不同發(fā)酵工藝對藍莓果酒品質(zhì)的影響

劉彩婷，周鴻翔

(貴州大學(xué),貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025)

2018年貴州省藍莓種植面積及產(chǎn)量達到1.5 km2和7.2萬t，占全國總量的27%和39%，躍居全國第一[1]。高附加值的藍莓果酒因其在釀造期間，隨著糖酵解EMP等的發(fā)生，糖類物質(zhì)逐漸被消耗，酒精發(fā)酵主副產(chǎn)物積累，使其逐漸形成自己的獨特風(fēng)味。MENDES-FERREIRA等[2]研究結(jié)果促進了消費者對其營養(yǎng)保健和功能特性的關(guān)注，使其在果酒市場備受青睞。BARNES等[3]鑒定出野生型高叢藍莓含25種花青素，而在藍莓酒中，花青素與糖類以糖苷鍵結(jié)合而形成花色苷，張楊等[4]研究表明藍莓果經(jīng)過發(fā)酵所得藍莓酒中仍含有豐富的花色苷，SU等[5]對藍莓花青素抗氧化活性進行的評價，使越來越多的人著手藍莓果酒的生產(chǎn)開發(fā)，但隨著發(fā)酵進行花色苷逐漸下降，多酚類化合物與蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)結(jié)合或吸附，酵母次級代謝產(chǎn)物等因素也會導(dǎo)致酒液中總酚下降[6-7]。

目前藍莓果酒多以鮮果釀造，或采用后期酒精勾兌的方法加工而成，造成生產(chǎn)受到季節(jié)限制，面臨品質(zhì)的降低和同質(zhì)化，且目前工藝優(yōu)化主要指標為酒精度。本次試驗以藍莓原汁為原料，試圖打破時間限制，并在前期所篩酵母的基礎(chǔ)上開展以接種量、發(fā)酵溫度、SO2添加量、初糖濃度為主要工藝參數(shù)的單因素試驗，通過對發(fā)酵期間還原糖變化規(guī)律及發(fā)酵結(jié)束后的殘?zhí)恰⒖傻味ㄋ?、酒精度、感官評分、花色苷、總酚、總抗氧化能力等指標的測定，初步探究其對發(fā)酵藍莓果酒的影響，并在此基礎(chǔ)上，以花色苷保存率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗，篩選出盡可能多地保留有效成分、減少活性物質(zhì)在加工環(huán)節(jié)流失的工藝參數(shù)組合，在確定可實施藍莓果酒最佳發(fā)酵工藝條件的同時，也為其營養(yǎng)保健性能的開發(fā)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

JK10酵母，煙臺帝伯仕公司；純凈水，飛龍雨實業(yè)有限公司；藍莓汁、蘋果汁，市售100%純果汁。

葡糖糖、NaOH，成都金山化學(xué)試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸溶液，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；色譜純乙醇，科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C精密酸度計，上海大普儀器有限公司；synergy H4酶標儀，BioTek美國伯騰儀器有限公司；7890A-G3440AGC氣相色譜儀，HP-INNOWAX色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國安捷倫；SB-B30002精密電子天平，盛博電子衡器有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 檢測方法

還原糖采用3,5-二硝基水楊酸法[8]；總酸參照GB/T32783-2016《藍莓酒》[9]；花色苷采用pH示差法[10-11]；總抗氧化能力采用比色法[12]；總酚采用福林酚法測[13]；酒精度：氣相色譜法[14]。

1.3.2 感官評定

以本院有品酒基礎(chǔ)的20名學(xué)生為參評人員，并對其進行市售藍莓果酒的感官辨識度進行培訓(xùn)，參照以GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[15-16]為原型的藍莓果酒感官評分標準進行百分制的感官評分，數(shù)值越大感官評價越高，評分標準如表1所示。

1.4 試驗方法

1.4.1 藍莓果酒加工工藝流程及操作要點

藍莓果酒加工工藝流程如下：

表1 藍莓果酒感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of blueberry wine

發(fā)酵液調(diào)配：以藍莓原汁為原料，蘋果汁調(diào)糖至250g/L并以純凈水稀釋；

調(diào)硫：以50 mg/L添加量用焦亞硫酸鉀調(diào)硫，4～8 h后接種酵母；

接種：干酵母JK10用量為0.34 g/L[16]，加入10倍體積的0.5%蔗糖水，30～37 ℃活化15～20 min，接種活化好的酵母種子液，適當(dāng)攪拌并增加溶氧量；

