、淡水馴化組3組中豐度分別占27.00%、24.00%和34.00%，)、norank_f_Segniliparacea(9.00%、13.00%、32.00%)、Amaricoccus(4.00%、9.00%和7.00%，)，鹽度直接調(diào)節(jié)組優(yōu)勢(shì)菌屬還有norank_f_Saprospiraceae(10.00%)、norank_f_Caldilineaceae(6.00%)、副球菌屬(Paracoccus)(5.00%)、紅球菌屬(Rhodococcus)(5.00%)，鹽度緩慢調(diào)節(jié)組優(yōu)勢(shì)菌屬還有Phaeodactylibacter(9.00%)和Norank_f_Anaerolineaceae(5.00%)；淡水組優(yōu)勢(shì)菌屬主要有中村氏菌屬(Nabamurella)(18.00%)、norank_f_Caldilineaceae(12.00%)、norank_f_Segniliparacea(10%)、Woodsholea(9.00%)、溶桿菌屬(Lysobacter)(8.00%)、劍菌屬(Ensifer)(6.00%)、副球菌屬(6.00%)、Paenarthrobacter(5.00%)。

2.2 啟動(dòng)完成后氨氮的轉(zhuǎn)化效果

在10 mg/L的氨氮處理過(guò)程中，3組氨氮含量逐漸降低后，維持在低含量水平，3組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖8a)。其中鹽度直接調(diào)節(jié)組最先在5 h時(shí)降至(0.41±0.14) mg/L，后降至低于0.04 mg/L；淡水馴化組在第6 h降至(0.33±0.06) mg/L，后降至低于0.04 mg/L；鹽度緩慢調(diào)節(jié)組在第7 h降至0.23±0.04 mg/L，較鹽度直接調(diào)節(jié)組和淡水馴化組慢，后降至低于0.07 mg/L。

隨著氨氮含量的降低，3個(gè)處理組中亞硝酸鹽氮含量先升后降，其中鹽度直接調(diào)節(jié)組最先在第5 h升高至峰值(0.99±0.16) mg/L，在第9 h降至(0.05±0.01) mg/L；淡水馴化組在第6 h升至峰值(0.80±0.02) mg/L，在第12 h降至(0.05±0.01) mg/L；鹽度緩慢調(diào)節(jié)組在第6 h升至峰值(1.27±0.08) mg/L，在第13 h降至(0.03±0.04) mg/L。

圖7 物種屬水平的相對(duì)豐度Fig.7 Relative abundance of batterial clusters at genus level in the three groups

圖8 3個(gè)處理組中氨氮(a)，亞硝酸鹽氮(b)，硝酸鹽氮(c)及總氮(d)的動(dòng)態(tài)變化Fig.8 Dynamics of total ammonia-N(a),nitrite-N(b),nitrate-N (c)and total nitrogen(d) in the water in the three different groups

3組間亞硝酸鹽氮的變化無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖8b)。

鹽度直接調(diào)節(jié)組硝酸鹽氮質(zhì)量濃度由最初的(38.69±2.30) mg/L降至最終的(36.57±2.32) mg/L；鹽度緩慢調(diào)節(jié)組和淡水馴化組硝酸鹽氮含量始終無(wú)明顯變化(P>0.05)(圖8c)。

3個(gè)處理組中，總氮含量均有所升高。鹽度直接調(diào)節(jié)組由(77.44±4.76) mg/L升至(82.55±2.19) mg/L；鹽度緩慢調(diào)節(jié)組由(86.28±5.54) mg/L升至(89.33±3.52) mg/L；淡水馴化組由(79.24±1.51) mg/L升至(81.20±2.24) mg/L。鹽度直接調(diào)節(jié)組總氮含量較高于鹽度緩慢調(diào)節(jié)組和淡水馴化組(圖8d)。

