吡非尼酮對(duì)L-精氨酸誘導(dǎo)的急性胰腺炎小鼠的治療作用研究

史曉賢 李高文

急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是一種胰腺的炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為急性上腹痛、惡心、嘔吐、發(fā)熱等，嚴(yán)重者可伴有胰腺出血壞死、感染、休克等全身并發(fā)癥，發(fā)病率和病死率逐年升高[1]。AP的病因?qū)W和病理生理學(xué)尚不明確，因而也缺乏有效的治療策略，細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)在AP發(fā)病中起重要作用，其中白細(xì)胞介素（IL）升高和核因子-κβ（NF-κβ）激活被認(rèn)為是 AP 發(fā)展的關(guān)鍵事件[2]。吡非尼酮（pirfenidone，PFD）是一種合成的吡啶酮衍生物，可抑制多種炎性因子合成與分泌、減少脂質(zhì)過氧化，具有抗炎、抗氧化和抗纖維化作用[3]。本研究采用L-精氨酸誘導(dǎo)AP小鼠模型，觀察PFD對(duì)AP小鼠氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡的影響，探討其可能的治療作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性C57BL/6小鼠32只，體重20～25g，鼠齡4～6周，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2016-0006]；小鼠在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下自由飲水和標(biāo)準(zhǔn)飲食，自適應(yīng)飼養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑和儀器 L-精氨酸粉末（25g，批號(hào)：1725413）、羧甲基纖維素（CMC，批號(hào)：419338）均購(gòu)自美國(guó) Sigma Aldrich公司，PFD粉劑（批號(hào)：53179-13-8）購(gòu)自美國(guó) Selleck公司，核因子-κβ（NF-κβ）p65 多克隆抗體（ab16502）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（ab205718）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，ApopTag過氧化物酶原位凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（2016206）、蘇木素-伊紅（HE）染液（2016006）、RIPA 裂解液（2016062）、SDS-PAGE 電泳緩沖液（2016070）、聚偏氟乙烯（PVDF）和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)試劑盒（2016028）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，髓過氧化物酶（MPO）抗體（A0398）購(gòu)自丹麥Dako公司，二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（23227）購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，4-羥基壬烯醛（4-HNE）抗體（198960）、GAPDH（AF5718）均購(gòu)自美國(guó) R&D Systems公司，全自動(dòng)生化分析儀（日立7600-020）購(gòu)自日本Hitachi公司，光學(xué)顯微鏡（Olympus BX-50）購(gòu)自日本Olympus公司。

1.3 藥物制備 將L-精氨酸粉末溶解在0.9%氯化鈉溶液中，濃度為20%，并調(diào)節(jié)pH至7。PFD粉劑懸浮在0.5%的羧甲基纖維素（CMC）中。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及樣品收集 將32只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、PFD低和高劑量組4組，每組8只。造模前禁食12h，不禁水。模型組、PFD低和高劑量組小鼠腹腔注射L-精氨酸溶液（4g/kg）2次（間隔1h）誘導(dǎo)AP模型[4]，對(duì)照組以等體積0.9%氯化鈉溶液代替。PFD低和高劑量組小鼠在造模后1、3、6h分別給予200、300mg/kg的PFD溶液灌胃[5]，對(duì)照組和模型組灌胃高劑量組等體積的CMC溶液。

小鼠造模24h后使用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉，并通過頸脫法處死。迅速移除胰腺并與周圍的淋巴結(jié)和脂肪分離。將胰腺組織樣品分成2份，第1部分固定在10%甲醛溶液中，用于NF-κβ、MPO和細(xì)胞凋亡的組織學(xué)評(píng)估和免疫組織化學(xué)研究。將第2部分置于液氮中并儲(chǔ)存在-80℃直至采用Western blot法進(jìn)一步檢測(cè)4-HNE的表達(dá)水平。通過心臟穿刺獲得血液樣品并使其在25℃下凝結(jié)30 min，在4℃下3 000r/min離心10min，獲得血清樣品并儲(chǔ)存在-80℃直至淀粉酶分析。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清淀粉酶水平。

1.5 胰腺病理檢查 將10%甲醛溶液固定的胰腺組織樣品，行石蠟包埋、切片（4μm）、HE染色后采用光學(xué)顯微鏡觀察組織學(xué)改變。根據(jù)Spormann等[6]的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定AP的嚴(yán)重程度，基于水腫（1、2和3分）、炎細(xì)胞浸潤(rùn)（1、2和 3分）、脂肪壞死（3、5和 7分）和實(shí)質(zhì)壞死（3、5和7分）4個(gè)組織學(xué)表現(xiàn)情況進(jìn)行評(píng)分，總分20分，評(píng)分越高AP越嚴(yán)重。

