構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒小向?qū)NA 表達(dá)載體用于小鼠T 細(xì)胞基因 功能研究

趙艷娜，邱 榮，沈 南，唐元家

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕病科，上海市風(fēng)濕病學(xué)研究所，上海 200125；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)上海營(yíng)養(yǎng)與健康研究所，上海 200031

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)作為一個(gè)強(qiáng)大的基因組編輯工具，最早發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌和古細(xì)菌中。它是細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期不斷進(jìn)化的過(guò)程中產(chǎn)生的適應(yīng)性免疫防御機(jī)制，用以保護(hù)自身的基因組免受外源核酸（如噬菌體、病毒等）的干擾和破壞[1]。CRISPR-Cas9 系統(tǒng)主要由2 個(gè)部分組成：一是CRISPR 相關(guān)核酸酶，目前基因編輯系統(tǒng)中用到的主要是Cas9 核酸酶；二是小向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA），含有20 nt 能夠與靶基因組互補(bǔ)的序列[2-3]。 Cas9 核酸內(nèi)切酶可以在sgRNA 的引導(dǎo)下對(duì)靶基因組DNA 進(jìn)行切割，導(dǎo)致DNA 雙鏈斷裂[4]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中由CRISPR/Cas9 系統(tǒng)引起的雙鏈斷裂主要通過(guò)易錯(cuò)的非同源末端連接（non-homologous end joining）機(jī)制修復(fù)，往往導(dǎo)致基因突變和功能喪失[5-6]，因此被廣泛應(yīng)用于各種疾病治療、基因功能鑒定、動(dòng)物模型建立以及藥物研發(fā)[6]。然而，如何有效遞送CRISPR/Cas9 系統(tǒng)至目標(biāo)細(xì)胞及靶器官仍是該技術(shù)面臨的主要挑戰(zhàn)之一。

輔助性CD4 T 細(xì)胞在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。在免疫應(yīng)答過(guò)程中，初始CD4 T 細(xì)胞受到刺激后會(huì)分化成不同的效應(yīng)T 細(xì)胞亞群，包括輔助性T 細(xì)胞1（T helper cell 1，Th1）、輔助性T 細(xì)胞2（T helper cell 2，Th2）、輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17） 和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Regulatory T cells，Treg）[7]。不同的效應(yīng)T 細(xì)胞亞群在免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮著不同的功能。例如，Th17及其分泌的效應(yīng)細(xì)胞因子在宿主對(duì)抗各種感染（尤其是細(xì)胞外細(xì)菌感染）以及多種自身免疫疾病中發(fā)揮了重要作用[8]。Treg 細(xì)胞可以分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β） 和 白 介 素-10（interleukin 10，IL-10）等抑制性細(xì)胞因子，不僅可以控制免疫耐受和免疫反應(yīng)強(qiáng)度，而且在避免組織炎癥損傷方面發(fā)揮重要作用[9]。因此，研究輔助性T 細(xì)胞的分化發(fā)育及其分子調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要。

目前，CRISPR/Cas9 技術(shù)的發(fā)展，使得對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)?；蜓芯砍蔀榭赡堋Ｈ鏢hifrut 等[10]利用慢病毒sgRNA 文庫(kù)和Cas9 蛋白，進(jìn)行全基因組篩選影響人類T 細(xì)胞免疫反應(yīng)的調(diào)控分子。但目前現(xiàn)有的CRISPR/Cas9文庫(kù)大多基于慢病毒表達(dá)載體，很難感染小鼠T 細(xì)胞。因此，建立適合小鼠T 細(xì)胞基因功能研究的高通量篩選系統(tǒng)是亟待解決的問(wèn)題。本研究構(gòu)建了sgRNA 反轉(zhuǎn)錄病毒載體，結(jié)合Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠，研究影響Th17 分化的調(diào)控分子，為小鼠T 細(xì)胞功能研究提供工具。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Rosa26-LSL-Cas9（024857）和CD4-Cre（022071）小鼠購(gòu)自美國(guó)杰克森實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院SPF 級(jí)動(dòng)物房[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2018-0002，使用許可證號(hào)SYXK（滬）2019-0001]，飼養(yǎng)溫度22 ～25 ℃，空氣相對(duì)濕度40%～60%。實(shí)驗(yàn)獲中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)為201903H486）。