3 討 論

3.1 反應(yīng)系統(tǒng)啟動(dòng)階段

3.1.1 不同鹽度調(diào)節(jié)方式對(duì)生物絮凝反應(yīng)器啟動(dòng)過(guò)程中水質(zhì)的影響

在采用有機(jī)糞便或飼料等培養(yǎng)生物絮凝的氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程中，首先會(huì)發(fā)生氨化過(guò)程，即氨化細(xì)菌將含氮的飼料糞便等有機(jī)物降解為無(wú)機(jī)氨氮。從系統(tǒng)中氨氮含量的動(dòng)態(tài)變化看，較淡水馴化組，培養(yǎng)初期發(fā)生的氨化過(guò)程中，鹽的添加對(duì)有機(jī)物降解為無(wú)機(jī)氨有一定的滯后作用，即鹽度可能對(duì)氨化細(xì)菌有一定的抑制作用，但是抑制效果不明顯，且初期緩慢分批增加鹽度的處理組氨氮先降至低水平，說(shuō)明有可能鹽度緩慢調(diào)節(jié)的方式有助于氨氮的轉(zhuǎn)變；結(jié)合氨氮和亞硝酸鹽氮含量的變化，3個(gè)處理組中直接調(diào)節(jié)鹽度的方式，氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽氮的過(guò)程比前期不添加鹽的淡水馴化組明顯滯后，氨氧化細(xì)菌明顯被抑制；但是緩慢調(diào)節(jié)時(shí)，氨氮的抑制作用明顯減弱，甚至不存在，說(shuō)明系統(tǒng)中氨氧化細(xì)菌對(duì)鹽度沖擊具有一定的緩沖能力。后期硝酸鹽氮含量的積累過(guò)程表明，鹽度明顯抑制亞硝酸鹽氮氧化過(guò)程，而直接鹽度調(diào)節(jié)的方式，抑制作用更明顯。本試驗(yàn)結(jié)果與Pronk等[13]的研究結(jié)果一致，在好氧顆粒序批式反應(yīng)器中，鹽離子對(duì)氨氧化無(wú)明顯的抑制作用，但明顯抑制亞硝酸鹽氮氧化進(jìn)程。

整個(gè)啟動(dòng)階段中，3個(gè)處理組總氮含量無(wú)明顯變化，說(shuō)明整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，幾乎不存在反硝化過(guò)程和外界氮?dú)獾鹊墓痰饔谩Ｔ囼?yàn)后期淡水馴化組氨氮含量有所積累，可能是系統(tǒng)中存在明顯的異養(yǎng)型細(xì)菌。后期氨氮含量很低，碳源添加減少，硝化型細(xì)菌逐漸占優(yōu)勢(shì)，氨氮不能被直接利用。結(jié)合不同添加方式中三態(tài)氮和總氮含量的動(dòng)態(tài)變化，先構(gòu)建淡水生物絮團(tuán)，再馴化成海水生物絮團(tuán)的淡水馴化組，培養(yǎng)周期最短，較直接調(diào)節(jié)鹽度的方式縮短了約20 d，較初期緩慢分批添加鹽的方式，縮短了5～10 d，但啟動(dòng)完成后，鹽度緩慢調(diào)節(jié)組的系統(tǒng)運(yùn)行更穩(wěn)定，啟動(dòng)所需時(shí)間和系統(tǒng)穩(wěn)定性看，鹽度緩慢調(diào)節(jié)組更有利于海水生物絮凝系統(tǒng)的構(gòu)建。

3.1.2 不同鹽度調(diào)節(jié)方式對(duì)啟動(dòng)過(guò)程中生物絮體沉降性和總固體懸浮物含量的影響

不同鹽度添加方式試驗(yàn)組的生物絮團(tuán)培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)比淡水馴化組，鹽度直接調(diào)節(jié)的方式，絮團(tuán)聚積，污泥膨脹減小，嚴(yán)重影響絮體的沉降性能，而鹽度緩慢調(diào)節(jié)的方式，對(duì)絮團(tuán)的沉降性無(wú)明顯影響。這與王淑瑩等[16-17]的研究一致，高鹽度的海水會(huì)使活性污泥中原生動(dòng)物和絲狀菌逐漸減少，菌膠團(tuán)變得更加密實(shí)。但是后期鹽度緩慢調(diào)節(jié)組5 min的沉降體積突然降至0.00 mg/L的原因有待于進(jìn)一步探究。

由總固體懸浮顆粒物含量的動(dòng)態(tài)變化可見(jiàn)，添加鹽會(huì)使系統(tǒng)中總固體懸浮顆粒物含量明顯升高。試驗(yàn)后期在自來(lái)水中加入海水晶，當(dāng)鹽度為30時(shí)，經(jīng)濾紙過(guò)濾測(cè)其總固體懸浮顆粒物值，發(fā)現(xiàn)所測(cè)值與鹽度直接調(diào)節(jié)組(鹽度為30)和淡水馴化組前期(鹽度為0.2)總固體懸浮顆粒物的差值幾乎相等，即海水生物絮凝系統(tǒng)中鹽的添加會(huì)增加整個(gè)系統(tǒng)的總固體懸浮顆粒物含量，因此培養(yǎng)海水生物絮凝時(shí)，所需的總固體懸浮顆粒物值應(yīng)是所測(cè)實(shí)際值減去相應(yīng)海水鹽度對(duì)應(yīng)的總固體懸浮顆粒物值。

3.1.3 不同鹽度調(diào)節(jié)方式對(duì)生物絮凝系統(tǒng)啟動(dòng)過(guò)程中微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

絮團(tuán)微生物高通量測(cè)序結(jié)果表明，3個(gè)處理組中，淡水組(淡水啟動(dòng)完成組)絮團(tuán)中微生物多樣性高于其他3組，說(shuō)明鹽度30的海水環(huán)境中一部分微生物種群會(huì)受到鹽的沖擊而死亡，生物多樣性降低，而淡水馴化組微生物的豐度高于其他3組，說(shuō)明淡水系統(tǒng)中某些微生物種群可能更適宜在高鹽環(huán)境中生長(zhǎng)，隨著鹽度緩慢加入，對(duì)高鹽環(huán)境適應(yīng)后迅速生長(zhǎng)，加之淡水啟動(dòng)完成組微生物多樣性最高，緩慢加入鹽后，適宜高鹽環(huán)境的微生物豐度增加。鹽度直接調(diào)節(jié)組略低于鹽度緩慢調(diào)節(jié)組，說(shuō)明直接調(diào)節(jié)鹽度對(duì)微生物沖擊作用較大。這與文獻(xiàn)[18-20]的研究結(jié)果一致。