1.6 凋亡腺泡細(xì)胞百分比測(cè)定 使用ApopTag過氧化物酶原位凋亡檢測(cè)試劑盒通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）方法測(cè)定凋亡腺泡細(xì)胞的百分比。同時(shí)采用Image 6.0軟件計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)（以細(xì)胞核深褐色為定義），并以陽性細(xì)胞百分比（陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）表示。

1.7 NF-κβ因子表達(dá)測(cè)定 采用免疫組織化學(xué)法。胰腺組織樣品固定在10%甲醛溶液中24h后，石蠟包埋，切成4μm的厚度，二甲苯和乙醇脫羧10min，檸檬酸緩沖液pH 6.0在微波中13min以提取抗原，與3%過氧化氫（H2O2）一起溫育5min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，并滴加3%正常馬血清20min以阻斷非特異性結(jié)合，磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌，滴加NF-κβ p65多克隆抗體（1∶150）在 4℃溫育過夜，用 PBS洗滌，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗一起溫育30min。DAB顯色，HE復(fù)染。在光學(xué)顯微鏡下，陽性細(xì)胞是具有深褐色染色細(xì)胞核的胰腺腺泡細(xì)胞。通過Image 6.0軟件于40×放大倍數(shù)下在10個(gè)隨機(jī)選擇的視野中計(jì)數(shù)陽性染色細(xì)胞的平均數(shù)目，并表示為陽性細(xì)胞的百分比（陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）。

1.8 MPO陽性細(xì)胞數(shù)測(cè)定 采用免疫組織化學(xué)法。福爾馬林固定、石蠟包埋、4μm切片、梯度乙醇水化，使用EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH 8.0）在微波中進(jìn)行抗原修復(fù)13min。自然冷卻后，將組織置于pH 7.4的PBS中洗滌2次，每次5min，將組織與3%H2O2溶液在室溫下在黑暗中溫育 25min，滴加一抗 MPO 抗體（1∶500）在 4℃下溫育過夜。將組織在抗山羊二抗（1∶1 000）中25℃溫育30min，HE染色。在光學(xué)顯微鏡下，陽性細(xì)胞為具有深棕色核的細(xì)胞。于40×放大倍數(shù)下，在10個(gè)隨機(jī)選擇的視野中計(jì)數(shù)MPO陽性細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果表示為每個(gè)高倍鏡視野（HPF）的陽性染色細(xì)胞的平均數(shù)。

1.9 4-HNE檢測(cè) 采用Western blot法。按照說明書上的方法，用RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)胰腺勻漿中的蛋白質(zhì)濃度。行SDSPAGE電泳，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后加入一抗 4-HNE（1∶500）、GAPDH（1∶500）4℃下溫育過夜。然后加入過氧化物酶綴合的抗小鼠IgG（1∶800）溫育1h，采用ECL進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。Image 6.0軟件測(cè)定灰度值，GAPDH作為內(nèi)參。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠血清淀粉酶水平的比較 模型組血清淀粉酶水平（3 938.50±771.55）U/L明顯高于對(duì)照組（880.35±161.98）U/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而PFD低劑量組淀粉酶水平（3 012.62±486.85）U/L和高劑量組（2 869.31±255.73）U/L均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），PFD低劑量和高劑量組淀粉酶水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 4組小鼠胰腺組織病理狀況的比較 胰腺組織病理狀況見圖1（插頁），對(duì)照組部分大鼠胰腺有很輕微的水腫，偶見少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，無出血壞死。與對(duì)照組相比，模型組大鼠胰腺組織呈廣泛凝固性壞死，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)明顯水腫，胰腺水腫、炎癥浸潤(rùn)、脂肪壞死、實(shí)質(zhì)壞死評(píng)分均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組相比，PFD低劑量和高劑量組胰腺組織壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、脂肪壞死和實(shí)質(zhì)壞死程度均減輕，胰腺水腫、炎癥浸潤(rùn)、脂肪壞死、實(shí)質(zhì)壞死評(píng)分均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

2.3 4組小鼠凋亡腺泡細(xì)胞百分比的比較 4組大鼠TUNEL染色的代表性圖像見圖2（插頁），凋亡腺泡細(xì)胞呈深棕色。模型組凋亡腺泡細(xì)胞百分比（2.72±2.64）%明顯高于對(duì)照組（0.50±0.46）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），PFD低劑量（0.46±0.13）%和高劑量組（0.37±0.08）%則均明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 4組小鼠胰腺組織病理學(xué)評(píng)分的比較

2.4 4組小鼠NF-κβ因子表達(dá)和MPO陽性細(xì)胞數(shù)的比較 模型組NF-κβ陽性細(xì)胞百分比（47.95±12.98）%明顯高于對(duì)照組（6.27±2.31）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組的NF-κβ陽性細(xì)胞百分比比較，PFD低劑量組（3.63±1.61）%和高劑量組（11.68±6.44）%均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖3（插頁）。與對(duì)照組（0.13±0.35）個(gè)/HPF相比，模型組MPO陽性細(xì)胞的數(shù)量（29.57±3.18）個(gè)/HPF明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，PFD低劑量（1.25±0.67）個(gè)/HPF和高劑量組MPO陽性細(xì)胞的數(shù)量（0.75±0.40）個(gè)/HPF均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖 4（插頁）。

