適配子微流體芯片在鼻咽癌中的診斷價值研究

陳文學(xué) 李金高 萬祥輝 鄒學(xué)森 齊淑軼 胡文強(qiáng) 王春陽

鼻咽癌是我國南方常見的惡性腫瘤之一[1]。由于鼻咽癌早期癥狀不明顯，發(fā)病位置隱蔽[2]，大部分患者就診時候已經(jīng)是中晚期，中晚期鼻咽癌患者預(yù)后較差[3]。鼻咽癌常用的血清學(xué)輔助診斷方法為EB病毒相關(guān)檢測。EB病毒是與鼻咽癌發(fā)生密切相關(guān)的病毒[4]，與EB病毒相關(guān)的檢測是鼻咽癌常用的血清學(xué)檢測手段，主要包括抗EB病毒衣殼抗原免疫球蛋白A抗體(VCA-IgA、VCA-IgG 、VCA-IgM)，早期抗原抗體(EA-IgA)和EB病毒DNA[5]。CTC雖然是非常有潛力的腫瘤診斷預(yù)后標(biāo)志物[6]，但是外周血CTC數(shù)量少、檢測困難限制了其應(yīng)用。適配子是一段具有高特異性高親和力的單鏈寡核苷酸序列，通過其特殊的二級結(jié)構(gòu)可以識別相應(yīng)的靶細(xì)胞。相對于抗體，適配子具有更高的親和力、特異性、容易合成、可以進(jìn)行化學(xué)修飾，因此以適配子為基礎(chǔ)的外周血CTC分離技術(shù)逐漸被關(guān)注。

本研究探討前期制備出適配子微流體芯片對鼻咽癌的診斷價值[7]。

1 材料與方法

1.1 病例資料

2016年11月至2017年5月本院收治的鼻咽癌初治患者30例，男性18例，女性12例，中位年齡 45(28～72)歲。全部患者經(jīng)鼻咽活檢病理證實(shí)為鼻咽癌，病理類型均為低分化鱗癌，臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期。所有患者均接受鼻咽、頸部CT掃描，電子鼻咽鏡及胸部正側(cè)位片，腹部B超及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查以明確分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，若患者有骨痛癥狀則行全身骨掃描。臨床分期按UICC分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期。對照組為10例鼻咽良性疾病患者和體20例檢者，其中男性16例，女性14例，中位年齡34歲。

1.2 標(biāo)本采集

鼻咽癌患者血標(biāo)本采集2次，分別在放療前和放療結(jié)束后一周內(nèi)采集，放療前鼻咽癌患者10例采集2份全血用于重復(fù)性檢測。對照組采集血標(biāo)本1次，鼻咽良性疾病患者在治療前采血，健康體檢者體檢時候采血1次。

1.3 試劑

鏈霉親和素 (德國Merck公司)洗脫緩沖液： 4.5 g/l葡萄糖，5 mmol/l MgCl2的DPBS磷酸緩沖液。結(jié)合緩沖液：0.1 mg/ml酵母tRNA ，1 mg/ml BSA的洗滌緩沖液。捕獲緩沖液：結(jié)合緩沖液和淋巴細(xì)胞分離液以1∶1比例混合組成。

1.4 微流體芯片的制備

PDMS 微流體芯片制作由蘇州文灝芯片科技有限公司生產(chǎn)。通過光刻工藝制作SU-8模具，采用PDMS脫模工藝制作PDMS陣列 基片和蓋片，通過鍵合工藝形成封閉微流體芯片。芯片由進(jìn)樣口，反應(yīng)室，出樣口組成，反應(yīng)室內(nèi)設(shè)置叉排的微繞流柱，微繞流柱為圓形，直徑為45 μm，間距為100 μm。

1.5 CTC富集及計(jì)數(shù)

1.5.1 微流體芯片的預(yù)處理 首先用1 mg/ml 親和素在微流控芯片中作用1 min，結(jié)合緩沖液沖洗3次。30 μM生物素標(biāo)記適配子作用1 min，用結(jié)合緩沖液沖洗3次，備用。