發(fā)酵：將樣品置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵，紗布封口發(fā)酵至發(fā)酵液有酒精味產(chǎn)生，或酵母活菌數(shù)約為107CFU/mL，期間適當(dāng)攪拌，以帶單向閥的硅膠塞取代紗布繼續(xù)發(fā)酵；發(fā)酵過程以還原糖為監(jiān)測指標，每天1次，當(dāng)還原糖含量≤10 g/L或檢測數(shù)據(jù)連續(xù)3次基本保持穩(wěn)定時，視作發(fā)酵終點；

過濾：發(fā)酵液使用濾膜為120目的過濾機過濾；

裝瓶：將過濾后的果酒迅速裝瓶，16℃低溫存放。

1.4.2 單因素設(shè)計

依照1.4.1進行發(fā)酵試驗并按如下單因素進行相關(guān)參數(shù)的替換。

分別以0.1、0.3、0.6、0.9、1.2 g/L的酵母接種量；19、22、25、28 ℃的發(fā)酵溫度， 190、220、250、280、310 g/L的初糖質(zhì)量濃度；0、50、100、150、200 mg/L的SO2添加量為發(fā)酵藍莓果酒主影響因子，以發(fā)酵結(jié)束的總酸、酒精度、殘?zhí)恰⒖偪寡趸芰鞍l(fā)酵前后花色苷、總酚保存率為評價指標。

1.4.3 響應(yīng)面設(shè)計

在單因素基礎(chǔ)上，確定Box-Behnken設(shè)計的自變量，以花色苷保存率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗，篩選出合適的工藝參數(shù)組合，試驗因素水平編碼設(shè)計如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析因素與水平Table 2 Factors and levels of the response surface methodology

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件進行試驗設(shè)計， 采用OriginPro 8.0、Graphpad、SPSS軟件進行作圖和數(shù)據(jù)分析，P<0.05，差異顯著，結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬合標準曲線

擬合標準曲線為：葡糖糖標曲：y=2.793x-0.041，R2=0.999 3；總酚標曲：y=1 694.6x-135.42，R2=0.998 9；乙醇標曲：峰面積=792.673 94×Amt-286.402 27，R2=0.999 5；

2.2 理化指標試驗結(jié)果

2.1.1 酵母接種量對藍莓果酒的影響

果酒發(fā)酵最主要環(huán)節(jié)是在酵母作用下，EMP酵解生成丙酮酸，并在無氧條件下經(jīng)脫羧酶脫羧生成乙醛，再由乙醛脫氫酶還原成乙醇的過程[17]，故酵母添加量影響著發(fā)酵周期和發(fā)酵進程。當(dāng)酵母添加量過多，酵母大量繁殖，一方面自身養(yǎng)分需求消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致生成酒精底物減少，酒精產(chǎn)量降低；另一方面，代謝的大量副產(chǎn)物影響發(fā)酵過程，增強“酵母”味，并且還會存在過量添加導(dǎo)致發(fā)酵提前終止不利風(fēng)味物質(zhì)形成的風(fēng)險。酵母添加量過少，一方面無法保證酒精積累、殘?zhí)橇窟^高；另一方面較長發(fā)酵遲滯期使發(fā)酵周期延長，增加雜菌污染機率；因此適合的酵母添加量直接影響成品酒質(zhì)量。

由圖1可知，發(fā)酵液前期， 0.1 g/L接種量出現(xiàn)起酵慢且下降緩慢現(xiàn)象，導(dǎo)致發(fā)酵周期拉長；發(fā)酵后期，糖的消耗速度逐漸減緩，最終出現(xiàn)接種量和發(fā)酵周期負相關(guān)結(jié)果；由表3可知，0.3 g/L接種量的酒精度僅低于0.6 g/L，因此前者酵母利用率更好，殘?zhí)橇考翱偹嵋沧畹?；由圖2可知，隨著酵母接種量增多花色苷保存率逐漸下降，這也與BOIDO等[18]提出的釀酒酵母細胞壁能夠吸附降低果酒單體花青素含量、嚴紅光[19]發(fā)現(xiàn)的發(fā)酵過程中細胞壁吸收的單體花青素含量可達酒體總花青素質(zhì)量的1%～3%相吻合，0.1 g/L的接種量殘?zhí)橇孔罡?，但保存率也最高，?.3 g/L接種量保存率與其差異不顯著；抗氧化能力、總酚保存率與接種量大致呈負相關(guān)，與ESCVDERO-PEZ等[20]報道的酵母后期產(chǎn)生大量次級代謝產(chǎn)物，其多酚類化合物與蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)結(jié)合或吸附，使致酒液中總酚下降的研究結(jié)果一致，另外，花青素、總酚等多酚物質(zhì)不穩(wěn)定，隨著發(fā)酵時間的推移，逐漸分解、失去原有特性，也解釋了本次試驗保存率與發(fā)酵周期呈現(xiàn)的負相關(guān)；就表4也可以看出，酵母添加量越多其色澤分值也相對降低，綜合認為本次試驗0.3g/L接種量最適。

