3種水質(zhì)調(diào)控方式下參池沉積物酶活性的比較研究

魏亞南，張東升，林 青，孫廣偉，雷兆霖，張津源，郭 超，陳濟豐，周 瑋,3

( 1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023； 2.廣州市海大集團(tuán)，廣東 廣州 510000； 3.大連市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)合會，遼寧 大連 116023 )

池塘養(yǎng)殖是遼寧、山東沿海海參的重要養(yǎng)殖方式，隨著海參養(yǎng)殖時間的延長，海參病害頻發(fā)[1]，有效改善海參池塘水質(zhì)質(zhì)量、實現(xiàn)高效健康養(yǎng)殖是相關(guān)研究的熱點問題。自然納潮[2]是海參養(yǎng)殖中原始的水質(zhì)調(diào)控方式，運行成本低，但沉積物中有機質(zhì)的分解能力較弱，高溫和溫躍層時期易造成池塘底部缺氧。微孔曝氣[3]是近年流行的一種海參養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控方式，其方法是在池底鋪設(shè)微孔增氧管道，提高水體氧化效率。但氣孔易堵塞，難于清理，維護(hù)成本較高。養(yǎng)水機是本項目團(tuán)隊在實施“十二五”國家支撐計劃項目中開發(fā)設(shè)計的新型水質(zhì)調(diào)控設(shè)備，作用方式是將表層水經(jīng)過生物包再沖入底層水，從而使得表、底層水持續(xù)交換，達(dá)到凈化水質(zhì)的目的。前期試驗顯示，養(yǎng)水機調(diào)控下的池塘海參成活率可達(dá)95%以上[2]，其水質(zhì)凈化效果與海參養(yǎng)殖效果均有明顯提高。

土壤中的酶反映了土壤的肥力[4]。施肥、耕種方式、土壤性質(zhì)都影響土壤中酶的活力，從而影響土壤中氮、磷、鉀等元素的可利用性，影響植物生長，因此深受農(nóng)業(yè)學(xué)者的重視，而有關(guān)養(yǎng)殖池塘中各種酶活性的變化，研究較少。林海[5]的研究表明，增氧池塘沉積物中蛋白酶、脲酶、蔗糖酶等酶活性分別高于自然池塘的3.98%、1.11%、1.25%。前期研究表明，養(yǎng)水機可以有效降低海參池塘沉積物有機質(zhì)含量[6]，提高異養(yǎng)菌數(shù)量[7]，上述結(jié)論與沉積物中酶活性的相關(guān)性研究，尚未見報道。筆者以自然納潮池塘、微孔曝氣池塘、養(yǎng)水機池塘為對象，對3種調(diào)控方式下海參池塘沉積物中淀粉酶、蛋白酶、堿性磷酸酶、脫氫酶的周年活性變化情況進(jìn)行跟蹤比較研究，擬從酶活性角度對3種水質(zhì)調(diào)控方式的機理進(jìn)行探討，旨在為海參健康養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控提供背景資料。

1 材料與方法

1.1 池塘條件

在大連寶發(fā)海珍品有限公司分別選擇自然海參養(yǎng)殖池塘2口，運行1年的微孔曝氣池塘和養(yǎng)水機池塘各2口。池塘規(guī)格均為長605 m、寬85 m的標(biāo)準(zhǔn)矩形池塘。池塘均為泥沙底質(zhì)，鋪設(shè)網(wǎng)礁，水泥護(hù)坡。每月大潮期間換水3～5 d，年水深為1.2～2.0 m。自然池塘未設(shè)相關(guān)水質(zhì)調(diào)控設(shè)施；微孔曝氣池塘底部鋪設(shè)1套微孔曝氣系統(tǒng)，由空壓機(0.15 W/m2)、總供氣管和微孔曝氣盤組成，按設(shè)備使用規(guī)范進(jìn)行管理操作；養(yǎng)水機池塘在池塘出水口設(shè)置養(yǎng)水機1臺(功率750 W)，每日21:00至翌日9:00共工作12 h，冬季正常工作。各池塘仿刺參(Apostichopusjaponicus)規(guī)格、密度相同，不投餌、不投藥，試驗期間統(tǒng)一管理。