1.5.2 CTC富集及計(jì)數(shù) 用微泵將全血標(biāo)本輸送到微流體芯片反應(yīng)室，為了避免全血的性狀改變，全血腫瘤細(xì)胞分離過程中沒有加入緩沖液。為防止細(xì)胞在泵入過程中濃度不均一，在全血中放入微型磁力攪拌棒，全血細(xì)胞在進(jìn)入過程中不會下沉且保持濃度均一。微泵泵入全血到微流體芯片反應(yīng)室內(nèi)，結(jié)合緩沖液沖洗3次，洗脫緩沖液洗脫，熒光顯微鏡觀察捕獲細(xì)胞的數(shù)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20軟件進(jìn)行分析。適配子微流體芯片的敏感性、特異性用ROC曲線分析，重復(fù)性用，CTC和臨床分期一致性用Kappa 檢驗(yàn)，鼻咽癌患者治療前外周血CTC數(shù)目與治療后和對照組比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CTC在鼻咽癌患者及對照組中的表達(dá)水平

鼻咽癌患者治療前后及對照組外周血CTC計(jì)數(shù)見圖1。同一時間取2管檢測的患者CTC取2管的平均值。鼻咽癌患者放療前CTC中位數(shù)是18.5，放療后是7.5，鼻咽良性疾病患者CTC中位數(shù)是7，健康志愿者3 。將CTC分為高、中、低3組，低值組為0～10，中值組為11～30，高值組為>30。鼻咽癌患者組放療前76.67%樣本在中、高值組，經(jīng)過放療后下降到23.33%。健康對照組0%在中、高值組。將鼻咽癌患者組、良性疾病組、健康組外周血CTC計(jì)數(shù)見圖2，健康對照組與鼻咽良性疾病組比較無顯著性差異(P>0.05),鼻咽癌組與對照組(健康對照和鼻咽良性疾病組)比較有顯著性差異(P<0.05)，鼻咽癌組外周血平均CTC細(xì)胞數(shù)高于對照組。

圖1 鼻咽癌患者治療前后及對照組外周血CTC計(jì)數(shù)

圖2 鼻咽癌患者與對照組外周血CTC計(jì)數(shù)

2.2 適配子微流體芯片檢測的重復(fù)性

10例鼻咽癌治療前的患者同時取2管外周血進(jìn)行檢測，評估適配子微流體檢測的重復(fù)性(圖3)，將檢測結(jié)果按高值、中值、低值進(jìn)行分組，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示兩管檢測結(jié)果具有高度一致性。

2.3 適配子微流體芯片檢測的診斷價值

用ROC曲線評價適配子微流體芯片對鼻咽癌的診斷價值，圖4為30例鼻咽癌患者，10例鼻咽良性疾病，20例健康對照的ROC曲線，曲線下面積為0.88(95%CI：0.80～0.96)，外周血CTC的cut-off值為9.5時，敏感性77%(95%CI：0.57～0.89)，特異性86%(95%CI：0.68～0.95)，陽性預(yù)測值為0.85(95%CI ：0.65～0.95)，陰性預(yù)測值為0.78(95%CI：0.61～0.90)。

圖3 適配子微流體芯片重復(fù)性檢測

圖4 適配子微流體芯片對鼻咽癌的診斷價值

2.4 CTC與患者臨床分期相關(guān)性

30例鼻咽癌初診患者放療前后分別檢測外周血CTC數(shù)目，分析外周血CTC數(shù)目與鼻咽癌臨床分期的相關(guān)性。表1顯示了鼻咽癌患者臨床分期與治療前后CTC數(shù)目，鼻咽癌患者治療前外周血CTC數(shù)目與鼻咽癌臨床分期具有較好的一致性，κ值為0.73，治療后CTC數(shù)目與臨床分期沒有一致性。

3 討論

隨著腫瘤液態(tài)活檢的興起，以循環(huán)腫瘤細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤液態(tài)活檢得到廣泛的研究。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞液態(tài)活檢技術(shù)作為非侵入性檢測手段，具有獲取血液標(biāo)本方便，可以追蹤腫瘤發(fā)展。目前CTC富集的方法主要有免疫捕獲法、過濾法、密度梯度離心法等[8-9]，但是這些方法存在獲取CTC純度不高，CTC回收率低、耗時等缺點(diǎn)。最近研究顯示適配子微流體富集技術(shù)可以有效富集外周血CTC。與其他富集技術(shù)相比適配子微流體富集技術(shù)具有以下特點(diǎn)①以核酸為基礎(chǔ)的捕獲技術(shù)②可以分離純化腫瘤細(xì)胞并保持細(xì)胞活性③捕獲效率高。本研究用適配子微流體技術(shù)對鼻咽癌外周血CTC進(jìn)行分析，評價適配子微流體技術(shù)檢測鼻咽癌外周血CTC對鼻咽癌的診斷價值。