1.1.2 主要試劑 抗小鼠IL17A 抗體（PE anti-mouse IL-17A antibody，TC11-18H10.1；BioLegend，美國(guó)）；抗小鼠CD3e 抗體（145-2C11）、抗小鼠CD28 抗體（37.51）、抗小鼠γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）抗體（XMG1.2）、抗小鼠IL-4 抗體（11-B11；eBioscience，美國(guó)）；細(xì)胞固定/破膜試劑盒（BD Cytofix/Cytoperm ? Kit；BD Biosciences，美國(guó)），小鼠CD4 T 細(xì)胞分選試劑盒（Miltenyi，德國(guó)）；Xho1 內(nèi)切酶、Sal1 內(nèi)切酶、Taq DNA 聚合酶、NEBuider HiFi DNA Assembly Master Mix（NEB，美國(guó)）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、DMEM 培養(yǎng)基、Opti-MEM 無(wú)血清培養(yǎng)基、RPM 1640、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS；Gibco，美 國(guó)）；TGF-β1、IL-6（R&D， 美 國(guó)）；Lipo2000（Thermo Fisher Scientific， 美國(guó)），QIAamp DNA Mini Kit （Qiagen，中國(guó)）。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific， 美 國(guó)），Centrifuge 5417R 低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），DNA Thermal Cycler 9700 PCR 儀（Applied Biosystems；Thermo Scientific， 美國(guó)），凝膠圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad 3000，中國(guó)），普通光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本），熒光顯微鏡（ZEISS，德 國(guó)），CytoFLEX LX 流 式 細(xì) 胞 儀（Beckman Coulter， 美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建sgRNA 反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體 利用內(nèi)切酶Xho1 和Sal1 雙酶切MSCV-LTR-miR30-PIG（LMP）反轉(zhuǎn)錄病毒載體，回收大片段得到反轉(zhuǎn)錄病毒載體骨架。以慢病毒載體pKLV-U6-sgRNA 為模版設(shè)計(jì)PCR 引物，引物序列如表1。利用NEBuider HiFi DNA Assembly Master Mix將U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP 片段組裝進(jìn)反轉(zhuǎn)錄病毒載體骨架。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化，挑克隆，測(cè)序得到正確載體。

表1 U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP 片段的PCR 引物序列Tab 1 Primer sequences for U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP PCR

1.2.2 sgRNA 設(shè)計(jì)和重組反轉(zhuǎn)錄病毒包裝 MIT CRISPR（http://crisp.mit.edu）網(wǎng)站設(shè)計(jì)sgRNA 序列，設(shè)計(jì)好的sgRNA 序列交由蘇州金唯智生物科技公司合成。用Plat-E包裝細(xì)胞產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒，使用Lipo2000 進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。以10 cm 培養(yǎng)皿為例，500 μLOpti-MEM 無(wú)血清培養(yǎng)基中加入20 μg sgRNA 反轉(zhuǎn)錄病毒載體；另取500 μL Opti-MEM 加入40 μL Lipo2000，將前2 步所得混合液混勻。室溫放置15 min 后，加入培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染6 h 后細(xì)胞換液，48 h 后收集上清（病毒），0.45 μm 細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾后凍存于-80 ℃冰箱中，備用。

1.2.3 T7E1 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證sgRNA 編輯效果 使用DNA 提取試劑盒提取細(xì)胞基因組DNA，Taq DNA 聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在Il17a sgRNA 靶向區(qū)域上下游設(shè)計(jì)引物，PCR 產(chǎn)物純化，取200 ng DNA 按照T7E1 實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。加入1 μL T7 核酸內(nèi)切酶，37 ℃反應(yīng)30 min，加入乙二胺四乙酸終止反應(yīng)。產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行凝膠電泳。T7E1 引物見(jiàn)表2。