1.2 樣品的采集及處理采樣時間及采樣點

2015年10月至2016年9月，每月大潮(農(nóng)歷十五)前3～5 d進(jìn)行采樣，冬季時將冰面鑿開采樣。采樣點設(shè)在進(jìn)水口、出水口及池塘中間位置。

間隙水采集：將間隙水采集器向水下垂直插入沉積物至預(yù)定深度(-10 cm)，靜置等待采集裝置內(nèi)充滿間隙水后，將其裝入具塞小瓶帶回實驗室進(jìn)行分析。

沉積物采集：參照《海洋調(diào)查規(guī)范》[8]第6部分海洋生物調(diào)查中規(guī)定的方法進(jìn)行采集，使用圓柱形采泥器(橫截面直徑5 cm)采集泥樣，取表層0～10 cm沉積物，去除植物根系、貝殼、石塊等雜質(zhì)，裝入無菌自封袋中帶回實驗室后，放在通風(fēng)良好且避光處風(fēng)干至恒定質(zhì)量，將風(fēng)干后樣品進(jìn)行研磨，用100目篩絹進(jìn)行過濾、混勻、封袋，4 ℃下保存待測。

1.3 沉積物部分理化因子的檢測

按照《海洋調(diào)查規(guī)范》[8]手冊采用YSI Prouplus型水質(zhì)分析儀測定間隙水溫度、pH、溶解氧；沉積物間隙水的總氮測定采用過硫酸鉀氧化法；底泥耗氧速率的測定采用實驗室測定法[9]；按照《海洋監(jiān)測規(guī)范》[10]中的的重鉻酸鉀氧化—還原容量法測定沉積物總有機碳、灼燒法測定沉積物有機質(zhì)含量。

1.4 酶活性的檢測

按照文獻(xiàn)[11]中方法，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定沉積物中淀粉酶活性，茚三酮比色法測定蛋白酶活性，磷酸苯二鈉比色法測定堿性磷酸酶活性，氯化三苯基四氮唑比色法測定脫氫酶活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

各種酶的試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各池塘酶和水質(zhì)之間的相關(guān)性采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析，以皮爾森系數(shù)表示相關(guān)性的大小，以P<0.05為相關(guān)，P<0.01為極相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1 3種水質(zhì)調(diào)控方式對海參池塘沉積物中淀粉酶活性的影響

各池塘沉積物中淀粉酶活性周年變化見圖1。其變化趨勢基本一致，自然納潮、微孔曝氣、養(yǎng)水機池塘最高值分別出現(xiàn)在6月、3月、5月，最低值均出現(xiàn)在1—2月。自然納潮池塘年變化為0.126～0.695 mg/g，極差0.569 mg/g，年均值(0.290±0.169) mg/g；微孔曝氣池塘年變化為0.210～0.830 mg/g，極差0.62 mg/g，年均值(0.410±0.199) mg/g；養(yǎng)水機池塘年變化為0.348～0.880 mg/g，極差0.532 mg/g，年均值(0.540±0.171) mg/g。3種水質(zhì)調(diào)控方式相比，養(yǎng)水機池塘沉積物中淀粉酶活性最高，但波動最小，自然池塘淀粉酶活性最低。

圖1 3種水質(zhì)調(diào)控方式下池塘沉積物中淀粉酶活性周年變化Fig.1 The annual change in amylase activity in pond sediments under three water quality control methods

2.2 3種水質(zhì)調(diào)控方式對海參池塘沉積物中蛋白酶活性的影響

各池塘沉積物中蛋白酶活性周年變化見圖2。其變化趨勢基本一致，自然納潮池塘和微孔曝氣池塘最高值均出現(xiàn)在10月，養(yǎng)水機池塘最高值出現(xiàn)在1月，各池塘最低值均出現(xiàn)在7—8月。自然池塘沉積物中蛋白酶活性年變化為0.063～0.472 mg/g，極差0.409 mg/g，年均值(0.230±0.084) mg/g；微孔曝氣池塘年變化為0.044～0.354 mg/g，極差0.310 mg/g，年均值(0.190±0.101) mg/g；養(yǎng)水機池塘年變化為0.024～0.294 mg/g，極差0.270 mg/g，年均值(0.16±0.125) mg/g。3種水質(zhì)調(diào)控方式相比，養(yǎng)水機池塘沉積物中蛋白酶活性最低，波動最小，自然池塘活性最高，波動最大。