2.5 4組小鼠4-HNE表達(dá)的比較 模型組4-HNE蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，而低劑量PFD組和高劑量PFD組4-HNE表達(dá)低于模型組（P＜0.05），但與對(duì)照組非常相似（圖 5、表 2）。

圖5 4組小鼠4-HNE蛋白表達(dá)的電泳圖

表2 4組小鼠4-HNE蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較

3 討論

血淀粉酶升高常被用作胰腺炎診斷的條件，本研究發(fā)現(xiàn)L-精氨酸可以誘導(dǎo)AP，這可以通過血清淀粉酶升高和胰腺組織病理學(xué)變化來證明，而低劑量和高劑量的PFD處理使血清淀粉酶降低，且小鼠中胰腺組織病理損傷有所恢復(fù)。

中性粒細(xì)胞是AP中急性炎癥發(fā)展的重要參與者，通過釋放MPO、蛋白酶和活性氧（ROS）來發(fā)揮作用[7]。在本研究中，通過測(cè)量胰腺組織中的MPO陽性來確定中性粒細(xì)胞活性。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，AP小鼠的MPO陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，但經(jīng)PFD治療后，MPO陽性細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)正常。與此一致，盡管沒有直接在AP中進(jìn)行研究，但在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠經(jīng)PFD治療后中性粒細(xì)胞水平顯著降低[8]。

NF-κβ因子激活是AP發(fā)展的關(guān)鍵事件，NF-κβ導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子及種趨化因子的產(chǎn)生，如TNF-α、IL-6和IL-8[9]。研究表明NF-κβ活性與AP的嚴(yán)重程度增加相關(guān)[10]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)在AP小鼠中NF-κβ表達(dá)增加，而低劑量和高劑量PFD治療均使其減弱，組織病理學(xué)上NF-κβ表達(dá)的變化與胰腺炎的嚴(yán)重程度相關(guān)。先前的研究表明PFD通過抑制NF-κβ的激活對(duì)急性肝炎小鼠起到有效的肝保護(hù)作用[5]。

氧化應(yīng)激是胰腺腺泡細(xì)胞損傷后引起炎癥反應(yīng)加速和多器官功能障礙的主要事件之一[11]。多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化是氧化應(yīng)激的結(jié)果，產(chǎn)生4-HNE，可作為氧化應(yīng)激的標(biāo)志物。在本研究中，模型組小鼠的4-HNE表達(dá)較對(duì)照組幾乎增加了一倍，而兩種劑量的PFD均可降低4-HNE表達(dá)的活性，這個(gè)現(xiàn)象表明了氧化應(yīng)激的改善。在肝硬化和肝炎的研究中，PFD治療減輕氧化負(fù)擔(dān)[5]。上述證據(jù)表明PFD具有抗氧化作用，可用于治療包括AP在內(nèi)的多種炎癥。此外，4-HNE等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物通過誘導(dǎo)Fas表達(dá)、p53的誘導(dǎo)、磷酸化和核轉(zhuǎn)位以及隨后的caspase3活化而參與細(xì)胞凋亡的發(fā)展[12]。胰腺腺泡細(xì)胞凋亡是AP細(xì)胞死亡的主要原因，L-精氨酸誘導(dǎo)的AP與腺泡細(xì)胞的凋亡有關(guān)[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了先前觀察結(jié)果的發(fā)現(xiàn)，即L-精氨酸誘導(dǎo)的AP小鼠的腺泡細(xì)胞凋亡程度顯著高于對(duì)照組小鼠中觀察到的程度，在低和高劑量PFD處理中，凋亡腺泡細(xì)胞下降至對(duì)照組小鼠水平。

綜上所述，PFD低、高劑量均可減輕L-精氨酸誘導(dǎo)的AP小鼠的炎癥、氧化應(yīng)激和腺泡細(xì)胞凋亡，從而減輕胰腺組織病理學(xué)改變。

圖1 4 組小鼠胰腺組織病理學(xué)的 HE 染色結(jié)果比較（箭頭表示炎癥、水腫和脂肪壞死，×40）

圖2 4組小鼠TUNEL分析腺泡細(xì)胞凋亡情況比較（箭頭表示凋亡的腺泡細(xì)胞，×40）

圖3 4組小鼠胰腺中NF-κβ因子表達(dá)的免疫組化分析比較（箭頭表示NF-κβ陽性細(xì)胞，×40）

圖4 4組小鼠胰腺中MPO陽性細(xì)胞免疫組化分析比較（箭頭表示MPO陽性細(xì)胞，×40）