表2 T7E1 PCR 引物序列Tab 2 Primer sequences for T7E1

1.2.4 分離Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠CD4 T 細(xì)胞 分離Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟細(xì)胞，裂解紅細(xì)胞。按照小鼠CD4 T 細(xì)胞分選試劑盒說(shuō)明書(shū)分離小鼠初始CD4 T 細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞純度（95%以上），進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 CD4 T 細(xì)胞體外激活培養(yǎng) CD3 和CD28 抗體包被在96 孔板，按照5 μg/mL 的終濃度加入抗小鼠CD3e抗體（145-2C11）和抗小鼠CD28 抗體（37.51），100 μL/孔包被96 孔板，并于4 ℃過(guò)夜。吸掉抗體懸液，加入200 μL 封閉液（PBS+ 1% FBS），于室溫封閉30 min，封閉結(jié)束加入200 μL PBS 洗滌2 次。分離得到CD4 T 細(xì)胞，按照細(xì)胞濃度1×106/mL 重懸。每孔加入200 μL 細(xì)胞，放入37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.6 反轉(zhuǎn)錄病毒感染和小鼠Th17 細(xì)胞誘導(dǎo)分化 小鼠CD4 T 細(xì)胞激活24 h 后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄病毒的感染。以96孔板為例，準(zhǔn)備病毒和聚凝胺（polybrene，5 μg/mL）的混合液并吸取培養(yǎng)基上清液，加入病毒和polybrene 混合液；32 ℃、1 000 mL 離心90 min。離心結(jié)束后，棄去病毒上清液，加入Th17 分化培養(yǎng)基。Th17 分化培養(yǎng)基為1640 完全培養(yǎng)基并添加相應(yīng)細(xì)胞因子（mTGF-β1 1 ng/mL，mIL-6 10 ng/mL，抗小鼠IFN-γ 抗體10 μg/mL，抗小鼠IL-4 抗體10 μg/mL）。體外誘導(dǎo)3 d，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.7 細(xì)胞因子刺激和檢測(cè) 小鼠Th17 細(xì)胞體外分化3 d 后，檢測(cè)細(xì)胞因子Il17A 表達(dá)水平。收集細(xì)胞前，用50 ng/mL 佛波酯、500 ng/mL 離子霉素和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑刺激4 h。收集細(xì)胞，用BD 細(xì)胞因子染色試劑盒進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。使用FlowJo 軟件（Becton Dickinson 10.0.7）進(jìn)行流式數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過(guò)非配對(duì)t 檢驗(yàn) ，統(tǒng)計(jì)分析NC-sgRNA、Il17a-sgRNA、Irf4-sgRNA、Rorc-sgRNA 組sgRNA+Il17a+/sgRNA-Il17a+的數(shù)值。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA 表達(dá)載體

為了建立用于小鼠T 細(xì)胞基因功能研究的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA 表達(dá)載體：用Xho1 和Sal1 雙酶切反轉(zhuǎn)錄病毒載體LMP，通過(guò)膠回收得到反轉(zhuǎn)錄病毒載體骨架；以慢病毒載體pKLV-U6-sgRNA為模版，通過(guò)PCR 擴(kuò)增獲得U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP 片段。利用同源重組將U6-sgRNA-PGK-Puro-BFP 片段組裝進(jìn)反轉(zhuǎn)錄病毒載體骨架得到反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA 表達(dá)載體。在該載體中，U6 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA 表達(dá)，而PGK 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)嘌呤霉素抗性基因（puromycin，Puro）和藍(lán)色熒光蛋白（blue fluorescent protein，BFP）表達(dá)（圖1）。