圖2 3種水質(zhì)調(diào)控方式下池塘沉積物中蛋白酶活性周年變化Fig.2 The annual change in protease activity in pond sediments under three water quality control methods

2.3 3種水質(zhì)調(diào)控方式對海參池塘沉積物中堿性磷酸酶活性的影響

各池塘沉積物中堿性磷酸酶活性周年變化見圖3。其周年變化趨勢基本一致，最高值均出現(xiàn)在8月，最低值自然納潮池塘在3月，微孔曝氣和養(yǎng)水機池塘均在10月。自然池塘沉積物中堿性磷酸酶活性年變化為0.165～1.042 mg/g，極差0.877 mg/g，年均值(0.47±0.243) mg/g；微孔曝氣池塘年變化為0.068～0.726 mg/g，極差0.658 mg/g，年均值(0.32±0.193) mg/g；養(yǎng)水機池塘年變化為0.083～0.633 mg/g，極差0.550 mg/g，年均值(0.24±0.152) mg/g。3種水質(zhì)調(diào)控方式相比，養(yǎng)水機池塘沉積物堿性磷酸酶活性最低，波動最小，自然池塘年均值最高，波動最大。

圖3 3種水質(zhì)調(diào)控方式下池塘沉積物中堿性磷酸酶活性周年變化Fig.3 The annual change in alkaline phosphatase activity in pond sediments under three water quality control methods

2.4 3種水質(zhì)調(diào)控方式對海參池塘沉積物中脫氫酶活性的影響

各池塘沉積物中脫氫酶活性周年變化見圖4。其變化趨勢不一致，自然納潮池塘最高值出現(xiàn)在11月，最低值出現(xiàn)在8月，年變化為19.681～52.794 mL/g，極差33.113 mL/g，年均值(34.78±10.010) mL/g；微孔曝氣池塘最高值出現(xiàn)在6月，最低值出現(xiàn)在10月，年變化為12.200～31.638 mL/g，極差19.438 mL/g，年均值(19.88±6.184) mL/g；養(yǎng)水機池塘最高值出現(xiàn)在1月，最低值出現(xiàn)在7月，年變化為12.092～41.411 mL/g，極差29.319 mL/g，年均值(26.28±8.69) mL/g。3種水質(zhì)調(diào)控方式相比，微孔曝氣池塘沉積物脫氫酶活性最低，波動最小，與養(yǎng)水機池塘酶活性差異不顯著，自然池塘活性最高，波動性也最大，與微孔曝氣、養(yǎng)水機池塘差異性顯著(P<0.05)。

圖4 3種水質(zhì)調(diào)控方式下池塘沉積物中脫氫酶活性周年變化Fig.4 The annual change in dehydrogenase activity in pond sediments under three water quality control methods

2.5 3種水質(zhì)調(diào)控方式下沉積物部分理化指標(biāo)情況

3種水質(zhì)調(diào)控方式下沉積物部分理化指標(biāo)見表1。自然納潮池塘、微孔曝氣池塘及養(yǎng)水機池塘間隙水溫度年變化分別為-2.1～27.5 ℃、-2.0～27.1 ℃、-2.0～27.5 ℃，各池塘差異不顯著；間隙水pH年變化分別為7.3～8.5、7.4～8.5、7.4～8.6，各池塘差異不顯著；間隙水總氮年變化分別為23.930～48.140 mg/L、26.540～49.960 mg/L、28.730～40.540 mg/L，各池塘差異不顯著；沉積物總有機碳年變化分別為83.270～249.680 mg/L、77.690～408.510 mg/L、53.970～375.170 mg/L，各池塘差異不顯著；沉積物有機質(zhì)年變化為1.020%～1.430%、0.930%～1.230%、0.750%～1.030%，各池塘之間差異均極顯著(P<0.01)；沉積物底泥耗氧率年變化為711～996 mg/(m2·d)、666～731 mg/(m2·d)、633～726 mg/(m2·d)，自然納潮池塘與微孔曝氣池塘、養(yǎng)水機池塘差異均極顯著(P<0.01)，微孔曝氣池塘與養(yǎng)水機池塘差異不顯著。

表1 3種水質(zhì)調(diào)控方式下沉積物部分理化指標(biāo)Tab.1 Some of physicochemical indices of sediments under three water quality control methods