圖1 發(fā)酵過程降糖進程Fig.1 The process of reducing sugar content during fermentation

表3 酵母接種量對藍莓果酒影響-理化指標Table 3 Effects of yeast inoculation on blueberry wine-physicochemical indicators

表4 藍莓果酒感官評定結(jié)果Table 4 Results of sensory evaluation of blueberry wine

A-花色苷保存；B-總酚保存率；C-總抗氧化能力圖2 接種量對花色苷-總酚-總抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of yeast inoculation on the anthocyanins，total phenol and total antioxidant capacity注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2.2 發(fā)酵溫度對藍莓果酒的影響

溫度是影響酵母生長、繁殖與發(fā)酵的主要環(huán)境因素。溫度過高，一方面酵母迅速繁殖，細胞衰老速度加快，容易出現(xiàn)酵母過早衰老，同時也會造成果香揮發(fā)，氧化損失加大[21]；另一方面酵母生化反應(yīng)屬于放熱反應(yīng)，產(chǎn)生的大量熱量及CO2未及時釋放，引起高級醇、揮發(fā)酸、醛類等副產(chǎn)物增加。溫度過低，一方面酵母起酵慢，延遲發(fā)酵周期；另一方面，酶活也會受到一定程度影響，不利于酒精及其他香氣成分的積累[22]，降低果酒品質(zhì)。

由圖3可知，發(fā)酵初期出現(xiàn)含糖量降低又回升的現(xiàn)象，可能是由于發(fā)酵液中的蔗糖還未分解成具有還原性的糖類，因此未能檢測出而導(dǎo)致還原糖數(shù)值較低；而后，發(fā)酵液中的蔗糖、纖維素等非還原性糖通過水解生成相應(yīng)的還原性單糖，從而又被重新檢測出現(xiàn)，使還原糖含量數(shù)值有所增加。由表5可知，19℃的殘?zhí)橇枯^高，28℃的酒精度最低，此現(xiàn)象證實了發(fā)酵溫度高低對發(fā)酵結(jié)果產(chǎn)生的影響；由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度升高花色苷保存率逐漸下降，與劉小莉等[23]的研究結(jié)果相互佐證，22℃下，花色苷、總酚保存率及總抗氧化能力雖然高于25℃的，但降糖速度明顯低于25℃，被污染的可能性及工廠生產(chǎn)成本將大大提高；由表6可知，低溫下發(fā)酵酒樣感官品評中典型性分值相對較高，一方面低溫下風(fēng)味損失較小，另一方面，高殘?zhí)橇渴乖蠚埓孑^多從而典型性相對突出；考慮到酒精發(fā)酵和蘋果酸-乳酸發(fā)酵同時進行，使剩余較多的發(fā)酵糖除了被乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生蘋果酸外，還有可能形成乳酸、醋酸、甘露糖醇從而導(dǎo)致乳酸病的發(fā)生，因此綜合認為本次試驗25℃為最佳發(fā)酵條件。

2.2.3 初糖濃度對藍莓果酒的影響

初糖濃度直接決定果酒酒精度，因為糖是酒精發(fā)

圖3 發(fā)酵過程降糖進程(溫度)Fig.3 The process of reducing sugar content during fermentation(temperature)

表5 發(fā)酵溫度對藍莓果酒的影響-理化指標Table 5 Effects of temperature on blueberry wine-physicochemical indicators