2.2 表達(dá)sgRNA 反轉(zhuǎn)錄病毒包裝和細(xì)胞感染

為了驗(yàn)證新構(gòu)建的載體是否可以產(chǎn)生具有感染性的病毒顆粒，實(shí)驗(yàn)對(duì)載體進(jìn)行病毒包裝和細(xì)胞感染，結(jié)果見(jiàn)圖2。 病毒包裝細(xì)胞為Plat-E 細(xì)胞，只需要轉(zhuǎn)染反轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒即可。轉(zhuǎn)染24 h 后，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞形態(tài)正常。轉(zhuǎn)染48 h 后，熒光顯微鏡下觀察到BFP的成功表達(dá)。為了驗(yàn)證反轉(zhuǎn)錄病毒是否具有感染活性，實(shí)驗(yàn)用產(chǎn)生的反轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)NIH3T3 細(xì)胞進(jìn)行感染。病毒感染48 h 后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)BFP 陽(yáng)性細(xì)胞的情況，結(jié)果顯示BFP 陽(yáng)性細(xì)胞比例為54.1%，說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA 表達(dá)載體構(gòu)建成功并可產(chǎn)生有感染性的病毒顆粒，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA 表達(dá)載體構(gòu)建策略Fig 1 Construction strategy of retroviral sgRNA expression vector

圖2 反轉(zhuǎn)錄病毒包裝和NIH3T3 細(xì)胞感染Fig 2 Retrovirus packaging and NIH3T3 cell infection

2.3 小鼠Th17 細(xì)胞體外分化系統(tǒng)建立

為了將CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應(yīng)用于小鼠Th17 細(xì)胞分化研究，實(shí)驗(yàn)首先建立了Th17 細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化系統(tǒng)。利用小鼠CD4 T 細(xì)胞分選試劑盒分離Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠初始CD4 T 細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)胞純度在95% 以上（圖3）。CD4 T 細(xì)胞鋪孔，觀察發(fā)現(xiàn)最先分離得到的小鼠CD4 T 細(xì)胞體積較小，呈圓形。經(jīng)過(guò)3 d 體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后，細(xì)胞數(shù)目明顯變多，形態(tài)逐漸變成橢圓形或者條形。結(jié)果說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)成功分離小鼠CD4 T 細(xì)胞并可以進(jìn)行體外培養(yǎng)，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 小鼠Th17 細(xì)胞分化過(guò)程中的形態(tài)變化Fig 3 Morphological changes of mouse Th17 cells during differentiation

2.4 小鼠Th17 細(xì)胞中基因敲除

Th17 主要分泌Il17a 和Il17f 等促炎癥細(xì)胞因子，在自身免疫病發(fā)病中發(fā)揮作用，而Th17 的分化受到很多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如Irf4、Rorc、Batf 等。為了驗(yàn)證系統(tǒng)是否能用于基因敲除以及Th17 分化調(diào)控研究。實(shí)驗(yàn)分別設(shè)計(jì)了靶向Il17a、Irf4、Rorc，以及NC 的sgRNA，并進(jìn)行克隆和病毒包裝。分離Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠初始CD4 T 細(xì)胞，經(jīng)過(guò)CD3/28 抗體刺激24 h 后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄病毒感染。感染完成后，加入Th17 細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化3 d，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17 細(xì)胞內(nèi)Il17a 表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NC-sgRNA組中Il17a 陽(yáng)性細(xì)胞在sgRNA+和sgRNA-2 個(gè)群體中的比例大致相等。而在Il17a-sgRNA 組中，Il17a 陽(yáng)性細(xì)胞在sgRNA+群體較sgRNA-群體中的比例明顯降低。結(jié)果說(shuō)明在Il17a 孔中，sgRNA+群體Il17a 基因被成功敲除。同樣 在Rorc 和Irf4 組 中，2 組sgRNA+群 體 和sgRNA-群體相比，IL17a 陽(yáng)性細(xì)胞的比例明顯降低。結(jié)果說(shuō)明2 組sgRNA+群體中Rorc 和Irf4 基因被成功敲除。為了減小孔間差異對(duì)結(jié)果偏差的影響，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)了同一個(gè)孔中sgRNA+組與sgRNA-組中Il17a 陽(yáng)性細(xì)胞比例的比值，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化后的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC 組相比，Il17a、Rorc 和Irf4 組比值均顯著降低。以上結(jié)果說(shuō)明，利用該系統(tǒng)可以成功進(jìn)行基因敲除。