綜上所述，沉積物有機質(zhì)、蛋白酶、耗氧率、堿性磷酸酶及脫氫酶活性均在自然池塘中均值最高，變化幅度最大，淀粉酶活性則最低；而間隙水溫度、pH、總氮、總有機碳均在微孔曝氣池塘中均值最高。

2.6 3種水質(zhì)調(diào)控方式池塘沉積物酶活性與間隙水理化因子相關(guān)性

各池塘沉積物酶活性與間隙水理化因子相關(guān)性見表2。各池塘淀粉酶均與pH呈正相關(guān)；蛋白酶均與總氮呈正相關(guān)，與有機質(zhì)、pH、底泥耗氧率呈極負(fù)相關(guān)，與溫度呈負(fù)相關(guān)，在微孔曝氣池塘與養(yǎng)水機池塘中蛋白酶活性分別與堿性磷酸酶活性呈極負(fù)相關(guān)、負(fù)相關(guān)；堿性磷酸酶與總有機碳、溫度呈正相關(guān)；脫氫酶活性在自然納潮池塘與養(yǎng)水機池塘中與總氮呈正相關(guān)。

表2 3種水質(zhì)調(diào)控方式各池塘沉積物酶活性與間隙水理化因子的相關(guān)性Tab.2 Correlation between sediment enzyme activity and interstitial water physicochemical factors in three water quality control methods

注：*在0.05級別，相關(guān)性顯著；**在0.01級別，相關(guān)性極顯著.

Note: * denotes that the correlation is significant at the level of 0.05;** denotes that the correlation is very significant at the level of 0.01.

3 討 論

池塘沉積物酶是構(gòu)成沉積物的重要組成之一，數(shù)量少，作用大，產(chǎn)生于沉積物中的微生物、動物和植物根系生命活動的積累過程[12-15]。沉積物酶作為沉積物中一切生物化學(xué)反應(yīng)的主要參與者，在沉積物生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化中起著非常重要的作用，反映了沉積物中各種生物化學(xué)過程的強度和方向，其活性大小代表了沉積物中物質(zhì)代謝的旺盛程度[16]。

3.1 3種調(diào)控方式下各池塘沉積物酶活性周年變化分析

3.1.1 沉積物脫氫酶活性變化原因分析

在沉積物所含的所有酶中，脫氫酶反映了微生物代謝強度的大小，可以作為微生物氧化還原系統(tǒng)的指標(biāo)，被認(rèn)為能很好地表征沉積物中微生物的氧化能力[17]，與沉積物呼吸呈正相關(guān)，而與微生物量無關(guān)[17-18]。本研究測定的自然納潮池塘底泥耗氧量和脫氫酶含量最高，而同期測定的自然納潮池塘沉積物中可培養(yǎng)異養(yǎng)菌數(shù)量[7]最低，這樣的結(jié)果與文獻(xiàn)一致，這可能與采樣時間有關(guān)。采樣時自然納潮池塘與其他兩類池塘相比，有機質(zhì)含量最高，導(dǎo)致其微生物活性仍處于較高的水平，從側(cè)面反映了自然納潮池塘在換水前仍有大量可被微生物利用的有機質(zhì)存在，說明自然納潮池塘僅通過交換水不能有效地清除過多累積的有機物；而養(yǎng)水機和微孔曝氣池塘脫氫酶活性采樣時較低，說明池塘中可被微生物利用的有機質(zhì)較少[6]，這樣可被細(xì)菌利用的有機質(zhì)不會過多積累于池塘底部，在夏季高溫期，就不會大量消耗氧氣，產(chǎn)生有害化合物，而使池塘底部溶氧較高、水質(zhì)較好，有利于海參健康生長，特別是養(yǎng)水機池塘。

3.1.2 沉積物蛋白酶、堿性磷酸酶活性變化原因分析

蛋白酶廣泛存在于細(xì)菌、放線菌和真菌中，提供生物可利用氮，與土壤總氮呈正相關(guān)[19-21]，堿性磷酸酶能加速有機磷的脫磷速度[22]，與土壤中總磷呈正相關(guān)[4,20,23]，本研究測定的養(yǎng)水機池塘沉積物中蛋白酶含量和堿性磷酸酶含量與脫氫酶含量一樣，均最低，說明此時養(yǎng)水機池塘有機氮和有機磷的剩余量較少[6]，即養(yǎng)水機能夠快速去除池塘沉積物中的有機氮和有機磷，避免池塘沉積物有機氮和有機磷的積累，避免夏季高溫期厭氧發(fā)酵，毒害海參。