由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞研究的技術(shù)手段限制，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集率低，因此這項(xiàng)檢測技術(shù)只用于腫瘤治療療效判斷和預(yù)后評估。隨著近年微流體技術(shù)、芯片技術(shù)、納米技術(shù)的發(fā)展，外周血CTC細(xì)胞的捕獲效率明顯提高，也出現(xiàn)了一些外周血CTC用于早期診斷與腫瘤篩查的報道。外周血CTC富集方法不同，在不同的腫瘤中甚至在同一腫瘤中CTC在外周血中的檢出率也存在一定的差異。CellSearch system(CSS)是經(jīng)過美國FDA認(rèn)證的用于臨床檢測CTC的技術(shù)，Bai[10]比較CellSearch system (CSS) 和isolation by size of epithelial tumor cells (ISET)兩種方法對腎癌外周血CTC的檢出率，CSS 的檢出率是19.4%(7/36) ，ISET 的檢出率是36.1%(13/36) 。Jaeger[11]對早期乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，通過CellSearch system對早期乳腺癌外周血CTC的檢出率為40.2%(258/642).Liu[12]用自己設(shè)計(jì)的芯片檢測乳腺癌外周血CTC，20例乳腺癌患者陽性率65%(13/20)，Xue[13]用多種標(biāo)志物定量pcr平臺檢測乳腺癌患者外周血CTC，陽性率為55%(92/165)。Zhang[14]用免疫磁珠聯(lián)RT-PCR檢測卵巢癌外周血CTC，109例患者外周血CTC檢出的 陽性率為90%(98/109)。Li[15]聯(lián)合CD45陰性富集和FISH技術(shù)檢測外周血CTC，對于臨床Ⅰ期患者，肺癌陽性率64.15%,胃癌陽性率83.33%,乳腺癌陽性率78.95% ，食管癌陽性率68.18%。Qian[16]用濾膜微流體芯片富集肺癌患者外周血CTC,陽性率為86%。本研究通過適配子微流體裝置捕獲鼻咽癌外周血CTC，鼻咽癌患者外周血CTC高于對照組(健康對照組合鼻咽良性疾病組)，鼻咽癌患者CTC檢測的敏感性為77%,特異性為86%。適配子微流體裝置的外周血CTC的檢出率高于早期的檢測方法，與近年來的改進(jìn)的方法檢出率相似，可以實(shí)現(xiàn)對鼻咽癌的診斷。

適配子微流體裝置檢測外周血CTC具有很好的重復(fù)性，鼻咽癌患者組放療前76.67%樣本在中、高值組，經(jīng)過放療后下降到23.33%，這與預(yù)期的放療療效一致。放療后鼻咽癌患者的外周血CTC數(shù)目可以反映患者的療效。

本研究還對鼻咽癌放療前后外周血CTC數(shù)目與患者臨床分期進(jìn)行了分析。數(shù)據(jù)顯示鼻咽癌放療前外周血CTC數(shù)目與鼻咽癌患者的臨床分期有顯著的相關(guān)性(κ=0.73)，與目前的一些研究報道治療前外周血CTC數(shù)目與臨床分期或病理分期有相關(guān)性的結(jié)果相符。放療后鼻咽癌外周血CTC數(shù)目與鼻咽癌患者的臨床分期無相關(guān)性。因此鼻咽癌放療前后外周血CTC數(shù)目可以作為輔助鼻咽癌患者臨床分期的依據(jù)。

表1 外周血CTC數(shù)目與鼻咽癌臨床分期的關(guān)系(例，%)

適配子微流體裝置檢測鼻咽癌外周血CTC數(shù)目對診斷鼻咽癌有較好的敏感性和特異性，同時可以反映鼻咽癌患者的放療療效。