表6 藍莓果酒感官評定結(jié)果Table 6 Results of sensory evaluation of blueberry wine

酵和酯類物質(zhì)的基質(zhì)原料，也是酵母存活的能源物質(zhì)[24]，因此初糖過低達不到預(yù)期酒精度，也會造成酒體過于單薄。然而，初糖濃度過高，一方面葡萄糖阻遏和葡萄糖抑制作用會抑制酵母的繁殖代謝[25]，同時高滲透壓也會導(dǎo)致現(xiàn)有酵母因細胞水分流失而活性降低，導(dǎo)致殘?zhí)橇枯^高，出現(xiàn)以膠體形式存在于酒體中的營養(yǎng)組分，因其自身高度分散的熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，而產(chǎn)生酒體渾濁和沉底的現(xiàn)象；另一方面也會因發(fā)酵繆黏度較高出現(xiàn)CO2和熱量釋放緩慢，造成醋酸菌的大量繁殖[26]，使揮發(fā)酸增加，酸化酒體。

A-花色苷保存；B-總酚保存率；C-總抗氧化能力圖4 溫度對花色苷-總酚-總抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of temperature on the anthocyanins，total phenol and total antioxidant capacity

由圖5可知，310和280 g/L的初糖在發(fā)酵過程，降糖緩慢且殘?zhí)橇枯^高，可能是高滲透壓使酵母酒精轉(zhuǎn)化能力受限，出現(xiàn)酒精度相對較低、殘?zhí)歉叩默F(xiàn)象；由表7可知，190和220 g/L的初糖，其殘?zhí)橇亢艿停瑫r發(fā)酵迅速并且發(fā)酵提前結(jié)束，導(dǎo)致糖類全部轉(zhuǎn)化成酒精，而發(fā)酵過程中產(chǎn)生香氣成分等物質(zhì)的基質(zhì)不足，造成酒體風(fēng)味寡淡的現(xiàn)象，表8中190 g/L初糖的感官分值便證明了這一觀點；另外，初糖310、280 g/L的酚類物質(zhì)含量表現(xiàn)優(yōu)異，由圖6可知，250 g/L初糖的花色苷、總酚保存率與其差異不顯著；結(jié)合酒精轉(zhuǎn)化率和成本問題，綜上，認為本次試驗250 g/L的初糖為最佳濃度。

圖5 發(fā)酵過程降糖進程Fig.5 The process of reducing sugar content during fermentation

表7 初始糖度對藍莓果酒的影響-理化指標Table 7 Effects of yeast inoculation on blueberry wine-physicochemical indicators

表8 藍莓果酒感官評定結(jié)果Table 8 Results of sensory evaluation of blueberry wine

A-花色苷保存率；B-總酚保存率；C-總抗氧化能力圖6 初糖對花色苷-總酚-總抗氧化能力的影響Fig.6 Effect of initial sugar on the anthocyanins，total phenol and total antioxidant capacity

2.2.4 SO2添加量對藍莓果酒的影響

在果酒發(fā)酵過程中，適量的SO2不僅可以抑制有害微生物生長，還可起到抗氧化、溶解護色等作用。但SO2過量，不僅會中和化合物中游離羰基導(dǎo)致發(fā)酵遲緩[27]，還會在基質(zhì)中轉(zhuǎn)化為酸，導(dǎo)致細胞中酸性可溶物質(zhì)尤其是有機酸鹽的溶解，致使發(fā)酵初期發(fā)酵液酸度升高[28]；此外，過多游離SO2還會與花色苷在C4位置結(jié)合形成新的物質(zhì)亞硫酸鹽加合物，使藍莓果酒中部分顏色消失[29]。SO2添加量不足時，一方面，不僅無法抑制雜菌生長，也無法抑制酒體中多酚氧化酶的活性，導(dǎo)致酒體氧化渾濁過早褐變[30]；另一方面，在果酒發(fā)酵不完全或陳釀時，SO2與乙醛即使在有大量分子態(tài)氧存在的條件下也無法反應(yīng)生成甘油，因此SO2的添加量對酒體風(fēng)味起著重要作用，李小惠[22]的結(jié)果也顯示SO2的添加量對金刺梨糖腌發(fā)酵酒酒精度及總酯含量有一定的影響。