3.1.3 沉積物淀粉酶活性變化原因分析

淀粉酶是參與碳循環(huán)的重要酶類[24]，碳源分解一方面為細(xì)菌的生長提供碳源，另一方面為微生物生長提供能源。本研究養(yǎng)水機池塘淀粉酶活性最大，說明養(yǎng)水機池塘沉積物有機碳分解強度較大。這與每月采樣時間有關(guān)，每月采樣時間均為池塘納水半個月后，此時供細(xì)菌生長的有機氮、有機磷已很少，養(yǎng)水機池塘較其他兩種水質(zhì)調(diào)控方式池塘產(chǎn)生大量細(xì)菌及真菌[7,25]，為供其生存，需消耗淀粉獲得能量，導(dǎo)致養(yǎng)水機池塘淀粉酶活性最高。

本試驗從酶的角度探究了3種水質(zhì)調(diào)控方式下，池塘沉積物中酶的活性變化情況，研究可知養(yǎng)水機池塘由于打破上下層水體交換，使上層水中的溶氧輸入下層水，使沉積物中有機質(zhì)輸入上層水中，加快了有機質(zhì)的降解效率，致使進(jìn)水一段時間后，蛋白酶和堿性磷酸酶活性降低，在本試驗條件下，養(yǎng)水機比自然池塘和微孔曝氣池塘更加快速的降解了含氮、含磷有機質(zhì)，目前養(yǎng)水機的使用功率比微孔曝氣在去除有機質(zhì)方面更加有效，但這種功率是否為最佳，有待于進(jìn)一步研究。

3.2 池塘沉積物酶活性與其他環(huán)境因子的關(guān)系

沉積物酶活性與沉積物的理化因子、生物因子密切相關(guān)，本研究測定的3種水質(zhì)調(diào)控方式池塘沉積物中淀粉酶、蛋白酶、堿性磷酸酶及脫氫酶含量均不同，可能與3種水質(zhì)調(diào)控方式下沉積物中微生物組成不同有關(guān)[26]。

值得注意的是,養(yǎng)水機池塘脫氫酶活性與蛋白酶活性呈正相關(guān)，說明養(yǎng)水機池塘決定微生物活性強度的是氮，而微孔曝氣池塘決定微生物活性的卻是磷，因此，為加強養(yǎng)水機池塘微生物活性，是否可在水中加有機氮，有待于進(jìn)一步研究。

一般在底物含量充足及其他環(huán)境適合的條件下，在一定溫度范圍內(nèi)，酶活性隨溫度的升高而升高，本研究淀粉酶、堿性磷酸酶與此情況相一致(表2)，而蛋白酶卻具有隨溫度升高而呈下降的趨勢，這可能是因為蛋白酶底物是有機氮，而各池塘有機氮含量隨溫度升高而下降，因此蛋白酶呈現(xiàn)出夏季低冬季高的特點。自然納潮池塘的脫氫酶活性在溫度較低的11月和3月較高，而養(yǎng)水機池塘脫氫酶活性在溫度最低的1月較高，而不是在溫度較高的7—8月較高，這兩類池塘的脫氫酶活性均與池塘總氮呈正相關(guān)，而微孔曝氣池塘脫氫酶活性卻在溫度較高的6、8月較高，這種現(xiàn)象值得進(jìn)一步試驗，以了解這些酶發(fā)生變化的機制。此外，養(yǎng)水機和微孔曝氣池塘中脫氫酶活性在3、10、11月，堿性磷酸酶活性在5、8、10、11月，蛋白酶活性在5、6、11月均顯著低于自然納潮池塘，雖然周年沉積物酶活性與水中的氨氮、亞硝態(tài)氮含量相關(guān)性不顯著，但在上述時間段沉積物中酶的含量與水中的氨氮、亞硝態(tài)氮含量一致[27]，養(yǎng)水機池塘中酶活性、氨氮、亞硝態(tài)氮含量最低，自然納潮池塘中最高，這段時間正是海參復(fù)蘇，大量進(jìn)食階段，養(yǎng)水機池塘氨氮和亞硝態(tài)氮低含量均有利于海參的生長。