圖4 小鼠Th17 細(xì)胞中基因敲除Fig 4 Gene knockout in mouse Th17 cells

圖5 T7E1 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Il17a 位點(diǎn)DNA 突變Fig 5 Detecting DNA mutations of Il17a locus by T7E1

2.5 T7E1 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Il17a 位點(diǎn)DNA 突變

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Il17a 基因組DNA 是否發(fā)生突變，實(shí)驗(yàn)提取編輯后細(xì)胞基因組DNA。在Il17a-sgRNA 靶向位置上下游，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，進(jìn)行后續(xù)T7E1 實(shí)驗(yàn)。凝膠電泳結(jié)果顯示，在NC-sgRNA 組中，條帶完整未發(fā)生切割；而在Il17a-sgRNA 組中，條帶被切割成約380 bp 和180 bp 的2 個(gè)條帶，符合Il17a-sgRNA 靶向突變預(yù)期。結(jié)果表明，NC-sgRNA 組Il17a 基因未發(fā)生基因編輯；而Il17a-sgRNA 組IL17A 位點(diǎn)DNA 發(fā)生突變，Il17a 基因被敲除（圖5）。通過(guò)檢測(cè)基因組DNA 突變，進(jìn)一步證明了系統(tǒng)的有效性。

3 討論

初始CD4 T 細(xì)胞在不同細(xì)胞因子的刺激下，會(huì)分化成不同的細(xì)胞亞群，如Th1、Th2、Th17 和Treg[11]。但不同分化亞群在介導(dǎo)疾病發(fā)生中發(fā)揮著不同的作用，如Th17細(xì)胞主要在自身免疫病以及炎癥中發(fā)揮重要作用，而Treg 細(xì)胞主要維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)從而抑制自身免疫病的發(fā)生[12]。因此，研究T 細(xì)胞分化調(diào)控，有助于更好地理解自身免疫病的發(fā)病機(jī)制。

近年來(lái)，很多新技術(shù)應(yīng)用于T 細(xì)胞分化的研究。Chen等[13]建立一套基于RNA 干擾體內(nèi)篩選系統(tǒng)，用以篩選淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）感染狀態(tài)下影響抗病毒CD4 和CD8 T 細(xì)胞分化的調(diào)控分子。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的發(fā)展，使得全基因功能篩選成為可能。Shalem 等[14]建立了全基因組篩選影響人類腫瘤細(xì)胞增殖的基因。Parnas 等[15]基于慢病毒載體的全基因組sgRNA 文庫(kù)和Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了全基因組篩選，用于研究樹(shù)突狀細(xì)胞在受到細(xì)菌脂多糖刺激產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的調(diào)控分子。但是，由于Cas9 蛋白分子量大，很難包裝進(jìn)病毒載體，限制了CRISPR/Cas9 在小鼠免疫細(xì)胞中的廣泛應(yīng)用。因此，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠。只需要構(gòu)建表達(dá)sgRNA 的病毒載體即可在小鼠T 細(xì)胞中進(jìn)行基因功能研究。近年來(lái)，慢病毒載體由于能整合到宿主基因組DNA 穩(wěn)定遺傳，被廣泛應(yīng)用于sgRNA 遞送系統(tǒng)[16]。但是，慢病毒感染小鼠T 細(xì)胞效率較低，而且表達(dá)速度較慢[17]。所以實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA 表達(dá)載體用于小鼠T 細(xì)胞分化和基因功能 研究。

綜上，本研究利用反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA 表達(dá)載體和Cas9 轉(zhuǎn)基因小鼠，成功在小鼠T 細(xì)胞中進(jìn)行基因敲除，并將此系統(tǒng)應(yīng)用于Th17 細(xì)胞分化調(diào)控研究，驗(yàn)證Rorc 和Irf4 是Th17 細(xì)胞分化中的關(guān)鍵調(diào)控分子。未來(lái)可以利用該系統(tǒng)構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒sgRNA 全基因組篩選文庫(kù)通量研究小鼠T 細(xì)胞分化調(diào)控分子，以期找到新的靶點(diǎn)。

參·考·文·獻(xiàn)

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