由圖7可知，200和150的SO2添加量，其降糖速率相對緩慢，可能是藍莓發(fā)酵繆本身酸度較高，額外添加過多SO2反而會起到副作用，這也與李華[13]研究表明的葡萄發(fā)酵繆酸度影響著SO2添加量的結(jié)果相似；圖8中酚類物質(zhì)及總抗氧化能力與SO2添加量存在大致正相關(guān)趨勢，且該趨勢在150 mg/L至200 mg/L添加量的跨度間有所減弱；由表9可知，0 mg/L的添加量發(fā)酵徹底，但可能發(fā)酵過程產(chǎn)酸細菌未能抑制使總酸含量最高；由表10可知，50 mg/L的添加量綜合感官分值最高；而100 mg/L和50的添加量在花色苷、總酚保存率及總抗氧化能力方面差異不顯著；考慮到藍莓果酒本身酸度較高，SO2又可在基質(zhì)中轉(zhuǎn)化為酸，且促進細胞中酸性可溶物溶解的增酸機制[13]，認為本次試驗的最佳添加量為50 mg/L。

圖7 發(fā)酵過程降糖進程Fig.7 The process of reducing sugar content during fermentation

表9 SO2添加量對藍莓果酒理化指標的影響Table 9 Effects of SO2 on blueberry wine-physicochemical indicators

表10 藍莓果酒感官評定結(jié)果Table 10 Results of sensory evaluation of blueberry wine

A-花色苷保存率；B-總酚保存率；C-總抗氧化能力圖8 SO2對花色苷-總酚-總抗氧化能力的影響Fig.8 Effect of SO2 on the anthocyanins，total phenol and total antioxidant capacity

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面模型的建立及方差分析

在單因素基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，以花色苷保存率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗，篩選出合適的工藝參數(shù)組合，試驗安排及結(jié)果如表11所示。

表11 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 11 Experimental design and results of the response surface methodolog

通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗回歸模型的建立，得到藍莓果酒中花色苷保存率多元二次回歸方程：Y=61.99-6.61A+0.048B+2.29C+1.24D+1.18AB+0.74AC+0.93AD+1.12BC+2.53BD-4.68CD-3.17A2-5.39B2-0.12C2-5.77D2；由表12可知，失擬項不顯著(P=0.284 1>0.05)，花色苷保存率所選模型極顯著(P<0.01)，其中模型的一次項A、C、D對花色苷影響均為極顯著(P<0.01)；交互項BD、CD對花色苷影響均為極顯著(P<0.01)；二次項A2、B2、D2對花色苷影響均為極顯著(P<0.01)。

由表13可知，回歸方程的因變量和自變量之間的線性關(guān)系顯著(R2=0.975 6)，說明該模型可解釋97%的響應(yīng)值變化，變異系數(shù)較低(C.V=2.52%)，說明試驗重現(xiàn)性較好。得出藍莓果酒發(fā)酵最佳工藝組合：發(fā)酵溫度22.86℃，初糖濃度232.35 g/L，SO2添加量67.15 mg/L，接種量0.36 g/L，考慮到實際操作，修正為：發(fā)酵溫度23 ℃，初糖濃度230 g/L，SO2添加量67 mg/L，接種量0.36 g/L。在此條件下花色苷保存率為64.4%，驗證試驗花色苷保存率為61.1%，相對偏差2.65%，說明該模型對藍莓果酒發(fā)酵工藝中花色苷保存率做出了比較準確的預(yù)測。

表12 響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 12 ANOVA of response surface quadratic model

注：*，統(tǒng)計結(jié)果差異顯著(P<0.04)，**，統(tǒng)計結(jié)果差異極顯著(P<0.01)

表13 二次回歸方程方差分祈Table 13 Analysis of variance of the quadratic model

3 結(jié)論

通過單因素優(yōu)化試驗，及Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計， 以發(fā)酵溫度、接種量、初糖濃度及SO2添加量為自變量，花色苷保存率為響應(yīng)值，對試驗進行多元回歸擬合。結(jié)合回歸系數(shù)檢驗值F的大小可知，在所選試驗范圍內(nèi)，得出影響花色苷保存率的因素依次為：A>C>D>B；篩選出發(fā)酵溫度23℃、初糖濃度230 g/L、SO2添加量67 mg/L、接種量0.36 g/L為本次試驗最佳工藝組合，也為盡可能多地保留有效成分、減少活性物質(zhì)在加工環(huán)節(jié)的流失提供一定參考；但本次試驗局限于實驗室的初期摸索階段，工業(yè)化生產(chǎn)還需通過逐級放大試驗完成從實驗室到工業(yè)化生產(chǎn)。