對(duì)微生物門(mén)水平的分析發(fā)現(xiàn)，高鹽環(huán)境有利于擬桿菌門(mén)細(xì)菌的生長(zhǎng)，但抑制了變形菌門(mén)細(xì)菌的生長(zhǎng)。系統(tǒng)中若存在較高豐度的放線菌門(mén)細(xì)菌，鹽度緩慢增加對(duì)放線菌門(mén)細(xì)菌無(wú)抑制作用，但系統(tǒng)中放線菌門(mén)細(xì)菌豐度很低時(shí)，增加鹽度會(huì)抑制放線菌門(mén)細(xì)菌的生長(zhǎng)。對(duì)微生物綱水平的分析發(fā)現(xiàn)，鹽度有利于黃桿菌綱和鞘脂桿菌綱細(xì)菌的生長(zhǎng)，但抑制了α-變形菌綱細(xì)菌的生長(zhǎng)，對(duì)放線菌綱細(xì)菌的影響同其對(duì)放線菌門(mén)細(xì)菌的影響。對(duì)微生物屬水平的分析表明，Leptobactrium是海水生物絮凝系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌群，不受鹽調(diào)節(jié)方式的影響，只要系統(tǒng)中存在鹽度，就會(huì)刺激Leptobactrium的生長(zhǎng)，該菌屬黃桿菌科，占海洋細(xì)菌的33.3%[21]。添加鹽后系統(tǒng)中norank_f_Segniliparacea的豐度明顯升高，說(shuō)明將淡水生物絮凝馴化成海水生物絮凝時(shí)刺激了norank_f_Segniliparacea的生長(zhǎng)。鹽度緩慢調(diào)節(jié)組Phaeodactylibacter的豐度明顯高于其他3組。安治武[22]在研究微生物制劑對(duì)養(yǎng)殖水體的凈化效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，Phaeodactylibacter是將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的優(yōu)勢(shì)硝化細(xì)菌，其豐度占13.69%。對(duì)微生物的分析發(fā)現(xiàn)，鹽度調(diào)節(jié)方式對(duì)微生物豐度有一定影響，但是對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響，故3種鹽度的調(diào)節(jié)方式均可用于生物絮團(tuán)的構(gòu)建。

3.2 啟動(dòng)完成后不同鹽調(diào)節(jié)方式下氨氮等水質(zhì)指標(biāo)的變化

對(duì)10 mg/L的氨氮去除效果的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮含量的動(dòng)態(tài)變化無(wú)明顯差異(P>0.05)，說(shuō)明在海水生物絮凝系統(tǒng)構(gòu)建過(guò)程中，鹽度調(diào)節(jié)方式對(duì)氨氮的去除效果無(wú)明顯影響，3種鹽度調(diào)節(jié)方式均可用于海水生物絮凝系統(tǒng)的構(gòu)建。這與Kincannon等[23]的研究結(jié)果一致，經(jīng)過(guò)初期的滯后期后，微生物種群能夠適應(yīng)高鹽度環(huán)境，對(duì)絮凝的形成無(wú)持續(xù)抑制作用。

4 結(jié) 論

不同鹽度調(diào)節(jié)方式下海水生物絮團(tuán)培養(yǎng)的啟動(dòng)階段中，三態(tài)氮、絮團(tuán)沉降性、微生物群落結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)完成后氨氮轉(zhuǎn)化的分析結(jié)果表明，在培養(yǎng)好的淡水生物絮凝系統(tǒng)中緩慢調(diào)節(jié)鹽度的淡水馴化調(diào)節(jié)鹽度方式，啟動(dòng)培養(yǎng)周期最短；鹽度緩慢調(diào)節(jié)的方式，啟動(dòng)培養(yǎng)周期較淡水馴化組長(zhǎng)，但啟動(dòng)完成后系統(tǒng)運(yùn)行更穩(wěn)定；直接調(diào)節(jié)鹽度的方式運(yùn)行周期最長(zhǎng)。淡水馴化組微生物群落豐度較其他兩組高，但不同鹽度調(diào)節(jié)的海水生物絮凝啟動(dòng)的系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著性差異，結(jié)合啟動(dòng)完成后，3個(gè)處理組氨氮去除效果無(wú)顯著差異，故3種鹽度調(diào)節(jié)方式均可用于海水生物絮凝系統(tǒng)的構(gòu)建。綜上所述，鹽度緩慢調(diào)節(jié)的方式更有利于海水生物生物絮凝系統(tǒng)的構(gòu)建。